突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种突变的核酸与表达载体和制备高抗逆性酵母菌株的方法以及酵 母菌株及其制备方法与用途，具体地，涉及一种突变的核酸、插入有该核酸的表达载体、利 用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株 的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。
【背景技术】
[0002] 由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加 快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的生产和应用在经济发展 和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成 为我国能源政策的重要方向。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为 可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解 石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和 可持续发展等方面具有积极作用。
[0003] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培养、生长 周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母能够高效利用葡萄糖产 乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性（Almeida J R M et al.，2007)较差，特别 是对纤维素水解液中的抑制成分敏感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌 株；其次，纤维素乙醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发 酵造成不同程度的抑制，其中，乙酸、糠醛、酚类和SO广等抑制因子对酵母有较强毒害作用， 会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。
[0004] 目前，在纤维素乙醇生产菌种一酿酒酵母的研究领域，大多集中于将各种实验 室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生型酵母模型，能够耐受 多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实用性，显然，研究获得具有上述特性的 酵母模型极为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够使酵母菌株稳定发酵产乙 醇、耐受多重抑制物而具有高抗逆性的突变的核酸、插入有该核酸的表达载体和利用该表 达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株的方法 以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。
[0006] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种突变的核酸，其中，该突变的核 酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者，该突变的核酸的序列由5'端连接有Kozak序列的SEQ ID NO: 1 组成。
[0007] 第二方面，本发明提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有上述本发明的突 变的核酸。
[0008] 第三方面，本发明提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其中，该方法包括： 使用上述本发明的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。
[0009] 第四方面，本发明提供了 一种酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的菌株，所述酵母菌株的保藏号为CGMCC No. 8203。
[0010] 第五方面，本发明提供了第四方面的酵母菌株在生产乙醇中的用途。
[0011] 第六方面，本发明提供了一种生产乙醇的方法，该方法包括：用第四方面的酵母菌 株对乙醇发酵原液进行乙醇发酵。
[0012] 通过上述技术方案，利用本发明突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获 得具有高抗逆性和多重胁迫耐受性的酵母菌株，该酵母菌株的遗传性能稳定，在乙醇生产 中的糖利用率和乙醇产量均较高，可应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新 工艺中，实用性较强。
[0013] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0014] 生物保藏
[0015] 本发明的酵母菌株-酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)于2013年9月 24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（缩写为CGMCC，地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为 CGMCC No. 8203。
【具体实施方式】
[0016] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语"抗逆性"是指微生物在偏离 其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH， 较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。
[0018] 本发明提供了一种突变的核酸，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者， 该突变的核酸的序列由5'端连接有Kozak序列的SEQ ID NO: 1组成。
[0019] atgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagaca gtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcact atcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggg gcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:I)
[0020] 在本发明的优选实施方式中，所述突变的核酸的序列由5'端连接有Kozak序列的 SEQ ID NO: 1 组成。
[0021] 其中，Kozak序列是指用来增强真核基因翻译效率，避免核糖体出现漏洞扫描 (leaky scan)的序列。各种常规的Kozak序列都可以用于本发明。
[0022] 进一步优选地，所述突变的核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023] gccaccatgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggt aagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgt tgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttt tgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO :2)
[0024] 本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有序列如上所述的突变的核酸。 其中，所述表达载体可以为插入有本发明的突变的核酸并能够使突变的核酸表达的任何表 达载体，例如，质粒或噬菌体。
[0025] 根据本发明，所述表达载体中的启动子可以为组成型启动子或诱导型启动子。为 了进一步增强表达效率，优选地，所述表达载体中的启动子为Padhl启动子、Ppgk启动子或 Pfbp启动子。更优选地，所述表达载体中的启动子为Padhl启动子。
[0026] 根据本发明，对所述表达载体中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能 够很容易地选择适当的终止子来构建能够表达本发明突变的核酸的表达载体。
[0027] 根据本发明的一种优选实施方式，所述表达载体为在质粒PAUR123的BamHI酶切 位点和XhoI酶切位点之间插入序列如上所述的突变的核酸而得到的表达载体。将本发明 优选实施方式中的表达载体转化到酿酒酵母细胞中时能够获得更高的表达效率，从而能够 更好地实现本发明的目的。
[0028] 此外，本发明还提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，该方法包括：使用本发 明的上述表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。
[0029] 本发明中，可以采用本领域常用的各种转化手段来使用表达载体转化酵母细胞， 例如，电穿孔法或化学法。优选地，采用电穿孔法来转化酵母细胞。电穿孔法的具体操作为 本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
[0030] 本发明中，对使用的酵母细胞没有特别的要求，可以为野生型的各种酵母细胞，也 可以为缺陷型酵母细胞。优选地，使用野生型酵母细胞进行转化。
[0031] 根据本发明，为了获得转入有本发明的表达载体的酵母菌株的纯培养物，制备高 抗逆性酵母菌株的方法优选还包括：将转化后的酵母细胞在胁迫培养基中进行培养，以去 除抗逆性低的酵母细胞。
[0032] 其中，所述胁迫培养基指能够筛选转化了本发明的表达载体的酵母细胞的培养 基，一般指添加了胁迫因子的培养基，所述胁迫因子可以为乙酸、Na 2S04、NaCl、KC1、NH4Ac、 K