%AgN03溶液，避光轻摇10-15min，回收。
[0149] (4)蒸馏水洗1-2遍。
[0150] (5)现配显色液（3%NaOH，0. 1 %HCH0)，润洗后显色至条带出现为止。
[0151] (6)蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统观察电泳结果，拍照保存。
[0152] PCR产物序列测定
[0153] 根据SSCP结果，挑选不同带型的样本，每种带型选3个样本，PCR扩增50yL体系 送至上海生工有限公司进行双向测序，测序结果用DNAStar或DNAMan，Chromas分析。
[0154] 群体遗传学分析
[0155]SSCP结果表明呈现共显性遗传，表型反应基因型，直接计算等位基因频率和基因 型频率。
[0156] 基因频率是指群体中某一基因数占其同一基因座基因总数的比率。其计算公式 为：
[0157]Pi= [2(ii) +(ijl) + (ij2)+…+ (ijn-l) + (ijn)]/2n
[0158] 式中，Pi :第i个等位基因的频率；ii :i个等位基因纯合个体数；ijn :含有i等位 基因的杂合个体数；n:为一个群体内个体的总数。
[0159] 基因型频率=基因型个体数/测定群体总数X100%
[0160] 遗传多样性分析
[0161] (1)纯合度（homozygosity，Ho):指某一群体中特定标记位点上等位基因纯合的 程度，反映群体遗传的一致性。
[0163] 式中，Ho为某一位点的纯合度，Pi为第i个等位基因的频率，n为某一位点的等位 基因数。
[0164] (2)杂合度（heterozygosity，He):与纯合度相对，杂合度高表明群体中基因一致 性较差，群体的遗传变异较大，多态性丰富。
[0166] 式中，He :某一位点的杂合度，Pi :某一位点上第i个等位基因频率，n :某一位点的 等位基因数，Ho:遗传纯合度；
[0167] (3)有效等位基因数（effective number of alleles，Ne):纯合度的倒数，反映等 位基因之间的相互影响，是衡量基因纯合度的一个指标。等位基因在群体中分布的越均匀， 有效等位基因数越接近实际检测到的等位基因绝对数。
[0168] Ne= 1/Ho=1/ E Pi2
[0169] 式中，Ne:某一位点的有效等位基因数，Pi:某一位点上第i个等位基因频率，Ho: 遗传纯合度；
[0170] (4)多态信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC):对标记基因的多 态性进行估计。PIC>0. 5高度多态，0. 5>PIC>0. 25中度多态，PIC〈0. 25低度多态。
[0172] 式中，n:等位基因数目；Pi和Pj:分别为第i和第j个等位基因在群体中的频 率。PIC值用于对标记基因多态性的估计，PIC>0. 5为高度多态，PIC〈0. 25为低度多态， 0. 25〈PIC〈0. 5为中度多态。
[0173]群体遗传结构分析
[0174] (1)哈代-温伯格定律平衡检测：当群体处于Hardy-Weinberg平衡状态时，一对 等位基因的基因频率与基因型频率的关系有：D=p2,H= 2pq，R=q2,其中，D、H、R为基 因型频率，而p、q为基因频率，并有p+q= 1。
[0175] (2)卡方检验公式：x 2 = E (Oi-Ei) 2/Ei
[0176] 其中，Oi为观察值，Ei为理论值。因为本研宄资料的自由度df= 1，当基因型理 论值小于5时，可采用矫正公式：
[0178] 结果与分析
[0179] 猪耳组织基因组DNA的检测
[0180] 用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA条带，检测结果如图1所示。从电泳 图来看，基因组DNA品质良好，不存在降解现象。同时取lyLDNA提取样于SMA1000上测 定0D260/0D280,比值位于1. 8-2. 0,所提DNA纯度较高，可进行后续实验。
[0181] PCR扩增结果
[0182] PCR扩增TAP1基因外显子1、8部分序列，产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（见图 2-图3)。如图2所示，外显子1扩增片段为231bp，如图3所示，外显子8扩增片段为292bp， PCR扩增产物符合预期扩增片段的大小，如图所示，特异性良好且无非特异性条带，可用于 后续试验。
[0183]PCR-SSCP检测结果
[0184] 引物TAPl-exon1PCR-SSCP检测显示，TAPl-exon1扩增片段内有1个SNP位点， 该位点存在3种基因型：GG、GA和AA基因型（图4)，引物TAPl-exon8PCR-SSCP检测发现， TAPl-exon1扩增片段内有两个连锁的SNP位点，存在2种带型，分别命名为EE和EF基因 型（图5)。
[0185]TAP1基因外显子1、8扩增片段序列分析结果
[0186] 取引物TAPl-exon1、TAPl-exon8不同带型个体的PCR产物进行测序，并将测序 结果与猪TAP1基因DNA序列（NCBI登录号为NC_010449)进行比对。
[0187] 结果发现：（1)TAP1基因外显子1扩增片段测序结果为：在TAP1基因第443位碱 基处发现1个G-A的无义突变，定义GG为野生型，AA为突变型（图6)。⑵TAP1基因外 显子8扩增片段测序结果为：在TAP1基因第6297位碱基处存在G-C、6298位碱基处存 在G-T的连锁基因突变，定义EE(GG/GG)为野生型，EF(GC/GT)为杂合子型（图7)，6297 位点突变引起氨基酸从谷氨酰胺变成为组氨酸，6298位点突变使氨基酸从缬氨酸变为亮氨 酸。
[0188]TAP1基因G443A、G6297C/G6298T位点基因型频率和基因频率分析
[0189] 通过对4个品种498头猪TAP1基因G443A、G6297C/G6298T突变位点进行检测，统 计其基因频率和基因型频率，结果如表3、表4所示。G443A突变位点在四个品种中均检测 到，在圩猪、皖南黑猪和霍寿黑猪群体中野生GG基因型频率低于突变AA基因型，基因型频 率趋势为GG〈GA〈AA，而在大白猪群体中结果相反，基因型频率GG>GA>AA。G6297C/G6298T位 点在皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪群体中EE基因型频率分别为79. 17%、66. 67%和92. 16%， 为该3个群体的优势基因型，而在大白猪群体EF基因型为优势基因型。
[0190] 表3G443A位点基因频率和基因型频率分析
[0192] 表4G6297C/G6298T位点基因频率和基因型频率分析
[0193]
[0194] 群体遗传学分析
[0195]TAP1基因G443A位点群体遗传学分析
[0196]PIC是衡量群体内遗传变异程度的指标，由表5可以看出，G443A位点在皖南黑猪、 圩猪、霍寿黑猪以及大白猪四个群体中的PIC均大于0. 25小于0. 5,处于中度多态；且经 过x2适合性检验，圩猪、霍寿黑猪群体的x2值均小于5. 991，处于哈迪-温伯格平衡状态 (P>0. 05);而皖南黑猪、大白猪群体的x2值均大于5. 991，偏离了哈迪-温伯格平衡状态 (P>0. 05) 〇
[0197] 表5猪TAPI基因G443A位点在群体中的多态信息含量（PIC)、杂合度（He)、有效 等位基因数（Ne)及x2检验
[0199] 注：PIC>0. 5为高度多态，0. 25〈PIC〈0. 5为中度多态，PIC〈0. 25为低度多态。 x2〇. 05 = 5. 991，x2〇. 01 = 9. 21 ;下表同。
[0200]TAP1基因G6297C/G6298T连锁位点群体遗传学分析
[0201] 由表6可知，G6297C/G6298T连锁位点在皖南黑猪、圩猪、霍寿黑猪以及大白猪四 个群体中的PIC均小于0. 25,处于低度多态；且经过x2适合性检验，皖南黑猪、圩猪、霍寿 黑猪以及大白猪四个群体的x2值均小于5. 991，处于哈迪-温伯格平衡状态（P>0. 05)。
[0202] 表6猪TAPI基因G6297C/G6298T位点在群体中的多态信息含量（PIC)、杂合度 (He)、有效等位基因数（Ne)及x2检验
[0203]
[0204] 动物疾病抗性具有一定遗传差异背景，而免疫学和分子生物学等相关学科技术的 发展及社会对猪肉产品质量和动物福利等问题的日益关注，赋予了开展猪抗病育种尤其是 分子标记辅助选择研宄的必要性。抗性基因的单核苷酸突变往往与动物对疾病的抗性/易 感性相关。TAP1是参与介导细胞内源性抗原与MHCI类分子结合以供T细胞识别过程中一 个重要的组成部分，在免疫应答中起着重要的作用，与机体的一般抗病力有着密切关系。
[0205] 本试验对猪TAP1基因的外显子1、8序列进行的多态性检测，共发现1个单碱基突 变、1对连锁碱基突变。其中外显子1上G443A位点在圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪群体优势基 因型为GG型，相反在大白猪群体中，其优势基因型为AA型。G443A位点在皖南黑猪和大白猪 中偏离Hardy-Weinberg平衡，这可能跟采样时部分个体存在血缘关系：为全同胞或者半同 胞有关。另外在TAP1基因外显子8存在G6297C/G6298T位点连锁碱基突变，G6297C/G6298T 位点在皖南黑猪、圩猪和霍寿黑猪中EE基因型频率分别为79. 17%、66. 67%和92. 16%， 为该3个群体的优势基因型，而在大白猪群体EF基因型频率为62. 09%，为优势基因型。 G6297C/G6298T位点的连锁碱基突变在四个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态。
[0206] 四个群体在TAP1基因G443A和G6297C/G6298T位点均检测到了碱基突变，符合遗 传标记标准，若今后作为遗传标记，将具有一定的普遍性。相比外来猪种，我国地方猪种都 具有抗病、抗逆性强的特点，TAP1基因G443A、G6297C/G6298T位点多态性分布在中外猪种 间的极大差异，是否与品种抗病性有关，值得进一步研宄。
[0207] 二、TAP1基因多态性与断奶仔猪血清免疫指标的关联性分析
[0208] 试验材料
[0209] 试验动物
[0210] 试验动物中76头圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，95头皖南黑猪采自 绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，153头霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇牧业有限公司， 174头大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司，所有采样猪只为35日龄断奶仔猪。于 〈【具体实施方式】>(一）部分采耳组织同时，每只猪空腹前腔静脉采血，将采集的全血静置冰 箱4°C过夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，-20°C保存备用。
[0211] 试验设备和器材
[0212] (1)酶标仪（450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片）。
[0213] (2)洗板机（可调注液量，保证每孔350y1洗液而不溢出）。
[0214] (3)超净工作台，生物安全柜，通风柜。
[0215] (4)高精度单道加液器（量程为 0? 5-10y1，2-20y1，20-200y1，200-1000y1)。
[0216] (5)高精度多道加液器（8道或12道，量程为50-300y1)
[0217] (6) 37°C恒温箱。
[0218] (7)低温离心机。
[0219] (8)电冰箱（4°C，_20°C，_86°C)?
[0220] (9)分析天平。
[0221] (10)剪刀，镊子，钳子等。
[0222] (11)漩涡混合仪，低频振荡器等。
[0223] 试验耗材和试剂
[0224] (1)猪IFNy，IL-10,IL-6,IL-12,TNFa酶联免疫分析试剂盒。
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