一种wap基因在果蝇转基因中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种WAP基因在果蝇转基因中的应用，本发明通过把中国对虾中的WAP基因构建在果蝇中，使WAP基因在果蝇中得到表达，本发明制备的转基因果蝇具有抗菌的作用。
【专利说明】—种WAP基因在果媚转基因中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种WAP基因在果蝇转基因中的应用。
【背景技术】
[0002]随着抗生素被广泛的应用甚至滥用，抗生素残留和细菌耐药性问题越来越受到全世界的关注，研究和开发新型抗菌药物来替代传统抗生素也成为世界性的攻关课题。
[0003]抗菌肽是生物体内产生的具有强抗菌作用的小分子多肽，在抵抗细菌、病毒、真菌等病原菌入侵时具有非常重要的防御作用，被认为是很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物，在治疗、预防癌症和抗病毒、抗感染等方面具有良好的应用前景，成为了新抗菌药物研发的热点(Splith and Neuntorf, 2011)。抗菌肽产品是处于世界领先水平的抗生素替代品，可以用于药业、食品工业、畜牧业、水产养殖业、日用化工业等领域(Fernebro，2011;Maroti et al.，2011)。因此，研发抗菌肽药物对促进经济和社会的发展意义重大。
[0004]近年来，全球蛋白质、多肽类药物市场发展迅速，年增长率达19% (梁远军和刘克良，2007 )。美国曾把世界首例报道的抗菌肽一天蚕素研发成了饲料防腐剂及伤口洗涤剂的药物，被称为“万能肽”。日本有以凝集素作为治疗癌症制剂的专利申报。我国科研工作人员也在抗茵肽药物的研发上进行了许多有益的工作。1999年初，华南农业大学等单位联合申请了高新技术成果孵化项目“柞蚕抗菌肽一杀菌抗病毒新药的试产”，研发的柞蚕抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌，耐药性细菌均有杀菌作用，能抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，能选择性杀伤肿瘤细胞，可进一步纯化为单体制成新药，作为治疗耐性细菌感染的口服药物(黄自然，1999)。2010年，中国科学院昆明动物研究所与苏州光华实业(集团)有限公司联合开发抗菌肽药物(《中国医药生物技术》，2010)。新疆大学生命科学与技术学院等科研机构利用基因工程手段获得了高活性新疆家蚕抗菌肽，具有抑制多种致病细菌和口腔龋齿菌的功效，还对有关的肿瘤`细胞的生长具有明显的抑制作用，可以研发为消毒、抗菌、抗龋齿、抗肿瘤的抗菌肽药物(http://www.tianshannet.com, 2010)。浙江东海生物药业有限公司2010年投资8个亿新上“抗菌肽研发、建设工程”项目，主要产品为新一代替代抗生素的抗菌药物“抗菌肽Thanatin及其突变体”，计划年产抗菌肽原粉I吨，初步估计每年能挽救200万垂危患者(使用青霉素、链霉素、土霉素、金霉素等抗生素无效者)的生命。因此，抗菌肽药物在拯救生命、保障人类健康方面的社会意义和经济价值难以估量。
[0005]尽管抗菌肽表现出巨大的新药开发潜力，但多数抗菌肽作为药物生产还存在着很多问题，比如无蛋白酶抑制活性而容易被蛋白酶水解、生物体内含量太低直接从生物组织中分离纯化困难、原核表达的重组蛋白难溶、产量与活性不高等。目前，开发成功的抗菌肽药物还非常少。
[0006]专利号为20051004458888的专利公开了中国对虾中克隆了一个含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因(简写为WAP) (Jia YP, 2008)，并利用原核表达系统表达了 WAP抗菌肽重组蛋白，它以不溶的包涵体形式存在，经过变性、复性，得到了纯的WAP抗菌肽重组蛋白，体外检测该WAP抗菌肽具有广谱抗菌活性和蛋白酶抑制活性的双功能，表明WAP抗菌肽具有很好的药物研发前景。
[0007]研发性能稳定、活性强、既抗菌又具有蛋白酶抑制活性的双功能的WAP抗菌肽新型药物就是本发明的切入点。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种WAP基因在果蝇转基因中的应用，其利用转基因技术，将中国对虾的wap基因转入果蝇基因组，获得了高表达、稳定遗传、有抗菌功能的WAP转基因果蝇品系；表达WAP的转基因果蝇饲喂鸡、鱼等家禽和鱼水生物，具有明显的抗病与增重的药用效果。
[0009]本发明的具体技术方案如下:
(1)转基因果蝇的构建:根据WAP基因的ORF两端序列，设计一对上下游引物Wap-f和Wap-r，并在上下游引物的5’端分别引入办μ I与如I酶切位点，引物序列如下:
Wap-f:5 ’ 一GG GGTACC^ TGGTGAACA TCAAGGAAGTTC —3，(SEQ ID NO:1)
ffap-r:5，一GCTCT KQkTCkTTTTCCGTAGGGAGATCCCA—3，(SEQ ID NO:2)
以中国对虾血细胞cDNA为模板，PCR钓取WAP片段，利用kpn I和xba I两个酶切位点，与pUAST质粒定向连接,构建真核表达载体wap/pUAST,经PCR验证和测序验证该质粒中插入的WAP片段序列(SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:2)正确后，将wap/pUAST与Zl之-J辅助质粒一起显微注射入白眼的野生型黑腹果蝇W1118的胚胎中，在辅助质粒上转座子P元素的协助下，WAP基因被随机整合到果蝇胚胎极细胞的基因组中，极细胞将来发育成生殖腺，注射成功的胚胎发育的GO代成蝇会产生带wap转基因的配子，当GO成蝇与W1118果蝇杂交时，杂交子代(Gl)中会出现wap转基因成功的红眼果蝇，因为，wap/pUAST上有min1-white标志基因，使果蝇复眼呈现红色，依此筛查，便得到红眼的转基因果蝇品系；利用PCR，从转基因果蝇品系基因组中检查到了 WAP基因片段，证明WAP转基因果蝇构建成功；
所述的wap基因为中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3):
ATGGTGAACA TCAAGGAAGT TCTGATCGTG30
TCCGTGTTGG TGGCCGCGGT GGCTGTTTCT60
CCCGCCGATG CTGTTCCAAC GAGACACGCT90
AGGCCCCGTC CTCAGCCCAG GCCGAGGCCA120
GGGACGTGTC CGGACACGAG CGACATCGTC150
TCCATCTGCG TCGTGACGGA ACGCAACTGC180
TTCTCGGACG GCGAGTGCGG AGCCGGCCAG210
AAGTGCTGTC CGATTGGCTG CGGGAGAGAG240
TGCCTGGCTG TGGGATCTCC CTACGGAAAA TGA273
其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4):
MVNIKEVLIV SVLVAAVAVS PADAVPTRHA30
RPRPQPRPRP GTCPDTSDIV SICVVTERNC60
FSDGECGAGQ KCCPIGCGRE CLAVGSPYGK90所述的如/? I的核苷酸序列为GGTACC ；
所述的I的核苷酸序列为AGATCA。
[0010](2) wap在转基因果蝇中的基因定位:从转基因果蝇品系中，挑选红眼的WAP转基因雄蝇，分别与平衡系(W-/W-;Sc0/Cy0;Sb/Tb)经过两轮杂交，依据杂交后代果蝇表型的分离现象，定位了 wap在I号染色体、II号染色体或II号和III号染色体的5个WAP转基因果妮品系。
[0011](3) WAP在转基因果蝇体内的表达:把定位好的WAP转基因果蝇与Gal4果蝇进行杂交，得到表达wap基因的转基因果蝇。
[0012]WAP在转基因果蝇体内的表达受Gal4_UAS双元系统的调控，由于不同的Gal4品系提供了表达在不同组织的Gal4，而WAP转基因果蝇中的wap基因位于UAS的下游(UAS-wap),当 WAP 转基因品系与 actin_Gal4、He_Gal4、ppl_Gal4、eIav-Ga14 不同的 Gal4品系杂交时，杂交后代具有了 Gal4/UAS-wap双元系统，Gal4会与UAS结合，驱使UAS下游的wap基因在杂交后代的全身、血细胞、脂肪体或神经系统表达；而WAP转基因品系、不同的Gal4品系与野生型W1118果蝇的杂交后代，不具备Gal4/UAS_wap双元系统，几乎没有wap基因的表达。QPCR检测结果也证实了这一点:具备Gal4/UAS-wap双元系统的杂交后代，其wap基因的表达量闻于不表达wap基因的对照100多倍，而且，wap基因在不同转基因品系的杂交后代中的表达水平有高中低的不同。
[0013]本发明制备成的转基因果蝇可制备成转基因果蝇药物，其具有显著的抗菌作用。
[0014]本发明构建的WAP转基因果蝇，借助Gal4/UAS_wap双元系统的调控和杂交实验，实现了 WAP抗菌肽在果蝇特定组织的高表达，不仅克服了原核表达WAP重组蛋白的难溶、缺乏翻译后修饰和活性降低等缺点，而且避免了原核表达WAP蛋白后处理的麻烦，仅通过杂交，就可以把WAP作为定点给药的内服药物引入了转基因果蝇的特定组织中，提高了表达WAP的果蝇的抑菌功能和生存能力，同时，WAP在转基因果蝇中表达量高，直接饲喂家禽和鱼类具有抗病增重效果，对致炎鱼类还有外用杀菌的功能；第三、通过果蝇的大量繁殖，容易收获WAP抗菌肽药物产品，利于工业化生产。
[0015]本发明公开的WAP转基因果蝇是一种便于内服和外用的WAP抗菌肽药物产品，具有生产WAP抗菌肽药物简单方便、容易储存、绿色环保、便于重复、成本低的优点，适合用于
家禽和水产养殖业。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]附图1是构建的真核表达载体wap/pUAST经PCR验证的结果。用WAP特异引物:Wap-f和Wap-r对5个wap/pUAST质粒进行PCR检测，得到了与用中国对虾血细胞cDNA为模板PCR扩增阳性结果一样大小的WAP片段。
[0017]附图2是构建的真核表达载体wap/pUAST经测序验证的结果。与wap基因序列比对，发现wap/pUAST中插入的wap片段序列完全正确。
[0018]附图3是WAP转基因果蝇的PCR检测结果。提取WAP转基因果蝇和W1118野生型黑腹果蝇的基因组DNA，分别用WAP特异引物:Wap-f和Wap-r对这些基因组DNA进行PCR检测，从WAP转基因果蝇基因组中扩增出与用wap/pUAST阳性质粒为模板扩增WAP大小一样的片段，而从W1118野生型黑腹果蝇的基因组中没有扩增出wap目标片段。证明中国对虾wap基因成功插入到WAP转基因果蝇的基因组中。
[0019]附图4是wap在转基因果蝇中的基因定位流程图。首先，从携带wap的转基因果蚬tx5、t6、tlO、t32、t78品系中各挑一只红眼的雄蚬,分别与w_/w_; Sco/Cyo; Sb/Tb平衡系处女蝇杂交，观察Fl代的表型。若出现红眼的性别分离，则可定位wap基因在I染色体上，若无性别分离，即雌雄个体中均有红眼出现，推测wap可能插在II或III染色体上。然后，从排除了 wap插入在I染色体的Fl代果蝇中，挑选带有平衡子稳定遗传的红眼雄蝇，如翘翅、短茬、红眼(Cyo; Sb，red)或翘翅、短蛹、刚毛簇生、红眼(Cyo ;Tb，red)的雄蝇，再与平衡系(W-/W-; Sco/Cyo; Sb/Tb)处女蝇进行第二轮杂交，观察F2代表型。若出现红眼、少毛翘翅(+/+; Sco/Cyo)的表型，则推断wap目的基因插在第III号染色体上；若出现红眼、短茬、短蛹、刚毛簇生(+/+; Sb/Tb)表型，则可推断wap目的基因插在第II号染色体上。
[0020]附图5是QPCR检测WAP在转基因果蝇中的表达结果。取5个转基因果蝇品系:t6、t78、tx5、tlO、t323的雄蚬,分别与Actin_Gal4处女蚬杂交作实验组,标记为t6 x rj63、t78 X rj63、tx5 x rj63、tl0 x rj63、t32 x rj63，父母本分别与W1118果蝇杂交作对照组，父本对照标记为t6、t78、tx5、tlO、t32，母本对照未作标记。提取实验组、父本和母本对照组杂交子一代样品的总RNA反转录cDNA为模板，以管家基因actin做内参，用Wap-f和Wap-r引物进行QPCR检测。结果发现，在RNA水平上，母本对照组后代无WAP表达，父本对照组后代有极少的WAP表达，实验组后代均有WAP高表达，而且WAP表达量高达父本对照组后代的100多倍，5个转基因品系的杂交后代中，WAP表达量最高的是来自t6，其次是t78，接下来依次是tlO、t32和tx5。
[0021]附图6是在高浓度菌环境中WAP转基因果蝇抗菌功能的检测结果。横坐标是1-12天的羽化期，纵坐标是死亡率。在羽化期内，表达WAP的转基因果蝇和不表达WAP的父母本对照果蝇的死亡率都随时间增加呈相应的提高，而对照组果蝇的死亡率比实验组的死亡率高2倍多。说明:一方面， 随着培养时间的增加，培养基中细菌的浓度不断增加，加速了果蝇的死亡，提高了果蝇的死亡率；另一方面，相比对照，WAP的表达提高了转基因果蝇的抗菌能力，降低了它们的死亡率(见图中的三条曲线)，也表明，高菌浓度的环境里，WAP转基因果蝇相比对照具有更高的免疫力。
[0022]附图7是菌刺下WAP转基因果蝇抗菌功能的检测结果。选取WAP转基因雄性果蝇与He-Gal4处女蝇杂交实验组的后代雄蝇A ^与雌蝇A早、父本对照组的后代雄蝇B ^与雌蝇B早、母本对照组的后代雄蝇C ^与雌蝇C早各300只，用蘸取大肠杆菌(Escherichiaco7i)、金黄葡萄球菌{Staphylococcus aureus)混菌溶液(菌浓度为1.13 X 109CFU/mL)的ImL无菌注射器针头刺激，每只果蝇I针，以蘸取LB作同样刺激的果蝇和正常不刺激的果蝇做对照，统计刺激后6天内果蝇存活数制作曲线。
【具体实施方式】
[0023]下面对本发明作进一步的说明。
[0024](I) WAP转基因果蝇的构建:根据中国对虾含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因WAP的ORF两端序列，设计一对上下游引物Wap-f和Wap_r，并在上下游引物的5’端分别引入如/7 I (GGTACC)与ia I (AGATCA)酶切位点，引物序列如下:
Wap-f: 5，一GG GGTACCATGGTGAACATCAAGGAAGTTC —3，(SEQ ID NO:1)ffap-r: 5，一GCTCT KQkrXCKXTTTCCGTAGGGAGATCCCA—3，(SEQ ID NO:2)
以中国对虾血细胞cDNA为模板，PCR钓取WAP片段，利用kpn I和xba I两个酶切位点，与pUAST质粒定向连接,构建真核表达载体wap/pUAST,经PCR验证和测序验证该质粒中插入的WAP片段序列正确(见附图1、2)，将wap/pUAST与Z 辅助质粒一起注射入白眼的野生型黑腹果蝇W1118的486个胚胎中，在辅助质粒上转座子P元素的协助下，wap基因被随机整合到果蝇胚胎的基因组中，转基因成功的胚胎将发育成红眼的成蝇，经过筛查，得到了 10个红眼的转基因果蝇品系(见表1)。利用PCR，从转基因果蝇品系基因组中检查到了 WAP基因片段(见附图3)，证明WAP转基因果蝇构建成功。
[0025]表1转基因果蝇统计结果
【权利要求】
1.一种WAP基因在果蝇转基因中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: I)转基因果蝇的构建:根据WAP基因的ORF两端序列，设计一对上下游引物Wap-f和Wap-r，并在上下游引物的5’端分别引入办μ I与如I酶切位点，引物序列如下: Wap-f:5’ 一GG GGTACG4TGGTGAACATCAAGGAAGTTC 3’
ffap-r:5’ 一GCTCT KQkTCkTTTTCCGTAGGGAGATCCCA—3’ 以中国对虾血细胞cDNA为模板，PCR钓取WAP片段，利用kpn I和xba I两个酶切位点，与pUAST质粒定向连接,构建真核表达载体wap/pUAST,经PCR验证和测序验证该质粒中插入的WAP片段序列正确后，将wap/pUAST与Z 2~3辅助质粒一起显微注射入白眼的野生型黑腹果蝇W1118的胚胎中，在辅助质粒上转座子P元素的协助下，WAP基因被随机整合到果蝇胚胎极细胞的基因组中，极细胞将来发育成生殖腺，注射成功的胚胎发育的GO代成蝇会产生带wap转基因的配子，当GO成蝇与W1118果蝇杂交时，杂交子代中会出现wap转基因成功的红眼果蚬，因为，wap/pUAST上有min1-white标志基因，使果蚬复眼呈现红色，依此筛查，便得到红眼的转基因果蝇品系；利用PCR，从转基因果蝇品系基因组中检查到了WAP基因片段，证明WAP转基因果蝇构建成功； (2)wap在转基因果蝇中的基因定位:从转基因果蝇品系中，挑选红眼的WAP转基因雄蝇，分别与平衡系《-/V-; Sco/Cyo; Sb/Tb经过两轮杂交，依据杂交后代果蝇表型的分离现象，定位了 wap在I号染色体、II号染色体、II号和III号染色体上的定位转基因果蝇； (3)WAP在转基因果蝇体内的表达:把定位好的WAP转基因果蝇与Gal4果蝇进行杂交，得到了 wap基因表达的转基因果蝇； 所述的WAP基因为中国对虾含单一乳清`酸性蛋白结构域的抗菌肽基因；其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示； 所述的办w I的核苷酸序列为GGTACC ; 所述的I的核苷酸序列为AGATCA。
3.权利要求2所述的wap基因表达的转基因果蝇在制备抗菌药物中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK103865933SQ201410075171
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2013年11月30日
【发明者】李殿香, 王金星, 赵小凡, 王蕾, 齐梅, 刘力, 王军, 王显伟, 黄健, 黄加栋, 李强, 刘晖, 王国荣, 赵艳霞, 李宁, 矫强, 胡杨, 车彤彤, 周雷, 叶春江 申请人:济南大学