华法林个体化用药检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及核酸检测技术领域，尤其涉及华法林个体化用药检测试 剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 华法林是目前广泛应用于临床的香豆素类口服抗凝血药物，可防止血栓的形成与 发展，例如治疗血栓栓塞性静脉炎、风湿性心脏病、人工置换心脏瓣膜手术、髋关节固定术 以及降低肺栓塞的发病率和死亡率，亦可用于心肌梗死患者的辅助用药。华法林的抗凝血 效果虽强于目前批准的其它抗凝血类药物，但是由于华法林个体剂量的变动性非常大，如 不能按照个体差异用药会导致严重的抗凝不足或者药物过量引起致死性出血，这就为华法 林的临床使用带来极大的挑战。现阶段临床上在应用华法林抗凝治疗时，基本是先给予患 者一定常规剂量的药物，临床医生再根据患者的INR值不断调整药物剂量，直到患者INR达 到预期目标值。整个过程周期很长，患者需反复进行INR检测，如此又会加重患者的心理负 担。
[0003] 影响华法林作用的因素包括性别、年龄、疾病、饮食中维生素K的摄入量以及遗 传因素，近年来随着分子生物学的深入研宄发现，遗传变异是引起华法林个体应用差异 最重要的因素，其主要集中在华法林药代动力学代谢环节------细胞色素P450同工 酶2C9 (CYP2C9)和药效动力学受体环节------维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位 1 (VK0RC1)。华法林主要在肝脏中由肝微粒体CYP450酶代谢，这其中包括CYP2C9、CYP2C19、CYP2C8、CYP2C18、CYP1A2和CYP3A4,其中最为主要的是CYP2C9,其代谢物S-7-羟基华 法林提供了华法林70%的抗凝活性。研宄发现CYP2C9存在多种基因多态性，目前发现 已超过60种，但最为常见的是CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3,其它的多态性则较为罕 见。CYP2C9*2(Argl44Cys)纯合体是野生型CYP2C9*1纯合体活性的16% -20%，白种人中 CYP2C9*2突变频率高达11%，而在亚洲人群中则极为罕见；CYP2C9*3(Ile359Leu)纯合体 活性仅为野生型纯合体的4% -6%，在中国人中的突变频率可达3. 3%。因此，与具有野生 型纯合体的患者相比，携带这突变基因型的患者在服用华法林后，达到稳态所需的时间更 长，在同等给药剂量时，INR值偏高，发生危及生命的出血风险增大。VK0RC1 (维生素环氧化 物还原酶复合体亚基1)编码含有163个氨基酸残基的蛋白质，是VK0RC(维生素环氧化物 还原酶复合体）的最重要的一个组成亚基，是凝血因子II、VE、IX、X以及蛋白C、S和Z活化 的必需因素，其中，VK0RC1不仅控制着维生素K依赖性凝血因子的生成，同时也是华法林作 用的靶点，VK0RC1启动子区-1639区AA基因型携带者对发华林敏感，属于高代谢型，仅需 服用较小剂量的华法林即可达到并维持INR目标范围，而-1639GG和-1639AG携带者则对 华法林相对不敏感，需要较大剂量华法林才可以达到预期的INR范围。CYP2C9和VK0RC1两 个基因的多态性与华法林的个体化治疗最为密切相关，通过对目标患者进行基因检测，确 定其基因类型，即可通过固定的公式计算或者按照FDA推荐的剂量服用华法林，短时间内 即可达到临床规定的INR值范围。
[0004] 目前检测CYP2C9和VK0RC1基因型的方法主要是直接测序法，另外也有高温连接 酶法等。但这两种方法都需要DNA测序仪配合使用，DNA测序仪价格昂贵，多为外国企业所 垄断，不利于国内基础研宄和广大医疗机构的配备。此外，DNA测序仪对操作人员的要求很 高，需定期维护，相关操作人员必须进行严格培训才能上岗，测试步骤繁琐。直接测序法需 要PCR产物纯化、测序引物设计、测序反应PCR的纯化、测序反应化学类型选择等等一系列 繁琐又易出错的步骤，不易推广使用。且上述两种方法测试时间较长，直接测序法最快八个 小时，高温连接酶法最快要五个小时。
[0005]双向等位基因特异性PCR(Bidirectional Allele-specific PCR，Bi_ASPCR)是等 位基因特异性PCR (Allele-specific PCR)的一种发展应用，Bi-ASPCR采用四条引物，分别 是两条外侧引物和两条等位基因特异性的内侧引物，在检测时，每一条等位基因特异性的 引物配合一条外侧引物进行扩增，可以同时从两个方向检测同一个位点，与此同时，两条外 侧引物还可以扩增待测模板，作为阳性对照。因此，用Bi-ASPCR法检测CYP2C9和VK0RC1， 对指导华法林用药意义重大。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的问题是现有的检测CYP2C9和VK0RC1基因型的方法成本较高，操 作复杂，需要的测试时间长。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供华法林个体化用药检测引物，其包括以下引物对：
[0008] (1) CYP2C9*2位点第一轮PCR
[0009]上游引物：5' -CTGTCTACTTTCCTAGCTCTCAAAGG-3' (SEQ ID No. 1)，
[0010]下游引物：5，-GATAGGGCCAITCCCACCATGITG-3' （SEQ ID No. 2);
[0011] (2) CYP2C9*2位点第二轮PCR
[0012]上游引物：5，-TTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAA-3，（SEQ ID No. 3)，
[0013]下游引物：5，-TGGGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3' （SEQ ID No. 4)，
[0014]突变型特异引物：5，-AAGAGGAGCATTGAGGCCT-3' (SEQ ID No. 5)，
[0015]野生型特异引物：5' -CGGGCTTCCTCTTGAACCCG-3' (SEQ ID No. 6);
[0016] (3) CYP2C9*3位点PCR
[0017]上游引物：5，-TCTGGITTATGGCAGTTACACA-3，（SEQ ID No. 7)，
[0018]下游引物：5' -GGGACTTCGAAAACATGGAGT-3' （SEQ ID No. 8)，
[0019]野生型特异引物：5' -GCACGAGGTCCAGAGATGCA-3' (SEQ ID No. 9)，
[0020]突变型特异引物：5，-GGTGGGGAGAAGSTCCAG-3，（SEQ ID No. 10);
[0021] (4)VK0RC1-1639位点第一轮PCR
[0022]上游引物：5' -ATTCATGCAGGGACATCTTTGGTG-3' (SEQ ID No. 11)，
[0023]下游引物：5，-TCCTCTCCCGGCATTATCCCATC-3，（SEQ ID No. 12);
[0024] (5) VK0RC1-1639位点第二轮PCR
[0025]上游引物：5，-CCAGCAGGAGAGGGAAATATCAC-3' （SEQ ID No. 13)，
[0026]下游引物：5，-ACCAAGAYGCTAGACCCAA-3，（SEQ ID No. 14)，VK0RC1-1639位点A 第二轮PCR特异引物：
[0027] 5，-GACCTGAAAAACAACCATTGGACA-3，（SEQ ID No. 15)，VK0RC1-1639位点G第二 轮PCR特异引物：
[0028] 5，-CGTGAGCCACCGCAACC-3，（SEQIDNo. 16)。
[0029] 本发明的第二个目的在于提供一种华法林个体化用药检测试剂盒。所述试剂盒包 括上述的引物。
[0030] 进一步地，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液，Taq酶，dNTP，DNAladder Marker。
[0031] 进一步地，使用时，所述各引物的浓度均为10uM;dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的混合物，所述dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为2. 5mM。
[0032] 本发明的第三个目的在于提供华法林个体化用药检测方法，其使用上述的试剂 盒，包括以下步骤：
[0033] (1)第一轮 PCR
[0034] 以待检测的核酸为模板，分别对CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VK0RC1-1639位 点进行第一轮PCR处理，得到的产物分别记为M、B和N;
[0035] (2)第二轮 PCR
[0036] 将M稀释100倍后作为模板，对CYP2C9*2位点进行第二轮PCR处理，其产物记为 A；
[0037] 以N稀释100倍后作为模板，对VK0RC1-1639位点进行第二轮PCR处理，其产物记 为C;
[0038] (3)电泳
[0039] 将步骤⑴中得到的B、步骤⑵中得到的A和C进行凝胶电泳，将得到的电泳图 与相应的标准进行对照。
[0040] 进一步地，所述步骤（1)中对CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VK0RC1-1639位点 进行第一轮PCR处理的条件为：
[0041] (a) 95°C 下 4min;
[0042] (b)95°C下 30s，60°C下 15s，72°C下 30s，循环 35 次。
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