一种单一或多重目的基因片段恒温扩增的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，属于分子生物 学领域。
【背景技术】
[0002] 环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由 Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易 检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设 计4条核心引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从 而使革巴序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(ForWardinnerprimer， FIP)和BIP(Backwardinnerprimer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列），即 5' -Flc-F2;BIP包含Blc(Bl区域的互补序列）和B2,即5' -Blc-B2。其余两条核心引 物为外引物为F3和B3。另外的两条环引物（Loopprimes,LF和LB)被增加到反应体系中 加速LAMP反应。
[0003]LAMP反应包括两个过程，即哑铃状模板合成阶段和循环扩增阶段。LAMP反应的温 度为60~65°C，该温度是双链DNA复性及延伸的中间温度，双链DNA在该温度范围内处于 半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换BstDNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区 段的3'末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前 端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出FIP引 物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。 然而由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，该单链通过5'末端的 Flc区段和F1区段互补，发生自我碱基配对，形成茎环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交 结合，以BIP引物的3'端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，B3引物 与BIP引物外侧的互补区域B3c配对结合，以3'端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互 补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA依据两端存在的互补区域，发 生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条被置换出来的DNA在两端呈现哑铃状结构，该结 构作为LAMP反应扩增循环的起始结构。LAMP反应扩增循环阶段：首先在哑铃状结构中，以 3'末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环 上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出 的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其 杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上 互补序列周而复始形成大小不一的结构。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA， 在1小时之内使产物的量达到1〇9个拷贝。
[0004]LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法 是直接在产物中加入SYBRGreenI染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可 以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性 反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳 性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只 能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对特定靶序列的特异性扩增，导致LAMP在检测目的 序列时，其结果的判定缺乏特异性。因此，传统LAMP检测很难实现对多重目的片段的同时 检测，这极大限制了LAMP的广泛应用。
[0005]鉴于上述问题，一些研宄致力于发展多重LAMP检测技术。实现多重LAMP检测最 常见的方法是在靶序列中寻找限制性内切酶酶切位点，将LAMP产物运用限制性内切酶消 化，通过电泳消化后的LAMP产物，根据不同的电泳条带大小与相应的靶序列对应。然而，该 方法需要两步完成，限制性内切酶酶切片段大小各异的LAMP产物时，耗时较长且酶切不完 全，导致一条靶序列常常对应了几条电泳条带，使得多重LAMP的结果难判断。另一种实现 多重LAMP检测的新技术是将LAMP扩增反应和焦磷酸测序结合。然而，该方法与限制性内 切酶介导的多重LAMP检测技术一样，都需要两步完成，首先是LAMP扩增，然后通过焦磷酸 测序对应到相应的靶序列。该方法操作繁琐，需要特定的试剂盒对LAMP产物进行纯化，测 序过程需要特殊人员，以及普通实验室无法负担的测序仪和测序试剂。这些劣势限制了该 方法的推广使用。此外，现存的多重LAMP检测技术都无法实现快速检测，完成多重LAMP检 测耗时大于2. 5小时。由于LAMP反应的灵敏度极高，实行LAMP产物的开盖操作对以后的 LAMP实验存在极大的污染。
[0006]综上，现有技术中的LAMP不论在单一扩增还是多重扩增的检测上都存在着难以 克服的技术问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是改进LAMP反应的原理，以LAMP反应为基础，结合限制性内切酶酶 切和荧光检测原理，建立一种操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快的一步法单一或 多重LAMP检测，以便实现LAMP技术的广泛使用。
[0008] 基于上述目的，本发明首先提供了一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测 的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] (1)自所述目的基因片段的3'端起，设定第一任意序列Flc，第二任意序列F2c和 第三任意序列F3c，自所述目的基因片段的5'端起，设定第四任意序列B1，第五任意序列B2 和第六任意序列B3 ;
[0010] ⑵提供引物EFIP，所述引物EFIP含有与序列F2c互补的序列F2,在所述序列F2 的5'端连接有与序列Flc相同的序列，在所述序列Flc5'端连接有一段限制性内切酶识 别片段；提供引物EBIP，所述引物EBIP含有与序列B2相同的序列，在所述序列B2的5'端 连接有与序列B1互补的序列Blc，在所述序列Blc5'端连接有一段限制性内切酶识别片 段；其中在引物EFIP和/或引物EBIP的5'端标记有一荧光基团，在所述被标记荧光基团 的引物中除所述限制性内切酶片段以外的其它位置标记有一荧光猝灭基团，所述荧光猝灭 基团能够猝灭所述荧光基团；
[0011] (3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、所述限制性内切酶和缓冲液存在 下，使用目的基因片段作为模板扩增DNA;
[0012] (4)检测步骤⑶的扩增结果。
[0013] 优选地，步骤（4)所述的检测为可视颜色变化检测、电泳检测、或实时荧光检测。
[0014] 步骤⑶所述链移位型聚合酶可以为BstDNA聚合酶、所述解链温度调节剂可以 为甜菜碱。
[0015] 在一个优选的技术方案中，所述步骤（2)中所提供引物还包括含有与序列F3c互 补的引物F3,和含有与序列B3相同的引物B3。
[0016] 优选地，所述步骤（2)中所提供引物还包括含有与Flc-F2c之间和Blc-B2c之间 序列互补的一对引物LF和LB。
[0017] 步骤（2)中所述扩增可以在60~66°C中进行，在一个优选的技术方案中，步骤 (2)中所述扩增是在63~65°C中进行。
[0018] 在一个优选的技术方案中，所述引物序列选自下列序列组合：
[0019] ⑴所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:4所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 5所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO: 1所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO: 2所 示，所述引物LF的序列由SEQIDNO:6所示，所述引物LB的序列由SEQIDNO:7所示；或 者
[0020] (2)所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:11所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 12所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO:8所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO:9 所示，所述引物LF的序列由SEQIDNO: 13所示，所述引物LB的序列由SEQIDNO: 14所示。
[0021] 在上述序列组合中，第（1)组组合用于Listeriamonocytogenes菌的检测，第（2) 组组合用于Listeriaivanovii菌的检测。
[0022] 优选地，所述序列组合中引物EFIP序列SEQIDN0:4标记的荧光基团为FAM，引物 EFIP序列SEQIDN0:11标记的荧光基团为HEX。
[0023] 在本发明另一个优选的技术方案中，本发明方法可以使用一种或多种以上的步骤 ⑵所述引物一次扩增相对应的目的基因片段并进行检测，其中，与每一种目的基因片段相 匹配的引物上所标记的荧光基团是不同的，并在步骤（4)的检测中显示出差异性的结果。
[0024] 优选地，所述引物序列为下列序列组合：
[0025] ⑴所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:4所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 5所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO: 1所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO: 2所 示，所述引物LF的序列由SEQIDNO:6所示，所述引物LB的序列由SEQIDNO:7所示；以 及
[0026] (2)所述引物EFIP的序列由SEQIDN0:11所示，所述引物EBIP的序列由SEQID NO: 12所示，所述引物F3的序列由SEQIDNO:8所示，所述引物B3的序列由SEQIDNO:9 所示，所述引物LF的序列由SEQIDNO: 13所示，所述引物LB的序列由SEQIDNO: 14所示。
[0027] 在上述序列组合中，第（1)组组合用于Listeriamonocytogenes菌的检测，第（2) 组组合用于Listeriaivanovii菌的检测，其中两种序列组合中所述引物EFIP序列SEQID N0:4标记的荧光基团为FAM，引物EFIP序列SEQIDNO: 11标记的荧光基团为HEX。
[0028] 另一方面，本发明还提供了一种用于扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的 试剂盒，所述试剂盒包括：
[0029] (1)自所述目的基因片段的3'端起，设定第一任意序列Flc，第二任意序列F2c和 第三任意序列F3c，自所述目的基因片段的5'端起，设定第四任意序列B1，第五任意序列B2 和第六任意序列B3时，提供引物EFIP，所述引物EFIP含有与序列F2c互补的序列F2,在