一种快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因VIM的诊断方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌金属内酰胺酶耐药基因KJi納试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着亚胺培南等碳青酶烯类抗生素在临床上的广泛应用，细菌产生了一类能广泛水解内酰胺类抗生素的金属内酰胺酶，产该类酶的细菌对内酰胺类所有抗生素产生耐药性，给临床抗感染治疗造成极大困难，而且目前产金属内酰胺酶的铜绿假单胞菌种类和数量在不断增加，已报道的主要有/#产和KJ#两种类型。VIM型金属内酰胺酶是I种能水解几乎所有(除氨曲南等单环外)的β-内酰胺类抗生素，而随着碳青霉烯类及其他类抗生素的不断使用，使得vm在十几年里出现了多种亚型，迄今为止，VIM已发现近三十种亚型，除VIM-7与其他亚型的差异最大外，其他亚型氨基酸同源性较高。由于K/?:通过整合子机制在不同种细菌间进行水平传播，给临床治疗带来严重的威胁，至今还未发现临床有效的抑制剂。因此，寻找一个合适的K?因的检测方法可以为临床治疗提供很好的基础。
[0003]传统的传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。因而研发一种简便、快速的细菌金属β-内酰胺酶耐药基因的检测方法具有极大的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于快速检测细菌金属β -内酰胺酶耐药基因的LAMP试剂盒、以及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KJi納方法。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示:
内引物 1:5，- GGTAGACCGCGCCATCAACAGATTGCCGATGGTGTT-3’ (SEQ ID N0.1)；
内引物 2:5，- TGTCCGTGATGGTGATGAGTTGCAATCTCCGCGAGAAGTG-3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - GTGAGTATCCGACAGTCAAC-3’ (SEQ ID N0.3)；
外引物 2:5’ - CGTTACGGGAAGTCCAATT-3’ (SEQ ID N0.4)；
环引物 1:5’ - ACGACTGCGTTGCGATAT-3’ (SEQ ID N0.5)；
环引物 2:5，- CTTTTGATTGATACAGCGTGGG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0006]一种用于快速检测细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KZM的LAMP试剂盒，其包括上述用于快速检测细菌金属内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP引物组。
[0007]作为优选的，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6-8:1:3_4。
[0008]作为优选的，所述试剂盒中还含有:DNA聚合酶，LAMP反应液，显色剂，阳性对照和阴性对照。
[0009]作为优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0010]作为优选的，所述LAMP反应液含有:10 mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSCVK溶液、5 mM甜菜碱，四者的体积比为6-8:4-5:2-3:8_10。
[0011]作为优选的，所述显色剂为SYBR GREEN I。
[0012]作为优选的，所述阳性对照为含有细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KJ#片段的质粒，所述细菌金属内酰胺酶耐药基因KJ#片段如SEQ ID N0.7所示；所述阴性对照为DEPC 水。
[0013]一种快速检测细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KJi納方法，包括如下步骤:
(1)提取待检样品DNA；
(2)利用上述用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因K/袖勺LAMP引物组对待检样品DNA进行等温扩增；
(3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ?显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为KJi艇广谱β-内酰胺酶耐药基因，橙色则为非KJi湛因。
[0014]作为优选的，等温基因扩增反应的25 μ L反应体系含有:内引物各8pmol/>L，外引物各I pmol/^L，环引物各4 pmol/^L，反应液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待检DNA 1-100 ng，用灭菌去离子水补齐到25μ? ;等温基因扩增反应的条件为:60-65°C反应55_65min。
[0015]本发明的有益效果是:发明针对细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KZ对寺异性设计了 6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确地将细菌金属β -内酰胺酶耐药基因与其他非细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KZlK分开来。另外，本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别细菌金属内酰胺酶耐药基因不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。
【附图说明】
[0016]图1为本发明对细菌超广谱内酰胺酶耐药基因KJi/以及对非细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因的扩增结果(一:阴性样品，+:细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因KJii样本)；
图 2 为实施例 3 的特异性验证结果(l:DEPC，2:C7Z-#-l，3:/^E；4: SMB, 5: CMY-2,6: TEM, 7:1MP, 8: VIM and CMY-2)；
图3为实施例4的LAMP灵敏度实验结果(a::本发明LAMP扩增的电泳结果；b:本发明LAMP扩增的显色结果；其中，I为DEPC，2?10为含有细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因 _勺 pMD19-T 质粒，浓度依次为 1.0X10 ―1、1.0X 10'1.0X 101、1.0X 102、1.0X 103、1.0Χ104、1.0Χ105、1.0 X 16 拷贝 /yL)o
[0017]图4为实施例4的常规PCR灵敏度实验结果(其中，I为DEPC，2?10为含有细菌超广谱内酰胺酶耐药基因KJi^]pMD19-T质粒，浓度依次为l.0XlO'l.0XlO1、1.0X102、1.0X103、1.0X104、1.0X105、1.0X106、1.0XlO7 拷贝 /yL)o
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019]实施例1用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP试剂盒的建立
用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP试剂盒，包括以下成分:(1)特异性引物组；(2) DNA聚合酶；(3) LAMP反应液；(4)显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
[0020]( I)特异性引物的设计:
根据细菌金属β -内酰胺酶耐药基因VOi (GenBank登录号为:JX070882 )的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下:
内引物 1:5，- GGTAGACCGCGCCATCAACAGATTGCCGATGGTGTT-3’ (SEQ ID N0.1)；
内引物 2:5，- TGTCCGTGATGGTGATGAGTTGCAATCTCCGCGAGAAGTG-