3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - GTGAGTATCCGACAGTCAAC-3’ (SEQ ID N0.3)；
外引物 2:5’ - CGTTACGGGAAGTCCAATT-3’ (SEQ ID N0.4)；
环引物 1:5’ - ACGACTGCGTTGCGATAT-3’ (SEQ ID N0.5)；
环引物 2:5，- CTTTTGATTGATACAGCGTGGG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0021](2) DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
(3)LAMP 反应液含有:1 OmM dNTP、10XThermoPol 反应缓冲液、150mM MgSO4,5mM 甜菜碱，四者的体积比为8:5:3:10o
[0022](4)显示剂为 SYBR GREEN I。
[0023](5)阳性对照为含有细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KJ#片段(SEQ ID N0.7)的PMD19-T质粒(利用常规的质粒构建方法将SEQ ID N0.7插入pMD19_T质粒中得到)；阴性对照为DEPC水。
[0024]实施例2细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJi納快速检测方法
利用实施例1的试剂盒快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因具体步骤如下: (O提取模板DNA:采用水煮法提取细菌基因组DNA ；
(2)环介导等温基因扩增反应:25yL反应体系含有:内引物1、2终浓度各为8pmol/KL，外引物1、2终浓度各为I pmol/^L，环引物1、2终浓度各为4 pmol/^L，反应液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待检DNA 50 ng，用灭菌去离子水补齐到25μ?，然后加入20μ?的密封液，将上述反应管于63°C反应60min ；
(3)结果判断:在上述反应管中加入WL显色剂IXSYBRGreen I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为细菌金属内酰胺酶耐药基因橙色则为非细菌金属β-内酰胺酶耐药基因ΚΖ￥(如图1)。
[0025]实施例3特异性实验
利用实施例2的方法分别对经鉴定不含K?因的临床分离株进行检测，DEPC水为阴性对照。
[0026]检测结果见图2。仅细菌金属内酰胺酶耐药基因KJi/管为绿色，其余管为橙色。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将KJ#及其他非ΚΖ1?分开来。
[0027]实施例4灵敏度实验
取阳性对照品(即构建好的含有细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJ#片段(SEQ IDN0.7)的PMD19-T质粒)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0X 1-1- 1.0X10 8拷贝/ μ L的浓度作为样品进行实验。分别用本发明的检测方法和常规PCR方法进行检测。
[0028]常规PCR检测方法所用的引物序列如下所示:
VIM-F:ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG (SEQ ID N0.8)
VIM-R:CTACTCAACGACTGAGCG (SEQ ID N0.9)
本发明试剂盒的检测结果如图3所示，结果表明，本试剂盒对K?因的最低检出限为:1.0X 14拷贝 / μ L。
常规PCR方法的检测结果如图4所示。其最低检出限为:1.0X 10 6拷贝/ μ Lo
[0029]以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，且不需要昂贵的仪器设备，适合现场检测。
[0030]以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【主权项】
1.一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示:内引物 1:5，- GGTAGACCGCGCCATCAACAGATTGCCGATGGTGTT-3’ (SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- TGTCCGTGATGGTGATGAGTTGCAATCTCCGCGAGAAGTG-3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - GTGAGTATCCGACAGTCAAC-3’ (SEQ ID N0.3)；外引物 2:5’ - CGTTACGGGAAGTCCAATT-3’ (SEQ ID N0.4)；环引物 1:5’ - ACGACTGCGTTGCGATAT-3’ (SEQ ID N0.5)；环引物 2:5，- CTTTTGATTGATACAGCGTGGG-3’ (SEQ ID N0.6)。2.一种用于快速检测细菌金属β -内酰胺酶耐药基因KJi納LAMP试剂盒，其包括权利要求I所示的引物组。3.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6-8:1:3-4。4.根据权利要求2所示的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有:DNA聚合酶，LAMP反应液，显色剂，阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。6.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液含有:10mMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSOjK溶液、5 mM甜菜碱，四者的体积比为6-8:4-5:2-3:8-10o7.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述显色剂为SYBRGREEN I。8.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有细菌金属β-内酰胺酶耐药基因K/双片段的质粒，所述细菌金属β-内酰胺酶耐药基因KJ#片段如SEQ ID N0.7所示；所述阴性对照为DEPC水。9.一种快速检测细菌金属内酰胺酶耐药基因KJi納方法，包括如下步骤: (1)提取待检样品DNA； (2)利用权利要求1的引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应； (3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ?显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为细菌金属内酰胺酶耐药基因橙色则为非KJi湛因。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，等温基因扩增反应的25μ L反应体系含有:内引物各8pmol/pL，外引物各I pmol/gL，环引物各4 pmol/gL，反应液12.5PL，DNA聚合酶8U，待检DNA I?100 ng，用灭菌去离子水补齐到25μ?;等温基因扩增反应的条件为:60-65 °C 反应 55-65min。
【专利摘要】本发明公开了一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因VIM的LAMP试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，分别如SEQ ID NO.1-6提取待检细菌基因组DNA，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60-65℃对DNA样品进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、检测简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104962625
【申请号】CN201510353189
【发明人】田国宝, 黄曦, 钟兰兰, 张雪飞
【申请人】中山大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月23日