用于卷烟烟气总粒相物细菌回复突变性的检测方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明涉及卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法，属于烟草及烟草制品烟气安全性 生物学评价技术领域。
[0002]
【背景技术】： 现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B.N.Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）被世界各 国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂，食品包装材料及化妆品等 的致突变性的首选试验[1-3]。国际烟草科学研宄合作中心C0RESTA组织于2002年成立了 卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研宄工作，该工作组推荐采 用细菌回复突变试验（Ames试验）分别对受试物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目 前已经被国内外烟草公司广泛采用。
[0003] 自Ames检测体系建立以来，不断有学者对其进行了各方面的改进，Ames试验的 准确性、有效性也得以不断提高。但至今该试验仍存在一些的不确定性因素，例如被检测体 系中的组氨酸及其前体物（如多肽，蛋白质等）的量对Ames试验结果存在重要影响，因 为它们可以支持his-缺陷型细胞生长和分裂，增加最终回复子菌落数，从而造成假阳性； Ames试验所用的沙门氏菌属于原核生物缺少代谢活化系统，故Ames试验中需加入S9混合 液作为代谢活化系统，该活化体系活性的强弱可能会对试验结果产生影响；除此之外，由于 Ames试验是对产生回复突变的菌落数进行计数，检测使用菌的量过低可能会导致受试物诱 变能力表现不完全。食品安全性毒理学评价程序中[1]中对组氨酸浓度设定为〇.5mmol/L， S9混合液浓度为10% (V/V)，受试菌浓度为不少于1X109个/ml-2X10 9个/ml，用上述 反应体系检测卷烟烟气总粒相物，在自发回变菌落数与阳性对照组均正常时，受试物检测 所得剂量-效应曲线的线性关系不佳。这可能是由于以上试验体系在组氨酸、S9混合液、 受试菌浓度这三个重要参数的设定上对组氨酸和S9混合液的使用浓度给定了一个确定的 值，而在对受试菌的使用量上只对使用量的下限进行了限定，当受试菌浓度过高时可能会 对检测结果产生影响。
[0004] 重要参考文献： 1.中华人民共和国卫生部.GB15193-2014食品安全性毒理学评价程序[S]。
[0005] 2.中国食品药品监督管理局.YY/T0127. 10-2009 口腔医疗器械生物学评价第2单 元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）[S]。
[0006] 3.中华人民共和国卫生部.GB7919-87化妆品安全性评价程序和方法[S]。
【发明内容】
： 本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种用于卷烟烟气总粒相物细菌回复 突变的检测方法。
[0007] 本发明针对上述技术问题，对组氨酸浓度、S9浓度、菌浓度三个重要因素进行了综 合研宄，研宄结果表明三个影响因素之间存在协同作用，并不是在某个限量范围内对三个 因素进行任意组合就能得出较好结果。
[0008] 本发明对试验体系中组氨酸浓度、S9浓度、菌浓度三个重要试验因素参数组合进 行了改进，具体为： 组合1 :组氨酸浓度为lmmol/L、S9浓度为10% (V/V)、菌液0D6(KI下吸光值为2. 0X10 9 个/ml〇
[0009] 组合2:组氨酸浓度为0? 5mmol/L、S9浓度为20% (V/V)、菌液0D6QQ下吸光值为 2.0Xl〇Y/ml〇
[0010] 本发明方法与现有技术方法相比，优点在于：综合考察了三个重要参数之间的协 同作用，而不是单一的对某个参数进行调整，即保证了试验的灵敏度，也能够使剂量效应关 系在所检测剂量范围内呈现较好的线性关系。在降低假阳性率的同时准确的反映受试物的 致突变性。
[0011]
【具体实施方式】： 下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不是对本发明的限制。
[0012] 实施例一： 用于肯塔基参比卷烟3R4F卷烟烟气冷凝物致突变性的检测 1.卷烟烟气总粒相物（TPM)的制备 参照中华人民共和国国家标准GB/T19609 -2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒 相物和焦油》制备样品，样品浓度为l〇mg/ml。
[0013] 2.底层培养基的配制 遵照GB15193. 4-2014《食品安全性毒理学评价程序和方法》中鼠伤寒沙门氏菌试验标 准配制。
[0014] 3.顶层培养基的配制 遵照GB15193. 4-2014食品安全性毒理学评价程序和方法中鼠伤寒沙门氏菌试验标准 配制。
[0015] 4?增菌培养 取适量营养肉汤培养基加入到无菌三角瓶中，将TA98菌株接种于营养肉汤培养基中， 于37°C条件下振荡（100次/min)培养10h。
[0016] 5?受试菌浓度确定 采用涂抹平板计数法对受试菌浓度进行确定。
[0017] 6.TPM剂量设定 TPM检测剂量包含5个非零剂量：25yg/皿、50yg/皿、100yg/皿、125yg/皿、 200yg/ 皿。
[0018] 7.阳性对照、未处理组（自发回变）和溶剂对照的设定 选择2-氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为10yg/皿； 未处理组仅加入0.lml新鲜菌液，测定其自发回复突变菌落数。
[0019] 溶剂对照组加入二甲基亚砜，剂量为20 y 1/皿； 8.S9混合液的配制 遵照GB15193. 4-2014食品安全性毒理学评价程序和方法中鼠伤寒沙门氏菌试验标准 进行制备。
[0020] 9?平板掺入 采用正交试验法考察组氨酸含量、菌浓度、S9浓度这3个因素的4个水平不同组合条 件对Ames试验的影响，分别于表1中的16个试验参数组合条件下进行检测： 表1Ames试验影响因素正交试验检测参数
采用直接平板掺入法，于约2.Oml的顶层培养基中加入相应浓度的新鲜菌液0.lml、S9 混合液0. 5ml和待检测样品，在涡旋混合器上混匀，倒入底层培养基上，转动培养皿使其均 匀分布在底层培养基上，待其凝固后放入37°C培养箱中培养48h。每个剂量做三个平行皿。
[0021] 10?培养观察 对培养基上长出的回复菌落数进行计数。
[0022] 11?结果判定 自发回变菌落数应在30-50个之间且阳性对照组菌落数应在1000个以上，表明测试体 系正常。在检测体系正常的前提下，受试物的回复突变菌落数如大于自发回变菌落数2倍 以上，并且有剂量反应关系，则可认为该受试诱变试验结果呈阳性。
[0023] 本实验室经过改进上述反应体系后对卷烟烟气总粒相物的致突变性进行了检测， 结果见表2。
[0024] 表2不同组合试验参数下对卷烟烟气总粒相物Ames试验检测结果
由以上试验结果可以看出，以上16个测试体系方案中满足自发回变菌落数应在30-50 个之间且阳性对照组菌落数应在1000个以上条件仅有4个(方案1、方案2、方案5、方案6 )， 其中方案1测试体系产生阳性结果最低剂量高于方案2、方案5、方案6测试体系检测结果。 方案2、方案5、方案6测试体系检测结果剂量效应关系较好的为方案2和方案6,即检测体 系中组氨酸浓度、S9浓度、菌浓度三个重要试验因素参数组合为： 组合1 :组氨酸浓度为lmmol/L、S9浓度为10% (V/V)、菌液0D6(KI下吸光值为2. 0X10 9 个/ml〇
[0025] 组合2 :组氨酸浓度为0? 5mmol/L、S9浓度为20% (V/V)、菌液0D6QQ下吸光值为 2.0Xl〇Y/ml〇
[0026] 在本发明方法优化的组氨酸浓度、S9混合液浓度以及受试菌浓度的组合条件下， 烟气总粒相物在25-200 yg/皿的检测剂量范围内，呈现良好的剂量反应关系。方案5的检 测条件虽然满足GB15193. 4-2014标准中组氨酸浓度为0. 5mmol/L，S9混合液浓度为10%(V/ V)，受试菌浓度为不少于1 X 109个/ml-2 X 10 9个/ml的条件设定，但检测得到的剂量-效 应曲线的线性程度较低。
[0027] 本发明的方法综合考察了三个重要参数之间的协同作用，而不是单一的对某个参 数进行调整，即保证了试验的灵敏度，也能够使剂量效应关系在所检测剂量范围内呈现较 好的线性关系。
【主权项】
1. 一种用于卷烟烟气总粒相物细菌回复突变性的检测方法，其特征在于：在进行卷烟 烟气总粒相物细菌回复突变试验测试体系中，采用如下三个重要参数的组合： 组合1 :组氨酸浓度为lmmol/L、S9浓度为10% (V/V)、菌液OD6tltl下吸光值为2. OX 10 9 个/ml ; 或者，组合2 :组氨酸浓度为0. 5mmol/L、S9浓度为20% (V/V)、菌液0D_下吸光值为 2. OX IO9个/ml 〇
【专利摘要】本发明涉及用于卷烟烟气总粒相物细菌回复突变性的检测方法，属于烟草及卷烟烟气安全性评价技术领域。在卷烟烟气总粒相物细菌回复突变性的检测体系中采用如下三个重要参数的组合：组合1：组氨酸浓度为1mmol/L、S9浓度为10%（V/V）、菌液OD600下吸光值为2.0×109个/ml。组合2：组氨酸浓度为0.5mmol/L、S9浓度为20%（V/V）、菌液OD600下吸光值为2.0×109个/ml。本发明的优点在于：综合考察了三个重要参数之间的协同作用，而不是单一的对某个参数进行调整，即保证了试验的灵敏度，也能够使剂量效应关系在所检测剂量范围内呈现较好的线性关系。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN104962604
【申请号】CN201510463956
【发明人】管莹, 夭建华, 李雪梅, 米其利, 倪红梅, 高茜, 朱洲海, 唐萍
【申请人】云南中烟工业有限责任公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月31日