安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记 的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 我国是生猪养殖大国，也是猪肉消费大国，随着社会的发展，生猪养殖规模化程度 越来越高，各种疾病的预防和控制变得更加重要和严峻。提高猪群的一般抗病力，有助于降 低生产成本，更有利于减少药物残留，提高猪肉产品质量、公共卫生安全及动物福利等。研 宄发现，一些猪病的发病机制是和猪本身的遗传背景相关的，因此应用遗传学方法，从遗传 基础上提高猪对疾病的抗性具有治本的功效。随着猪基因组学和免疫学的发展，各种抗性 相关基因的核酸序列和功能的研宄为猪抗病育种有效遗传标记的筛选和确定提供了可能。
[0003]抗原处理相关转运体 1(transporterlassociatedwithantigen processing,TAPI)是参与介导细胞内源性抗原与MHCI类分子结合以供T细胞识别过程中 一个重要的组成部分，在免疫应答中起着重要的作用，与机体的一般抗病力有着密切关系。 在人类上的研宄已表明，TAP基因的多态性会改变机体的免疫应答，影响个体对疾病的易感 性。猪TAP1基因位于7号染色体上，横跨8. 63kb，共11个外显子，编码746个氨基酸。在 猪上已有研宄表明TAP1基因外显子2G729A位点对TAP1基因表达和部分免疫指标具有明 显的遗传效应；且亦有研宄分析了TAP1基因作为猪抗病育种分子标记的可行性，结果表明 TAP1基因在杜洛克、长白、大白和皮特兰4个品种中表现出与相关生产性状无关，因此对它 抗病性能的选择利用将不会造成其他性能的下降。鉴于TAP1基因在动物机体免疫应答中 的重要性，对其多态性和遗传效应进行系统分析具有重要的理论和实践意义。
[0004] 断奶仔猪腹泻以及水肿病是当今规模化猪场养殖中一种常见的疾病。在仔猪的饲 养管理过程中，断奶是一个极其重要的环节。仔猪断奶后，由于断奶应激，仔猪自身消化系 统尚未发育完全，再加上来自母体的抗体来源终止等外界不良因素的影响，常常易导致仔 猪断奶后发生腹泻（Post-weaning diarrhea, PWD)和水肿病（Oedema disease, 0D)，其中 F18大肠杆菌是最主要的致病源。至今为止，对于致病性大肠杆菌造成的危害，仍没有有效 的预防措施和治疗方法，给养猪业带来巨大的经济损失。
[0005] 本发明所述研宄以安徽三个本地品种（圩猪、皖南黑猪及霍寿黑猪）和一个外来 品种大白猪为试验对象，检测在该四个群体中TAP1基因的遗传变异。通过测定在易感染 F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标，进行品种间的差异分析、以及基因型间 的关联性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TAP1基因多态性对 不同种群断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有 效遗传标记，为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研宄提供分子生物学参考。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛 选方法，本发明方法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。
[0007] -种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：
[0008] (1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、霍寿黑猪、皖南黑猪与外来 猪种大白猪28日龄断奶仔猪为研宄免疫指标品种差异的对照动物模型；
[0009] (2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；
[0010] (3)耳样组织DNA提取；
[0011] (4)PCR扩增抗原处理相关转运体1 (transporter associated with antigen processing, TAPI)基因目的片段；
[0012] (5)检测目的片段单链构象多态性分析（Single-StrandConformation Polymorphism,SSCP)；
[0013] (6)PCR扩增产物双向测序；
[0014] (7)群体遗传学特性分析；
[0015] (8)仔猪血清免疫指标的测定；
[0016] (9)采用数学模型分析所检测到的TAP1基因的遗传变异与血清免疫指标的关联 性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。
[0017] 根据TAP1 基因单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)与免疫 指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影 响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的有效遗传标记。
[0018] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (1) 中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪及大白猪28日龄 断奶仔猪分别选择76、95、153、174头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，皖 南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇牧业有限公 司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。
[0019] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (2) 中耳样组织采集过程为：提前在1. 5mL的Eppendorf管中注入70%体积分数浓度的酒 精，然后每头猪采耳组织块约1. 5g，装入所述Eppendorf管中，于-20°C保存备用。
[0020] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (3) 中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及酒精，装 入1. 5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科 技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/yL，放在2-8 摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1yLDNA在SMA1000上测定0D260/0D280的比值（当 0D260/0D280的比值在1. 8-2. 0之间，说明所提DNA纯度较高）；⑤质量检测：将所提DNA用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量，以便进行后续实验。
[0021] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (4) 中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤（3)获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank 猪TAPI基因（登录号BX323833. 4)外显子1和外显子8序列，采用PrimerPremier5. 0 软件设计引物，进行TAPI基因外显子1和外显子8部分序列的克隆，并采用2%琼脂糖凝胶 电泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TAPIexon-1的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO: 1和SEQIDNO: 2所示，引物TAPIexon-8的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 3和 SEQIDN0:4所示，退火温度及目的片段长度见表1。
[0022] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (5) 中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TAP1基因外显子1、8扩增产物进行非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行硝酸银染色后用凝胶成像系统观察电泳结果得到所述 断奶仔猪TAP1基因单链构象多态性。
[0023] 其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤：
[0024] (a)清洗制胶所用的玻璃板、夹子、软绳、样品梳等用具，晾干；
[0025] (b)制板：将干净且干燥的底板磨面朝上（磨砂玻璃边的圆头朝下），用软绳封住 玻璃板的三面，夹子夹紧；
[0026] ((：)配制10%的聚丙烯酰胺凝胶721^(双蒸水421^，30%的？46￡241^，10\丁8￡ 6mL，TEMED50yL，AP330yL)，混匀后快速灌胶；
[0027] (d)将胶灌至玻璃板的边缘处后，插入梳子（此时注意检查胶中是否有气泡），在 室温下放置，待胶聚合后使用；
[0028] (e)凝胶聚合好后，向电泳槽中加入1XTBE，去下夹子、软绳及梳子，将玻璃板固 定于电泳槽上，并用注射器冲洗加样孔；
[0029] (f)300V电压下预电泳 30min;
[0030] (g)取3yLPCR扩增产物至96孑LPCR板中，加入7yL上样缓冲液，用枪吹打混匀 后，用透明胶带封口；
[0031] (h)98°C变性lOmin，然后迅速冰浴lOmin，然后点样；
[0032] (i)240V电压电泳lh，150V电压电泳12h;
[0033] 其中，所述硝酸银染色具体包括如下步骤：
[0034] (a)电泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝胶并做好标记，用双蒸水漂洗2遍；
[0035] (b)倒入固定液（10%乙醇，0? 5%乙酸）轻微振荡5min，回收固定液；
[0036] (c)倒入2%硝酸银溶液避光轻微振荡15min，回收硝酸银溶液；
[0037] (d)用蒸馏水漂洗2遍后，倒入显色液（3%NaOH，0?1 %HCHO)振荡进行显色反应， 至条带清晰为止；
[0038] (e)蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统中观察电泳结果。
[0039] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (6) 中PCR扩增产物双向测序的过程为：根据单链构象多态性结果，挑选不同带型的样本， 每种带型挑选3个样本，PCR扩增50yL体系送至上海生工有限公司进行双向测序，测序结 果用DNAStar或DNAMan，Chromas软件分析。
[0040] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (7) 中群体遗传学特性分析过程为：采用popgene软件对步骤（5)、（6)检测到的SNP位点 进行群体遗传学分析，包括等位基因频率、基因型频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数、 多态信息含量的计算，并用卡方检验来判断群体中基因型的分布是否处于Hardy-Weinberg 平衡、采用popgene软件进行x2适合性检验计算。
[0041] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (8) 中仔猪血清免疫指标的测定过程为：35日龄断奶仔猪空腹前腔静脉采血，常规分离血 清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm处测质量浓度分别为1000pg/ml、 500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml、15. 6pg/ml共7个浓度的标准品 的吸光度，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度；进而计算血清中IL-6、IL-10、IL-12、 IFN-y、TNF_a的浓度。
[0042] 本发明所述的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (9)中采用的数学分析模型为：①品种间血清免疫指标的差异性分析采用SPSS19. 0统计软 件One-wayANOVA程序进行方差分析和显著性检验，试验所得数据均以"平均数土SD"表 示。②不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为：YU=y+Bi+G，％.;其 中，为免疫指标表型值；y为群体均值；Bi表示断奶仔猪的断奶批次效应；G」表示第j种 基因型效应；表示随机误差；采用SPSS19. 0统计软件GLM程序对本试验所检测到的遗传 变异与血清免疫指标的关联性进行分析。
[0043] 本发明安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法与现有技术不同之处在 于：
[0044] 本发明所述方法以安徽省三个本地猪种（圩猪、霍寿黑猪、皖南黑猪）和一个外来 猪种大白猪为试验对象，利用克隆、测序的方法检测在该四个群体TAP1基因外显子1、8序 列区的遗传变异。通过测定易感染F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标（血 清IL-6、IL-10、IL-12、IFN-y、TNF-a含量），进行品种间的差异分析、以及基因型间的关 联性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以