及TAP1基因多态性对不同 种群断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。探讨分析所检测到的TAP1基因多态性位点对不 同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗 病育种的候选遗传标记。从而可为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研宄提供分子 生物学参考。本发明所述方法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。
[0045] 下面结合附图对本发明的安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法作进 一步说明。
【附图说明】
[0046] 图1为本发明中猪耳组织基因组DNA质量检测结果图；
[0047] 图2为本发明中猪TAP1基因外显子1序列区目的片段的PCR扩增产物图；
[0048] 图3为本发明中猪TAP1基因外显子8序列区目的片段的PCR扩增产物图；
[0049] 图4为本发明中TAP1基因外显子1扩增片段SSCP检测图；其中，泳道2、3、4、5位 GG基因型，泳道1、6为AA型，泳道7、8为GA型；
[0050] 图5为本发明中TAP1基因外显子8扩增片段SSCP检测图；其中，泳道1、4、5、6、 7、8为EE基因型，泳道2、3为EF基因型；
[0051] 图6为本发明中猪TAP1基因外显子1扩增片段测序结果对比图；其中，（a)图为 GG基因型测序图，（b)图为AA基因型测序图；
[0052] 图7为本发明中猪TAP1基因外显子8扩增片段测序结果对比图；其中，（a)图为 EE基因型测序图，（b)图为EF基因型测序图。
【具体实施方式】
[0053] 一、猪TAP1基因外显子1、8序列区单核苷酸多态性分析
[0054] 1、试验材料
[0055] 试验动物：
[0056] 试验动物中76头圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，95头皖南黑猪采自 绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，153头霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇牧业有限公司， 174头大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司，所有采样猪只为35日龄断奶仔猪。用 耳号钳夹取一小块耳组织（约〇.5g)，放置于装有lmL70%(体积分数）乙醇的1.5mL Eppendorf管中，低温保存带回实验室，-20°C保存备用。酚/氯仿法提取耳样组织DNA，超 纯水溶解，超微量紫外分光光度计测浓度和纯度，置4°C备用或_20°C保存。
[0057] 主要仪器：
[0058] (l)PCR仪：美国ABI公司
[0059] (2) pH测定仪：意大利HANNA公司
[0060] (3)电子天平：美国奥豪斯公司
[0061] ⑷电泳槽：北京六一仪器厂
[0062] (5)恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司
[0063] (6)高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂
[0064] (7)气浴恒温振荡器：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂
[0065] (8)微量冷冻离心机：美国Beckman Coulter公司
[0066] (9)白度色度计：北京辰泰克仪器有限公司
[0067](10)电子数显卡尺：成都成量工具集团有限公司
[0068](11)鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司
[0069](12)稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂
[0070] (13)MiniStar微型迷你离心机：美国Tomos公司
[0071] (14)紫外分光光度计：北京美林恒通科技有限公司
[0072](15)全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司
[0073] 主要试剂：
[0074]GoldenDNAPolymerase、2xReactionMix购自天根生化科技有限公司；琼脂糖购 自西班牙nTOBio-instrumentCompany;DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司；蛋 白酶K购自北京艾德莱生物科技有限公司；lOXLoadingBuffer购自北京全式金生物科 技有限公司；亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED购自Sigma公司；引物、氯仿、Tris饱和 酚、EDTA、SDS、溴酚蓝、异戊醇、无水乙醇、二甲苯氰、甘油、醋酸钠、NaCl、KC1、NaOH、Na2HP04、 KH2P04、冰乙酸、、硝酸银、去离子甲酰胺、甲醛、梓檬酸、梓檬酸钠、葡萄糖等购自上海生工有 限公司。
[0075] 主要试剂配制：
[0076](1)组织裂解液
[0077]在200mL ddH20中加入0? 605g Tris-base，调pH值到8. 0,加入18. 61g Na2EDTA .2H20,溶解后加入2. 5g SDS，定容至200mL，高压灭菌备用。
[0078] (2)2〇mg/mL蛋白酶K
[0079] 将瓶装100mg的蛋白酶K溶于5mL灭菌超纯水中，分装于高压灭菌的离心管中 (lmL/管），-20°C保存备用。
[0080] (3) 6x上样缓冲液
[0081] 0. 25 %溴酚蓝，0. 25 %二甲苯氰，30 %甘油水溶液。
[0082] (4)溴化乙锭（EB)
[0083] 取EBlOg完全溶解100mL水中，避光保存。
[0084] (5) 0. 5MEDTA
[0085] 称取 46. 5gEDTA-Na溶于 200mL超纯水，用NaOH调pH至 8. 0,定容至 250mL。
[0086] (6)lOxTBE
[0087]取 108Tris碱，55g硼酸，量取 40mL0.5MEDTA，超纯水定容至 1000mL。
[0088] (7) 30 %丙烯酰胺
[0089] 取72. 5g丙烯酰胺，2. 5g甲叉，超纯水定容至250mL，过滤，4°C保存备用。
[0090] (8) 10 %过硫酸铵
[0091] lg过硫酸铵溶于10mL的蒸馏水中，4°C保存备用。
[0092] (9)0. 2%AgN03
[0093] 2gAgN03 溶于 1000mLddH20 中。
[0094] (10) 3%NaOH(显色液）
[0095] 15gNaOH溶于 500mLddH20,加入甲醛 1.OmL。
[0096] (11)固定液
[0097] lOOmL乙醇，加5mL乙酸，加水定容至1000mL。
[0098] 试验方法
[0099]DNA提取
[0100] (1)剪取〇.2g左右耳组织样，放入1.5mLEP管中，剪至糜烂，加入组织裂解液， 55°C放置 3h;
[0101] ⑵加入5uL蛋白酶K(20ug/uL)，55°C消化过夜；
[0102] (3)加0. 6mL饱和酚充分混匀，放置后分层，则继续颠倒混匀，直至形成悬浊液；
[0103] (4) 12000rpm离心 10min;
[0104] (5)吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中（1. 5mL);
[0105] (6)加入600uL酚-氯仿-异戊醇溶液（25:24:1)，颠倒混匀直至形成悬浮液；
[0106] (7) 12000rpm离心 10min;
[0107] (8)吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中（1. 5mL);
[0108] (9)重复步骤 6、7、8;
[0109] (10)加入0? 6mL氯仿-异戊醇（24:1)溶液，充分混匀30min;
[0110] (11) 12000rpm离心1Omin，吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中 (1. 5mL)，加入lmL冰无水乙醇（2倍体积），充分混匀，离心管中出现絮状漂浮物，S卩DNA;
[0111] (12) 12000rpm离心10min，将絮状悬浮物吸至另一个干净的离心管中（1. 5mL);
[0112] (13)加入0.5-lmL70%乙醇（提前放入-20°C)，10min后，吸出乙醇，再加70%乙 醇，反复冲洗2-3次；
[0113] (14)室温过夜干燥DNA样品，至无乙醇气味；
[0114] (15)加入 150-300uLTE/ddH20 过夜，或 65°C水浴 2h，使DNA溶解；
[0115] (16)调终浓度至 100ng/uL;
[0116] (17)4°C或 _20°C长期保存。
[0117] DNA浓度和纯度检测
[0118] (1)取1yL的DNA在SMA1000上测定0D260/0D280之间的比值，比值在1. 8-2. 0 之间，说明所提DNA纯度较高；
[0119] (2)用1.5%的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA条带，观察提取产物的质量，进行后续 实验。软件分析工具
[0120] DNA数据库：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/。
[0121] 引物设计软件：Primer5. 0,斯坦福在线设计软件。
[0122]序列分析软件：DNAStar，DNAMan，Chromas〇
[0123] 统计分析软件：SPSS19.0。
[0124] 引物设计
[0125] 根据GenBank猪TAP1基因（登录号BX323833.4)外显子1和外显子8序列，采用 PrimerPremier5.0软件设计引物，送交上海生工生物技术有限公司合成。
[0126] 其中引物TAPI exon-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所 示，引物TAPI exon-8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示，退火温 度及目的片段长度见表1。
[0127] 表1猪TAP1基因引物序列
[0129] 新合成的引物是固体状粉末，在溶解前先离心lmin，沉淀到管底后，按稀释比例加 入对应体积的灭菌ddH20稀释到10yg/yL，充分混匀，4°C保存。
[0130] PCR反应体系
[0131] PCR反应体系见表2。
[0132] 表2PCR反应体系
[0134] PCR扩增程序：94°C预变性5min;94°C变性30s，Tm°C(退火温度依引物而定）复 性3〇8,72°0延伸3〇8,30个循环；最后721：延伸81^11，41：保存。
[0135] 琼脂糖凝胶电泳检测
[0136] 取3yLPCR扩增产物与2yL6XLoadingBuffer混勾，用2 %的琼脂糖凝胶电泳 进行检测（电压6V/cm)，在凝胶成像仪下观察PCR扩增的结果、拍照。
[0137] 单链构象多态性检测（SSCP)
[0138] 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0139] (1)清洗试验所需要的器械，包括玻璃板、样品梳和绳子等，并晾干，挑选一个干 净、平滑的桌面制板备用。
[0140] (2)配制721^10%聚丙烯酰胺凝胶（241^30%的？46￡，4211^的双蒸水，10\丁8￡ 6mL，AP:330yL，TEMED:50yL)，混匀后快速灌胶，后插入梳子（注意检查是否有气泡，如有 应排除），放置几个小时让其自然凝固（可放入烘箱中加快凝固）。
[0141] (3)将凝好胶的板固定好后，向电泳槽中加入1XTBE，300V电压预电泳30min。
[0142] (4)在96孔PCR板每孔中先加入7yL变性剂，后加入3yLPCR产物，用枪吹打混 匀后，透明胶密封口；
[0143] (5)98°C变性lOmin后，迅速病浴冷却lOmin，然后点样。
[0144] (6) 240V电压 20min，120V电压过夜 14-16h。
[0145] 硝酸银染色
[0146] (1)电泳结束，取下玻璃板，切胶并做好标记，清水洗3遍。
[0147] (2)固定液（10%乙醇和0.5%乙酸）震荡3-5min，回收。
[0148] (3)倒入2