0225] ⑵离心管（容量为1. 5mL，5mL等）。
[0226] (3) -次性吸头（量程为 0? 5-10yL，2-20yL，20-200yL，200-1000yL) ?
[0227] (4)纯净水或蒸馏水。
[0228] ⑶坐标纸。
[0229] (6)吸水纸。
[0230] (7)EDTA，枸橼酸钠，肝素。
[0231] 试验方法
[0232] 猪前腔静脉采血，常规分离血清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪 450nm处测以下质量浓度：1000、500、250、125、62. 5、31. 25、15. 6pg/mL共7个浓度的标准品 的吸光度（OD值），绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度。
[0233] 试验原理
[0234] 本试验采用双抗体夹心ELISA法。所提供的ELISAKit是典型的夹心法酶联免疫 吸附测定试剂盒（ELISA)。预先包被的抗体为抗猪单克隆抗体。检测相抗体为多克隆抗体， 经生物素（biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗 涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显 色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深 浅和样品中的待测因子呈正相关。
[0235] 操作步骤（以IL-6为例，IFNy，IL-10,IL-12,TNFa检测操作步骤同IL-6)
[0236] (a)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回 铝箔袋内封存于2-8°C。
[0237] (b)预留空白孔（若使用双波长读板，空白孔可以不设）。
[0238] (c)分别将样本或不同浓度猪IL-6标准品（Opg/mL孔加标准品稀释液）加入相应 孔中（100yL/孔），用封板胶纸封住反应孔，37°C孵箱孵育90分钟。
[0239] (d)提前30分钟制备生物素化猪IL-6抗体工作液。
[0240] (e)洗板 3 次。
[0241] (f)加入生物素化猪IL-6抗体工作液（100y1/孔）。用封板胶纸封住反应孔， 37°C孵箱孵育60分钟。
[0242] (h)提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。
[0243] ⑴洗板3次。
[0244] (j)除空白孔外，加入酶结合物工作液（100y1/孔）。用封板胶纸封住反应孔， 37°C孵箱，避光孵育30分钟。
[0245] (k)洗板 5 次。
[0246] (1)加入TMB显色工作液（包括空白孔）100y1/孔，37°C孵箱，避光孵育，当标准 曲线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过30 分钟。
[0247] (m)加入终止液（包括空白孔）100yL/孔，混匀后即刻测量OD(450nm)值（10分 钟内）。
[0248] 结果判定及计算
[0249] 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过 样本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。若样本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
[0250] 数学分析模型
[0251] 品种间血清免疫指标的差异性分析采用SPSS19. 0统计软件One-wayANOVA程序 进行方差分析和显著性检验，试验所得数据均以"平均数土SD"表示。
[0252] 不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为：Yij=y+Bi+Gj+ey 其中，为免疫指标表型值；y为群体均值；B,表示断奶仔猪的断奶批次效应；G^表示第j 种基因型效应；表示随机误差；采用SPSS19. 0统计软件GLM程序对本试验所检测到的遗 传变异与血清免疫指标的关联性进行分析。
[0253] 结果与分析：
[0254] 各猪种间免疫指标差异性分析
[0255] 4猪种之间免疫指标水平的差异分析显示（表7):血清IL-6含量，霍寿黑猪极显 著高于圩猪和大白猪（p〈0.01)，皖南黑猪极显著高于大白猪（p〈0.01);而血清IL-10含量 正好相反，霍寿黑猪极显著低于圩猪、皖南黑猪和大白猪（P〈〇. 01);血清IL-12含量，圩猪 极显著低于霍寿黑猪、皖南黑猪和大白猪；血液IFN-y含量在4个猪种间的差异均为极显 著；与此同时，血液TNF-a含量在4个猪种间的差异也均为极显著。另外，血清IL-6含量 在霍寿黑猪中最高，血清IL-10、IL-12含量在大白猪中最高；血清IFN-y、TNF-a含量在 土于猪中最尚。
[0256] 表7不同猪种间免疫指标差异性分析 单位：pg/ml
[0258] 注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0259] TAPI基因多态性与断奶仔猪免疫指标的关联性分析
[0260] TAP1基因G443A位点多态性与免疫指标关联性分析
[0261] 圩猪TAP1基因G443A多态位点与各免疫指标显著性分析
[0262] 由表8可知，本试验圩猪群体内TAP1基因G443A位点AA基因型个体的血清免疫 指标含量高于GA、GG型个体，其中在血清IFNy、IL-6含量指标上，AA型与GA型个体的差 异达到显著水平（P〈〇. 〇5)，AA型与GG型个体的差异达到极显著水平（P〈0. 01);血清TNFa 含量指标在AA和GG基因型个体间达到显著水平（P〈0. 05)，与GA基因型个体差异不显著。
[0263] 表8圩猪TAP1基因G443A位点的关联分析单位：pg/mL
[0265] 注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0266] 大白猪G443A多态位点与各免疫指标显著性分析
[0267] 由表9可知，本试验大白猪群体内TAP1基因G443A位点AA基因型个体的血清免 疫指标含量高于GA、GG型个体，其中在血清IFNy、IL-6含量指标上，AA型与GG型个体 的差异达到极显著水平（P〈〇. 01)，血清IL-6含量在AA和GA基因型个体间达到显著水平 (P〈0. 05)，血清IFNy含量在GA和GG基因型个体间达到极显著水平（P〈0. 01);血清IL-10 含量指标在AA和GG基因型个体间达到显著水平（P〈0. 05)。
[0268] 表9大白猪TAP1基因G443A位点的关联分析单位：pg/mL
[0270] 注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0271] 皖南黑猪G443A多态位点与各免疫指标显著性分析
[0272] 由表10可知，本试验皖南黑猪群体内TAP1基因G443A位点AA基因型个体的血清 免疫指标含量高于GA、GG型个体，其中在血清TNFa、IL-12含量指标上，AA型与GG型个体 的差异均达到显著水平（P〈〇.〇5);血清IL-10含量在AA和GG基因型个体间达到极显著水 平（P〈0. 01)，在AA和GA基因型个体间达到显著水平（P〈0. 05)。
[0273] 表10皖南黑猪TAPI基因G443A位点的关联分析单位：pg/ml
[0274]
[0275] 注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0276] 霍寿黑猪G443A多态位点与各免疫指标显著性分析
[0277] 由表11可知，本试验霍寿黑猪群体内TAP1基因G443A位点AA基因型个体的血清 免疫指标含量高于GA、GG型个体，其中在血清TNFa、IL-12含量指标上，AA型与GG型个体 的差异均达到极显著水平（P〈〇. 01)，AA型与GA型个体的差异均达到显著水平（P〈0. 05); 血清IFNY含量在AA和GG基因型个体间达到显著水平（P〈0. 05)。
[0278] 表11霍寿黑猪TAP1基因G443A位点的关联分析单位：pg/ml
[0280] 注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0281] TAPI基因G6297C/G6298T位点多态性与免疫指标关联分析
[0282] 圩猪G6297C/G6298T多态位点与各免疫指标显著性分析
[0283] 由表12可知，本试验圩猪群体内TAP1基因G6297C/G6298T位点EE基因型个体的 血清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IFNy、TNFa含量指标上，EE型与EF型个 体的差异达到显著水平（P〈〇. 05)。
[0284] 表12圩猪TAP1基因G6297C/G6298T位点的关联分析单位：pg/ml
[0286] 注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0287] 大白猪G6297C/G6298T多态位点与各免疫指标显著性分析
[0288] 由表13可知，本试验大白猪群体内TAP1基因G6297C/G6298T位点EE基因型个体 的血清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IFNy、IL-10含量指标上，EE型与EF型 个体的差异达到显著水平（P〈〇.〇5);血清IL-6含量指标在EE和EF基因型个体间达到极 显著水平（P〈0. 01)。
[0289] 表13大白猪TAP1基因G6297C/G6298T位点的关联分析单位：pg/ml
[0291] 注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0.05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0292] 皖南黑猪G6297C/G6298T多态位点与各免疫指标显著性分析
[0293] 由表14可知，本试验皖南黑猪群体内TAP1基因G6297C/G6298T位点EE基因型个 体的血清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IL-12、IL-10含量指标上，EE型与EF 型个体的差异均达到显著水平（P〈〇.〇5);血清TNFa含量在EE和EF基因型个体间达到极 显著水平（P〈0. 01)。
[0294] 表14皖南黑猪TAP1基因G6297C/G6298T位点的关联分析单位：pg/ml
[0296] 注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈0.05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0297] 霍寿黑猪G6297C/G6298T多态位点与各免疫指标显著性分析
[0298] 由表15可知，本试验霍寿黑猪群体内TAP1基因G6297C/G6298T位点EE基因型个 体的血清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IL-10、IL-12含量指标上，EE型与EF 型个体的差异均达到极显著水平（P〈〇. 01);血清TNFa含量在EE和EF基因型个体间达到 显著水平（P〈0. 05)。
[0299] 表15霍寿黑猪TAP1基因G6297C/G6298T位点的关联分析单位：pg/ml
[0300]
[0301] 注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著（P〈〇. 05)，带有不同大写字母肩标 表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0302] 本研宄选取的五个免疫指标在机体免疫中有着不可忽视的重要性。IL-6作为一种 多功能炎性细胞因子，能够平衡一些细胞因子的损伤效应，从而起到保护作用，它是炎性介 质网络中的关键成分，既能抗炎也能致炎，具有双向功能。白细胞介素-10 (IL-10)是一种 能发挥抗炎症作用的细胞因子，可以促进B细胞的分化以及促进抗体的产生，同时抑制巨 噬细胞，并抑制Thl细胞分泌多种细胞因子。辅助性T细胞（helperTcell，Th)包含Thl 和Th2两个亚群，其中前者参与细胞免疫，主要