一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 喹诺酮类是近年来临床引用较广的一种新型广谱抗菌剂，是人工合成的含4-喹 诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类和其他抗菌药的作用点不同，它们以细菌的脱氧核糖核 酸（DNA)为靶。细菌的双股DNA扭曲成为袢状或螺旋状（称为超螺旋），使DNA形成超螺旋 的酶称为DNA回旋酶，喹诺酮类妨碍此种酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，而使细菌 细胞不再分裂。
[0003] 喹诺酮类抗生素在临床上不仅对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，而且对革兰阳 性菌也有较强的抗菌作用。由于具有抗菌作用强、感染部位浓度高、不良反应轻微、血半衰 期长、使用方便、患者耐受性好及价格相对较低等特点，使其在细菌性感染治疗中具有一定 的优势。普遍用于伤寒、急性细菌性痢疾、单纯尿道感染、急性淋病性尿道炎、急性呼吸道感 染、军团病、肺结核等。另外，近年来喹诺酮类抗生素在儿科领域也得到了广泛应用，此外， 喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药 物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、 鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。
[0004] 近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐 药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的 攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。喹诺酮类抗菌药由 于其高效的抗菌活性，已被越来越多的使用于临床，这当中不免有抗生素滥用的情况，并且 其耐药机制多样，使得此类药物的耐药性问题也日益突出。另外，因为在畜牧养殖业中广泛 使用喹诺酮类抗生素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到 人体，它们体内产生的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的 检测细菌耐药性的方法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。
[0005] 耐药性的检测可以分为常规表型检测（即药敏试验）和耐药基因型检测。常规药 敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的 细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的20年，为适应临床需要，以DNA 探针和聚合酶链反应（PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方 法已被美国食品和药品管理局（FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期 的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污 染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂， 所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。
[0006] 实时突光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对 样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量， 而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目 前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突 变研究等。
【发明内容】
[0007] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂 盒，实现对常见细菌喹诺酮类耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS的快速检测，以弥补现有检测方法 的不足。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] 检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物，它包括如下引物：
[0010] ⑴扩增qnrA耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1?2所示；
[0011] ⑵扩增qnrB耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3?4所示；
[0012] ⑶扩增qnrS耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5?6所示；
[0013] 上述3对引物对在一次检测中共同使用。
[0014] 上述检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物在制备检测细菌喹诺酮类耐药基因试剂 中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0015] 一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0016] (I)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg2+、PCR反 应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ;
[0017] (2)引物混合液：将SEQ ID NO :1?6所示的6种引物混合，用双蒸水溶解，每条 引物的浓度为lymol/L ;
[0018] (3)阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠 杆菌基因组DNA的水溶液；
[0019] (4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
[0020] 其中，阳性对照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠杆 菌基因组DNA浓度为50ng/ μ L。
[0021] 其中，阴性对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为100ng/Ml。
[0022] 上述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒在制备细菌喹诺酮类耐药基因检测 试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0023] 因为细菌的生长繁殖速度很快，其基因组也经常会发生变异而具有异质性，包含 本发明所述的3种耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS的不同种类的临床致病菌和同一种菌的不 同临床隔离菌株所含的基因 DNA序列会有所差异，本发明通过从NCBI的基因序列库中比 对多种菌及临床隔离株的基因序列，在保守位点设计的特异性引物能扩增临床常见致病菌 (主要包括革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、 阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆 菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌等）的qnrA、qnrB、qnrS耐药基因。
[0024] 有益效果：
[0025] (1)本发明通过对临床多种细菌及隔离株的喹诺酮类耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS 的序列进行分析，选取保守序列设计引物，能特异性扩增临床常见致病菌的喹诺酮类耐药 基因 qnrA、qnrB、qnrS〇
[0026] (2)在检测喹诺酮类耐药基因试剂盒中加入稳定性强、双链结合特异性高、对PCR 反应抑制小的EvaGreen荧光染料，能快速、准确地扩增出喹诺酮类耐药基因。
[0027] (3)本发明所述的核酸序列和试剂盒具有操作简便、灵敏度高、特异性强、成本低 廉及高通量等优点，可用于辅助临床快速诊断致病性细菌喹诺酮类耐药基因的耐药情况， 为临床治疗提供参考依据。
【附图说明】
[0028] 图1为阳性对照品检测结果图。
[0029] 图2为阴性对照品检测结果图。
[0030] 图3为1例大环内酯类抗生素耐药大肠杆菌的耐药基因检测结果图。
[0031] 图4为1例大环内酯类抗生素敏感肺炎克雷伯菌检测结果图。
[0032] 图中英文字母对应的中文名称为：
[0033] Cycles :循环数；Fluorescence :突光值；Amplification Curves :扩增曲线； Select :选择；Zoom :放大。
【具体实施方式】
[0034] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0035] 实施例1 :检测细菌喹诺酮类3种耐药基因耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS的核酸序 列。3对特异性引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成：
[0036] 扩增qnrA耐药基因的引物对：
[0037] F1(SEQ ID NO :1) :5，-TTTGATGGTTGCCGCTTTGTC-3，，
[0038] R1(SEQ ID NO ：2) ：5' -CTCT