一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚a检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境分析化学领域，涉及一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]双酸A(Bisphenol A，BPA)广泛用于合成环养树脂，聚碳酸醋等多种高分子材料，随着现代包装业的快速发展，大量双酚A通过各种途径进入生态环境中，严重影响环境安全和人体健康。双酚A具有富集性，难以降解性，即使极低的浓度也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响，并与一系列癌症的发生密切相关。因此，对双酚A的检测具有重要意义。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法以及酶联免疫法等，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以广泛推广。而且传统的荧光检测法背景值较高，灵敏度较低，难以用于痕量污染物的检测。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术所存在的不足，本发明设计一种双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法，并研制检测试剂盒。
[0004]本发明所采取的技术方案是:
[0005]一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，其包括以下组分:
[0006](I)DNAl:由双酚A的核酸适体的5’端或3’端延伸至少24个碱基所形成，从5’至3’依次包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域；
[0007](2) DNA2:DNA2与DNAl的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补；
[0008](3) DNA Hl:DNA Hl上修饰有荧光基团，从5’至3’依次包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
[0009](4) DNA H2:DNA H2上修饰有荧光淬灭基团，从5’至3’依次包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；
[0010]以上DNA分子中，a、b、c区域分别与a*、b*、c*区域互补，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H I上的c和b*区域互补形成双链，从而使得DNA Hl和DNA H2两个莖环结构打开，打开后的DNA H2中的荧光淬灭基团靠近DNA Hl的荧光基团，从而把荧光淬灭。
[0011]作为优选的，所述DNA分子中，a区域的碱基数为6_9个，b区域的碱基数为12_24个，c区域的碱基数为6-9个。
[0012]作为优选的，所述DNA2中至少有9个碱基与DNAl中的双酚A核酸适体区域互补。
[0013]作为优选的，所述DNA Hl的b区域末端修饰荧光信号；DNA H2的3’和5’末端修饰荧光淬灭基团。
[0014]作为优选的，所述双酚A的核酸适体的序列为:
[0015]5’-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3，。
[0016]进一步优选的，各DNA分子的序列如下所示:
[0017]DNAl的序列为:
[0018]5’-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0019]DNA2的序列为:
[0020]5，-CTGACCACCCACCGGTTAACC-3，(SEQ ID N0.2)；
[0021]DNA Hl的序列为:
[0022]5’-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0023]DNA H2的序列为:
[0024]5，-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3，(SEQ ID N0.4)。
[0025]一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法，包括如下步骤:
[0026](I)将DNA1、DNA2分散于缓冲液中进行杂交反应；
[0027](2)将待检样品加入步骤⑴的混合溶液中，室温反应10-60分钟；
[0028](3)加入DNA Hl和DNA H2，室温反应10-60分钟；
[0029](4)检测反应体系的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中双酚A的浓度；
[0030]其中，DNAl、DNA 2、DNA Hl和DNA H2的序列组成如上任意一项所示。
[0031 ] 作为优选的，步骤⑴所述缓冲液为20mMTric_HCl缓冲液，pH 7.4，含有10mMNaCl 以及 1mMMgCl2。
[0032]作为优选的，步骤(4)检测反应体系荧光强度的条件为:激发光490nm，发射峰530nmo
[0033]双酚A核酸适体，其为如下核苷酸序列所示DNA分子或者是与其互补的核苷酸序列所不的DNA分子:
[0034]5’-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’(SEQ ID N0.5)。
[0035]本发明的有益效果是:
[0036]本发明检测方法的信号扩增源于两个茎环DNA的不断开环互补，无需使用任何蛋白酶，操作简单，可在室温下完成反应，灵敏度高、选择性好。在其中一个茎环结构DNA上同时有2个淬灭基团，可更有效地淬灭另一莖环结构DNA上的荧光基团，从而有效地减少了荧光背景，极大地提高了检测灵敏度，检测限为0.4pMo
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的检测方法的原理图；
[0038]图2为对不同浓度的双酚A测的结果图；
[0039]图3为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0041]实施例1
[0042]一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，包括以下组分:
[0043](I) DNAl，双酚A的核酸适体的5’端或3’端延伸，形成DNAl，其包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域，序列如下所示:
[0044]b*a*双酚A的核酸适体
[0045]5’ -AGTCTAGGATTCGGCGTG—GGTTAA—CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0046](2)DNA2，DNA2与DNAl的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补，序列如下所示:
[0047]a
[0048]5，-CTGACCACCCACCGG—TTAACC-3' (SEQ ID N0.2)；
[0049](3) DNA Hl，5’端第24个碱基T修饰荧光基团FAM，序列如下所示:
[0050]abcb*
[0051]5' -TTAACC—CACGCCGAATCCTAGACT—CAAAGT—AGTCTAGGATTCGGCGTG-3' (SEQ IDN0.3)；
[0052]其包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构。
[0053](4)DNA H2，5’和3’都修饰淬灭基团Dabcyl，序列如下所示:
[0054]b*a*bc*
[0055]5’ -AGTCTAGGATTCGGCGTG--GGTTAA—CACGCCGAATCCTAGACT--ACTTTG-3’ (SEQ IDN0.4)
[0056]其包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H I上的c和b*区域互补。
[0057](5)20mMTric-HCl 缓冲液(pH 7.4，含有 10mMNaCl 以及 1mMMgCl2)。
[0058]