TGACGGTGATCTGGTTGG-3;；
[0039] 扩增qnrB耐药基因的引物对：
[0040] F2(SEQ ID NO :3) :5，-TGAGCGGCACTGAATTTATCG-3，，
[0041] R2(SEQ ID NO :4) :5，-CCAACGGTTTTCCCACAGC-3，；
[0042] 扩增qnrS耐药基因的引物对：
[0043] F3(SEQ ID NO ：5) ：5' -TTTCCAACAATGCCAACTTGC-3;,
[0044] R3(SEQ ID NO :6) :5' -TCCAGCGATTTTCAAACAACTC-3，。
[0045] 实施例2 :试剂盒的制备方法。
[0046] (I)PCR 反应液：Fast EvaGreen qPCR Master Mix (购于美国 Biotium 公司），为 2*PCR反应酶预混液，其中含有本发明所述的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、EvaGreen荧光 染料、Mg 2+及 dNTPs，-20°C保存；
[0047] (2)引物混合液：将SEQ ID NO :1?6所示的核苷酸序列交由英潍捷基（上海） 贸易有限公司合成，然后混合于一管中，用双蒸水溶解，每一条引物的终浓度均为1 μ mol/ L，-20°C保存；
[0048] (3)阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠 杆菌基因组DNA，其中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠杆菌基 因组DNA浓度为50ng/ μ L，-20°C保存；
[0049] ⑷阴性对照：大肠杆菌基因组DNA浓度为IOOng/ μ L，-20°C保存。
[0050] 实施例3 :检测方法。
[0051] 仪器：Roche LightCyclerya 480 荧光定量 PCR 检测仪，BECKMANMicrofUgeisWR 台式 微量冷冻离心机，Eppendorf 5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866 型涡旋振荡器。
[0052] (1)细菌基因组DNA模板的制备：参考公开的文献，不同种类的细菌标本，采用相 应的商品化DNA抽提试剂盒，按照试剂盒说明书制备细菌基因组DNA，作为PCR反应模板备 用。
[0053] (2)以步骤（1)所述基因组DNA为模板，利用5对特异性引物和高性能荧光染料进 行细菌喹诺酮类耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS的扩增检测，具体包括如下步骤；
[0054] (2a)PCR反应液配制：从_20°C冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备 用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液X μ 1 :
[0055] X = (10 μ I PCR反应液Α+3 μ I PCR反应液Β+5 μ 1双蒸水）X (η份样本+1份阳 性对照+1份阴性对照+1份空白对照）。
[0056] 振荡混勻后，2000rpm离心5s，按每人份18 μ 1分装到96孔PCR反应板中，传至样 本制备区备用。
[0057] (2b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入细菌样本DNA模板2 μ 1 (若样本 裂解产物保存在_20°C，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min)，阳性对照孔加入2 μ 1 阳性对照品，阴性对照孔加入2 μ 1阴性对照品，空白对照孔加入2 μ 1双蒸水，加样过程要 求冰上操作。贴好封口膜，3000rpm离心30s，放入仪器进样槽。
[0058] (2c)PCR扩增：Roche LightCycIcry? 480荧光定量PCR仪进行细菌喹诺酮类耐药 基因检测，反应条件如下：95°C预变性3min ;95°C 10s，60°C 40s，40个循环，荧光采集点在 60°C，检测模式设置为染料法，反应体积设置为20。保存文件，运行。
[0059] (2d)结果分析，具体包括如下步骤：
[0060] Roche LightCyclery# 480荧光PCR检测仪点击分析，选取定量模式，进入分析窗 口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则的噪音线的最高点（可根据实际情况适当 调整），且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。每次实验空白 对照孔无 Ct值，结果合格。点击计算，自动计算得到每个测试的CT值。
[0061] (2e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：
[0062] 阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值或大于40且增长曲线不规则；阳性对照品 PCR扩增增长曲线呈S型曲线且CT值小于35。
[0063] (3)步骤（2)所得的样本耐药基因检测结果判断，具体按照如下标准：
[0064] (3a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴 性。
[0065] (3b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈40,则按以下方法判断：
[0066] 若样本的CT〈35,则判样本结果为阳性；
[0067] 检测样本Ct > 35,重新配制PCR反应液进行PCR扩增，复查结果如果增长曲线不 呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40,则判样本结果为阴性。如果增长曲线呈S型且Ct 值仍旧小于40则判样本结果为阳性。
[0068] 实施例4 :临床患者细囷样品检测。
[0069] 将本发明所述的试剂盒用于40例临床微生物患者细菌样本3种喹诺酮类耐药基 因检测，检测体系及检测方法参照实施例3,检测结果与基因芯片法结果进行对比，检测结 果如表1所示：
[0070] 表1样品检测结果对照表
[0071]
【主权项】
1. 检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物，其特征在于，它包括如下引物： (1) 扩增qnrA耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1?2所示； (2) 扩增qnrB耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3?4所示； (3) 扩增qnrS耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5?6所示； 上述3对引物对在一次检测中共同使用。
2. 权利要求1所述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物在制备检测细菌喹诺酮类耐 药基因试剂中的应用。
3. -种检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂： (1) PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg2+、PCR反应 缓冲液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ; (2) 引物混合液：将SEQ ID NO :1?6所示的6种引物混合，用双蒸水溶解，每条引物 的浓度为1 μ mol/L ; ⑶阳性对照：分别含有qnrA、qnrB、qnrS耐药基因的三种细菌基因组DNA和大肠杆菌 基因组DNA的水溶液； (4) 阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
4. 根据权利要求3所述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，其特征在于，阳性对 照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠杆菌基因组DNA浓度为 50ng/μ L0
5. 根据权利要求3所述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，其特征在于，阴性对 照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为100ng/Ml。
6. 权利3?5任一所述的检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒在制备细菌喹诺酮类耐 药基因检测试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的检测 细菌喹诺酮类耐药基因的引物如SEQ?ID?NO：1～6所示，这三种引物对能特异地扩增出多种细菌的qnrA、qnrB、qnrS三种喹诺酮类耐药基 因。本发明还公开了检测细菌喹诺酮类耐药基因的试剂盒，该试剂盒中含有EvaGreen荧光染料，能实现快速检测细菌喹诺酮类抗生素相关耐药基因。本发明 具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，可用于临床致病性细菌喹诺酮类耐药基因相关耐药基因的快速检测，为临床治疗提供参考。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104560981
【申请号】CN201510034174
【发明人】任绪义, 虞闰六, 宣文静
【申请人】杭州迪安医学检验中心有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月23日