产生IL-2，IFNy等，而后者主要产生IL-10 等，辅助B细胞产生抗体，并参与体液免疫。IL-12的作用是独立诱导早期辅助性T母细胞 分化成Thl细胞，并且促进Thl细胞的发育以及增殖，是介导Thl细胞免疫应答的关键性细 胞因子。IL-12可刺激NK细胞和T细胞产生IFNy。IFNy可刺激巨噬细胞产生大量的一 氧化氮，直接杀死病原菌。TNF-a可介导NF-kB的激活，而NF-kB作为一种快反应转录因 子，可以调控促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子等基因的活化和表达。IL-10由Th2细胞 产生，IL-10几乎可以抑制如IL-6等所有炎性免疫指标的合成与释放，其中IL-12促进Thl 细胞分化及增殖的能力也可以被IL-10抑制。但同时，Th2细胞的反应及细胞因子的分泌 能力也反过来会被作为启动和维持Thl细胞的关键性细胞因子IL-12所抑制。因此，IL-10 和IL-12的动态平衡可直接关系到Thl/Th2的动态平衡，也就是直接关系到机体对疾病的 抵抗力。由此可见，各免疫指标之间相互影响，相互配合，从而在机体免疫中发挥重要作用。 本试验各猪种群所检测到的各项血清免疫指标值均在正常值范围内。
[0303]TAP1基因G443A位点各群体不同基因型的相关性分析结果显示于猪、大白猪、皖 南黑猪、霍寿黑猪各群体不同基因型之间免疫指标的变化趋势一致，即AA基因型个体的血 清免疫指标含量高于GA、GG型个体；其中在圩猪血清IFNy、IL-6、TNFa含量指标上，AA型 与GA型、GG型个体的差异均达到极显著或显著水平；在大白猪血清IFNy、IL-6、IL-10含 量指标上，AA型与GA、GG型个体的差异均达到极显著或显著水平；在皖南黑猪血清TNFa、 IL-12、IL-10含量指标上，AA型与GA、GG型个体的差异均达到极显著或显著水平；在霍寿 黑猪血清TNFa、IL-12、IFNy含量指标上，AA型与GA、GG型个体的差异均达到极显著或显 著水平；故推测在该四个群体中，TAP1基因G443A位点AA型个体的抗病能力可能与GA、GG 型个体存在差异，A等位基因可能在猪对疾病的抗性上具有一定的优势。
[0304]TAP1基因G6297C/G6298T位点各群体不同基因型的相关性分析结果显示：圩猪、 大白猪、皖南黑猪、霍寿黑猪各群体不同基因型之间免疫指标的变化趋势一致，即EE基因 型个体的血清免疫指标含量高于EF型个体；其中在圩猪血清IFNy、TNFa含量指标上，EE 型与EF型个体的差异达到显著水平；在大白猪血清IFNy、IL-6、IL-10含量指标上，EE型 与EF型个体的差异均达到极显著或显著水平；在皖南黑猪血清TNFa、IL-12、IL-10含量指 标上，EE型与EF型个体的差异均达到极显著或显著水平；在霍寿黑猪血清TNFa、IL-12、 IL-10含量指标上，EE型与EF型个体的差异均达到极显著或显著水平；故推测在该四个群 体中，TAP1基因G6297C/G6298T位点EE型个体的抗病能力可能与EF型个体存在差异，E等 位基因可能在猪对疾病的抗性上具有一定的优势。
[0305] 研宄结果提示，TAP1基因G443A、G6297C/G6298T位点均可作为候选靶位点应用于 安徽地方猪种圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪及外来品种大白猪的抗病育种。
[0306] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在于：包括如下步 骤： (1) 对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪与外来猪种 大白猪28日龄断奶的仔猪为研宄免疫指标品种差异的对照动物模型； (2) 样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血； (3) 耳样组织DNA提取； (4) PCR扩增抗原处理相关转运体1即TAPl基因目的片段； (5) 目的片段单链构象多态性即SSCP分析； (6) PCR扩增产物双向测序； (7) 群体遗传学特性分析； (8) 仔猪血清免疫指标的测定； (9) 采用数学模型分析所检测到的TAPl基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并 分析品种间血清免疫指标的差异性； 根据TAPl基因单核苷酸多态性即singlenucleotidepolymorphism:SNP与免疫指标 的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影响， 从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的有效标记位点。2. 根据权利要求1所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（1)中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪及大 白猪28日龄断奶仔猪分别选择76、95、153、174头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有 限公司，皖南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇 牧业有限公司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。3. 根据权利要求2所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（2)中耳样组织采集过程为：提前在I. 5mL的Eppendorf管中注入70%体积 分数浓度的酒精，然后每头猪采耳组织块I. 5g，装入所述Eppendorf管中，于-20°C保存备 用。4. 根据权利要求3所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（3)中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面 毛发及酒精，装入I. 5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京 全式金生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至IOOng/ yL，放在2-8摄氏度保存；④DNA纯度检测：取IyLDNA在SMA1000上测定0D260/0D280 的比值，当0D260/0D280的比值在1. 8-2. 0之间，说明所提DNA纯度较高；⑤质量检测：将所 提DNA用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量，以便进行后续实验。5. 根据权利要求4所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤（3)获得的耳组织样DNA为模板， 根据GenBank猪TAPl基因外显子1和外显子8序列，其登录号为BX323833. 4,采用Primer Premier5. 0软件设计引物，进行TAPl基因外显子1和外显子8部分序列的克隆，并采用 2%琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TAPlexon-I的核苷酸序列如 序列表中SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示，引物TAPlexon-8的核苷酸序列如序列表中 SEQIDNO: 3和SEQIDNO:4所示，退火温度及目的片段长度见表1。 表1猪TAPl基因引物序列6. 根据权利要求5所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（5)中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TAPl基因外显子1、8扩 增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行硝酸银染色后用凝胶成像系统观察电泳 结果得到所述断奶仔猪TAPl基因单链构象多态性； 其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤： (a) 清洗制胶所用的玻璃板、夹子、软绳、样品梳等用具，晾干； (b) 制板：将干净且干燥的底板磨面朝上，磨砂玻璃边的圆头朝下，用软绳封住玻璃板 的三面，夹子夹紧； (。）配制10%的聚丙烯酰胺凝胶721^，双蒸水421^，30%的？六6￡2411^，10\了8￡61^，TEMED50yL，AP330yL，混匀后快速灌胶； (d) 将胶灌至玻璃板的边缘处后，插入梳子，此时注意检查胶中是否有气泡，在室温下 放置，待胶聚合后使用； (e) 凝胶聚合好后，向电泳槽中加入IXTBE，去下夹子、软绳及梳子，将玻璃板固定于 电泳槽上，并用注射器冲洗加样孔； (f) 300V电压下预电泳30min; (g) 取3yLPCR扩增产物至96孔PCR板中，加入7yL上样缓冲液，用枪吹打混匀后， 用透明胶带封口； (h) 98°C变性lOmin，然后迅速冰浴lOmin，然后点样； (i) 240V电压电泳lh，150V电压电泳12h; 其中，所述硝酸银染色具体包括如下步骤： (a) 电泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝胶并做好标记，用双蒸水漂洗2遍； (b) 倒入固定液，所述固定液为含10%体积分数乙醇和0. 5%体积分数乙酸的双蒸水 溶液，轻微振荡5min，回收固定液； (c) 倒入2%质量分数的硝酸银溶液避光轻微振荡15min，回收硝酸银溶液； (d) 用蒸馏水漂洗2遍后，倒入显色液，所述显色液为含3%体积分数NaOH和0. 1 %体 积分数HCHO的双蒸水溶液，振荡进行显色反应，至条带清晰为止； (e) 蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统中观察电泳结果。7. 根据权利要求6所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤(6)中PCR扩增产物双向测序的过程为：根据单链构象多态性结果，挑选不同 带型的样本，每种带型挑选3个样本，PCR扩增50yL体系送至上海生工有限公司进行双向 测序，测序结果用DNAStar或DNAMan，Chromas软件分析。8. 根据权利要求7所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（7)中群体遗传学特性分析过程为：采用popgene软件对步骤（5)、（6)检测 到的SNPs位点进行群体遗传学分析，包括等位基因频率、基因型频率、纯合度、杂合度、有 效等位基因数、多态信息含量的计算，并用卡方检验来判断群体中基因型的分布是否处于 Hardy-Weinberg平衡、采用popgene软件进行X2适合性检验计算。9. 根据权利要求8所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在 于，所述步骤（8)中仔猪血清免疫指标的测定过程为：35日龄断奶仔猪空腹前腔静脉采血， 常规分离血清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm处测质量浓度分别为 1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml、15. 6pg/ml共 7 个浓度 的标准品的吸光度，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度；进而计算血清中IL-6、IL-10、 IL-12、IFN-y、TNF_a的浓度。10. 根据权利要求9所述安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征 在于，所述步骤（9)中采用的数学分析模型为：①品种间血清免疫指标的差异性分析采用 SPSS19. 0统计软件One-wayANOVA程序进行方差分析和显著性检验，试验所得数据均以 "平均数土SD"表示；②不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为=Yij = y+Bi+Gj+ey其中，Yij为免疫指标表型值；y为群体均值；Bi表示断奶仔猪的断奶批次效 应；表示第j种基因型效应；eu表示随机误差；采用SPSS19. 0统计软件GLM程序对本试 验所检测到的遗传变异与血清免疫指标的关联性进行分析。
【专利摘要】本发明公开了一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)选择对照动物模型；(2)样品采集；(3)耳组织DNA提取；(4)PCR扩增TAP1基因目的片段；(5)单链构象多态性分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)血清免疫指标的测定；(9)用数学模型分析所检测到的TAP1基因遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有效遗传标记，为安徽地方猪种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104962616
【申请号】CN201510308935
【发明人】丁月云, 殷宗俊, 薛玮玮, 朱卫华, 张晓东, 黄龙, 陈伟平, 丁冲, 张威, 吴涛, 朱树娇
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月5日