专利名称：一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，更具体地涉及一种基于荧光淬灭原理的免疫检测方法。
背景技术：
在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已经以“双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通常作法是将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原 (目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但液体与固体之间非均相反应的缺陷常常导致反应不够均勻以及反应不够快速。中国专利申请CN200510030659. 2公开了一种免疫胶体金粒子荧光淬灭的测量方法，该方法包括将目标物即被测物的抗体或抗原连接在微小颗粒或微孔上形成固相载体， 加入被测样品，再加入过量胶体金标记物，样品中的目标物与固定在微颗粒或微孔板上的抗体或抗原进行免疫反应，形成抗原抗体的固相载体复合物即结合物，及未反应的胶体金标记物即游离物，分离结合物与游离的胶体金标记物，在游离物中加入荧光物质，使得荧光信号淬灭，信号淬灭的程度与体系中游离的金标记物量相关，游离物的量与目标物的量相关，从而对目标物进行定量检测。然而，该方法的荧光淬灭的机制都是共振能量转移，要求荧光基团与淬灭剂基团必须近距离(<20nm)接触且共混于一个溶液体系。此外，该方法仍然存在流程不易自动化、荧光物质无法重复使用、和成本偏高等缺点。因此，本领域迫切需要开发一种操作简便(例如，不必洗涤)，并且反应均勻和/或快速的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在检测过程中不必人工洗涤、操作简便且反应均勻和 /或快速的检测方法。在本发明的第一方面，提供了一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，包括步骤
(a)提供一检测溶液和一荧光物质溶液，其中所述的检测溶液和一荧光物质溶液是相互独立的，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(b)将待测物或含待测物的样品加入检测溶液，从而形成“第一结合物-待测物”二元复合物；
(C)将针对所述的待测物的第二结合物加入步骤(b)的检测溶液中，从而形成“第一结合物-待测物-第二结合物”三元复合物，其中所述的第一结合物和第二结合物可同时结合于所述待测物；
(d)从步骤(C)的检测溶液中捕获或分离出所述的三元复合物，从而使得所述三元复合物与检测溶液的液相分开；
(e)用可激发荧光物质产生荧光的光线照射步骤(d)检测溶液，使得所述光线透过检测溶液并照射到与检测溶液相互独立的荧光物质溶液，从而使得荧光物质溶液产生荧光； 和
(f)检测步骤(e)产生的荧光，从而确定待测物存在与否和/或数量。在另一优选例中，所述的待测物包括蛋白、核酸。在另一优选例中，所述的待测物是肿瘤标志物、病毒蛋白等。在另一优选例中，所述肿瘤标志物选自下组甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CAM2)、癌抗原(CA15-3)、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。在另一优选例中，所述的荧光物质选自下组荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5_ 二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合。在另一优选例中，所述的淬灭剂为胶体金。在另一优选例中，所述的淬灭剂是平均粒径为10-70nm的胶体金颗粒。在另一优选例中，在步骤(f)中，检测荧光物质溶液产生的且透射通过所述检测溶液的荧光。在另一优选例中，在步骤(f)中还包括将荧光的测量值与标准曲线或对照进行比较，从而确定待测物的数量。在另一优选例中，所述的待测物是抗原，且所述的第一结合物和第二结合物是可同时结合于所述抗原的抗体。在另一优选例中，所述的待测物是抗体，所述的第一结合物是可与所述抗体结合的抗原，而所述的第二结合物是针对所述检测物(抗体)的抗体，反之亦然。例如，当待测物是某种人抗体时，第一结合物是该人抗体所针对的抗原，而第二结合物是抗该人抗体的鼠源或兔源抗体。在另一优选例中，所述的光线是激光器产生的。在另一优选例中，在步骤(e)中，所述的可激发荧光物质产生荧光的光线，透射通过检测溶液的光程为0. 1-50厘米。在另一优选例中，所述的光程为0. 5-10厘米，更佳地为1. 0-5. 0厘米。在另一优选例中，所述的方法还包括用已知浓度的待测物标准品进行测量，从而制作标准曲线的步骤。在本发明的第二方面，提供了一种用于检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析检测装置，所述的装置包括
(a)第一容器，所述的第一容器用于放置检测溶液，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物；
(b)第二容器，所述的第二容器用于放置荧光物质溶液，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；
(C)用于产生激发光线的光源，所述的光源可发出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激发光线，从而使得所述荧光物质产生荧光；和 (d)用于检测荧光的检测器。在另一优选例中，所述的光源是激光器。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
图1显示了本发明方法的基本原理。图2显示了在本发明方法中，标记了淬灭剂的抗体与目标蛋白形成“二元复合物” 的步骤。图3显示了在本发明方法中，加入适量的经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体，从而形成“夹心复合物”的步骤。图4显示了在本发明方法中，采用适宜的方法将捕获抗体及含捕获抗体的“夹心复合物”分离去除后进行检测的步骤。图5显示了本发明一个实例中得到的标准曲线，其中χ轴为浓度(单位ng/ml)，y 轴为F1VFcm的比值(i=l 5)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于荧光淬灭原理的液溶胶均相免疫反应体系和检测方法。在本发明的检测方法中，荧光物质与淬灭剂不接触，完全相互独立地分开，从而使得本发明提供的免疫分析方法具有极其显著的优点，其中包括反应在液溶胶均相反应体系中进行，因此反应均勻迅速；全过程无需洗涤；可根据实际需要方便地调节检测灵敏度，且定量准确；荧光物质重复使用，降低了试剂成本。检测方法
技术领域：
本发明检测方法的基本原理如图1所示。左侧图中目标检测物的紫外可见吸收光谱与荧光物质的激发或荧光光谱重叠，则激发光和荧光被吸收，荧光被淬灭，此时的荧光强度计为你，该目标检测物为该荧光物质的淬灭剂；
若右侧图中淬灭剂的浓度为0或相对减少，则对荧光物质的淬灭程度降低，荧光较增强，记为Fl ；
根据Beer-Lambert定律，在淬灭剂浓度一定的情况下，增加液层的厚度，透光率降低， 则淬灭程度增加，对淬灭剂的检测灵敏度将随之提高。接着，结合图2、3和4，进一步阐述本发明的一个定量检测目标蛋白实例的各步
马聚ο图2显示了标记了淬灭剂的抗体(第一抗体)与目标蛋白形成“二元复合物”的过程。具体地，在图2中，Stdl 5是检测目标蛋白的标准系，Stdl中没有目标蛋白，未形成“二元复合物”。随着目标蛋白的浓度逐渐增加， 5中“二元复合物”的数量随之增加，但其中淬灭剂的量并未改变。图3显示了加入适量的经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体(第二抗体)，形成“夹心复合物”。具体地，在加入了针对目标蛋白的、可分离的捕获抗体(第二抗体)后， 在反应体系中形成“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元的“夹心复合物”。一种特别优选的可分离的捕获抗体是与磁性微球偶联的捕获抗体。该捕获抗体可通过磁场进行分离。另一类特别优选的可分离的捕获抗体是与生物素偶联的捕获抗体。该捕获抗体可通过生物素-亲和素的结合而进行分离。图4显示了采用适宜的方法将捕获抗体及含捕获抗体的“夹心复合物”分离去除后进行检测。与图2进行对比，随着目标蛋白量的增加， 5中标记了淬灭剂的抗体随之减少，荧光淬灭减弱，相应地荧光信号依次增强。在另一优选例中，本发明方法中还包括制作标准曲线，并将检测结果与标准曲线进行比较，从而获得测量值。例如，标准曲线的制作可采用以下方法
将对应于目标蛋白标准曲线的第一个数据点的标准溶液与标记了淬灭剂的抗体混勻 (形成“目标蛋白-标记淬灭剂的第一抗体”的二元复合物)，加入图2所示上方容器中 (Stdl)(该上方容器与下方含荧光物质溶液容器是相互独立或分离的)，并确保激发光能透过该上方容器照射到下方的荧光物质溶液，测定荧光强度，记为Fch1 ；
向所述上方容器的溶液中加入经标记修饰后具备捕获和分离功能的抗体(例如，连于磁性纳米颗粒的二抗)(见图3的Ml) ”，从而形成“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元的“夹心复合物”。在该过程中，但溶液体积保持或基本保持不变；
使“标记淬灭剂的第一抗体-目标蛋白-可分离的第二抗体”三元复合物与溶液完全分离，并使溶液返回“2. 2.1”下第1步的容器中(图4 Stdl)，测定荧光强度，记为Fh ； 计算F1V Fch1的比值；
同样操作，分别得到目标蛋白标准系其他点Fw/ ^^(1=2-5)的比值，以标准系各点浓度值对F1V、力=1 5)比值作图，得到标准曲线。应理解，为了方便起见，在附图中将第一容器和第二容器的位置画为上方容器和下方容器，然而第一容器和第二容器也可以水平放置或倾斜放置。同样操作，得到样本的F1/ Ftl，代入标准曲线计算得出样本中目标蛋白的含量。荧光物质
可用于本发明的荧光物质没有特别限制，激发或发射光谱与淬灭剂(如胶体金)的可见吸收光谱全部或部分重叠的荧光物质均适用于本发明提供的检测方法。代表性的荧光物质包括(但并不限于)荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4， 5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合，只要所述荧光物质的激发或发射光谱与淬灭剂的吸收光谱重叠(或部分重叠)即可。淬灭剂
如本文所用，术语“淬灭剂”和“淬灭剂”可互换使用，都指可衰减荧光物质所发射荧光的物质。
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针对待测物的结合物(如抗体)可用各种本领域已知的淬灭剂进行标记。可用于本发明的淬灭剂没有特别限制，代表性的淬灭剂包括(但并不限于)胶体金。一种特别优选的淬灭剂是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。应理解，荧光物质与淬灭剂宜相互对应。例如，当选用藻红蛋白(PE)时，因其最大发射波长为575nm，与30nm胶体金的吸收光谱部分重叠，因此可以将藻红蛋白与30nm胶体金配对使用。在另一优选例中，本发明优选胶体金进行标记，其中胶体金标记方法是本领域的成熟技术。捕获抗体和固相载体
本领域通常是将捕获抗体固定于固相载体，从而使该捕获抗体具备分离“夹心复合物” 的功能，常用的固相载体有玻片、膜片、酶标板和各种微球。也可将捕获抗体用生物素(biotin)标记，形成“夹心复合物”后再与链亲和素 (Streptavidin)包被的固相载体结合，从而具备分离的功能。在本发明中，优选的固相载体是纳米级或亚纳米级的微球或微颗粒。通常，其平均粒径小于200nm，较佳地小于150nm，更佳地小于150nm。代表性的微球或颗粒包括(但并不限于)磁性微球、聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、玻璃微球、聚丙烯微球、硅橡胶微球、纤维素微球、交联葡聚糖微球、或其组合。光源
在本发明方法中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。在本发明中，可选用任何可以提供合适波长的光源。一种优选的光源是激光光源。 激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器例子包括(但并不限于)光纤激光器等。半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、光纤激光器。还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。在优选例中，光源提供的光线宜包含荧光物质的激发波长，或者与荧光物质的激发波长相同或几乎重叠。激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表
权利要求
1.一种检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析方法，其特征在于，包括步骤(a)提供一检测溶液和一荧光物质溶液，其中所述的检测溶液和一荧光物质溶液是相互独立的，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；(b)将待测物或含待测物的样品加入检测溶液，从而形成“第一结合物-待测物”二元复合物；(c)将针对所述的待测物的第二结合物加入步骤(b)的检测溶液中，从而形成“第一结合物-待测物-第二结合物”三元复合物，其中所述的第一结合物和第二结合物可同时结合于所述待测物；(d)从步骤(c)的检测溶液中捕获或分离出所述的三元复合物，从而使得所述三元复合物与检测溶液的液相分开；(e)用可激发荧光物质产生荧光的光线照射步骤(d)检测溶液，使得所述光线透过检测溶液并照射到与检测溶液相互独立的荧光物质溶液，从而使得荧光物质溶液产生荧光；(f)检测步骤(e)产生的荧光，从而确定待测物存在与否和/或数量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测物包括蛋白、核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光物质选自下组荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5_ 二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的淬灭剂为胶体金。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中，检测荧光物质溶液产生的且透射通过所述检测溶液的荧光。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中还包括将荧光的测量值与标准曲线或对照进行比较，从而确定待测物的数量。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测物是抗原，且所述的第一结合物和第二结合物是可同时结合于所述抗原的抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述的可激发荧光物质产生荧光的光线，透射通过检测溶液的光程为0. 1-50厘米。
9.一种用于检测待测物存在与否和/或数量的免疫分析检测装置，其特征在于，所述的装置包括(a)第一容器，所述的第一容器用于放置检测溶液，所述检测溶液中含有标记有淬灭剂的、针对所述的待测物的第一结合物；(b)第二容器，所述的第二容器用于放置荧光物质溶液，所述的荧光物质溶液中含有在受到激发光线照射时能够产生荧光的荧光物质；(c)用于产生激发光线的光源，所述的光源可发出透射所述第一容器并照射到所述第二容器的激发光线，从而使得所述荧光物质产生荧光；和(d)用于检测荧光的检测器。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于，所述的光源是激光器。
全文摘要
本发明提供了一种基于荧光淬灭原理的免疫反应分析方法。具体地，本发明提供了一种在荧光物质与淬灭剂相互独立且不接触情况下，进行免疫检测的方法，本发明方法的免疫反应在液溶胶均相反应体系中进行，因此反应均匀迅速、全过程无需洗涤、可调节检测灵敏度、定量准确、荧光物质可重复使用等优点。
文档编号G01N33/542GK102401829SQ20101028458
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者周晓燕, 李久彤 申请人:庞磊, 李久彤