使用荧光淬灭和/或漂白分析个体细胞或微粒的方法及设备的制作方法

专利名称：使用荧光淬灭和/或漂白分析个体细胞或微粒的方法及设备的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于分析血液样本的设备和方法，具体地讲，涉及用于检测、识 别和计数样本内的诸如细胞或微粒之类的组分的设备和方法。
背景技术：
内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组分 的数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常组分。通常被测量、定量和识 别的组分包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。RBC分析可以包括确定RBC数目、大 小、体积、形状、血红蛋白含量和浓度、以及血细胞比容(也被称为红细胞压积)。RBC分析还 可以包括确定红细胞(诸如DNA，RNA)内是否存在某些成分和/或确定这些成分的浓度，包 括检测RBC中是否存在和/或存在多少血液寄生虫(例如疟原虫)或者检测WBC中是否存 在和/或存在多少细胞外的或利什曼原虫组织的睡病虫，以及检测是否存在和/或存在多 少其他血液寄生虫。WBC分析可以包括确定WBC子类型的族群(population)频率，通常称 为分类WBC计数，以及通知任何在健康的受试者中没有发现的异常细胞类型。血小板(或 者在包括鸟、爬行动物和鱼的某些动物中为凝血细胞(thrombocyte)，该凝血细胞在功能上 类似于哺乳动物的血小板，但是比哺乳动物的血小板大约10倍且是有核的)分析可以包括 对血小板数目、大小、形状结构和体积的确定，包括确定样本中是否存在血小板或凝血细胞 的凝块。在诸如Wintrobe，s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已 知的血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。手动方法通常涉及产生 精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在计数室中被直观 计数。手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外周涂片。离心检查 方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个组分层。可以给组分 层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及检查根据被测量的微粒而处理的血液的 精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中体积(volumetrically)稀释样 本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或电压，以确定当微粒以单行通 过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束入射到以单行通过的微粒的光的 强度和散射角的分析。还可以使用流式细胞测定法，该方法涉及利用附着于针对细胞或微 粒类型上存在的表面抗原决定簇的抗体的荧光基团给悬浮中的感兴趣的微粒染色、用适当 波长的光激发染色微粒、以及分析各个微粒/细胞的发光(emission)。除了外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样本 体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要求对仪 器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许多方法产 生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。另外，上述方法不适于确定其中红细胞和凝 血细胞有核的鸟、爬行动物和鱼中的以及其中红细胞尺寸非常小并且可能与血小板混淆的 某些哺乳动物中的全血计数(CBC)。可以通过检查人类或动物的血液确定的信息量是巨大的。确定RBC指数尤其有 用；例如，单个细胞大小、单个细胞血红蛋白含量和浓度、以及样本内的RBC的族群统计。如 上述引用的Wintrobe的文献中的讨论所表明，对于上述参数中的每种参数的平均和离差 统计(例如，变异系数)还可以提供重要信息，这已经使得外科医生能够对RBC紊乱进行更 好地分类。

发明内容
提供一种用于分析静止的血液样本内的组分的方法及设备。根据本发明的一个方 面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步骤a)提供具有一个或多个第 一组分以及一个或多个第二组分的基本上未稀释的血液样本，其中，第二组分与第一组分 不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和 第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一 组分和第二组分在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或 多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分 的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和 第二组分的荧光发射以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；f)使用图像信号，确 定第一组分和第二组分中的每一组分的荧光值；g)使用图像信号，确定第一组分和第二组 分中的每一组分的光密度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定 的荧光值和光密度值来识别第一组分和第二组分。根据本发明的另一方面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步 骤a)提供具有一个或多个第一微粒以及一个或多个第二微粒的基本上未稀释的血液样 本，其中，第二微粒与第一微粒不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分 析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合 到样本中，该染色剂用于使第一微粒和第二微粒在暴露于预定的第一波长的光时发出荧 光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的 光照射包含第一微粒和第二微粒的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成 像，包括产生表示来自第一微粒和第二微粒的荧光发射以及第一微粒和第二微粒的光密 度的图像信号；f)使用图像信号，确定第一微粒和第二微粒中的每一微粒的一个或多个荧 光发射值；g)使用图像信号，确定第一微粒和第二微粒中的每一微粒的一个或多个光密度 值，该光密度是微粒所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定的荧光发射值和光密度值 来识别第一微粒和第二微粒。根据本发明的又一方面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步 骤a)提供具有一个或多个第一组分以及一个或多个第二组分的基本上未稀释的血液样 本，其中，第二组分与第一组分不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；C)将染色剂掺合 到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定波长的光时发出荧光；d)以 恒定方式用所述波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分一段时间；e) 在该段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分成像，并且产生表示针对每个分立 时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；f)使用针对每个分立时间点 的图像信号，确定静止地置于样本内的第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧 光发射值，以及针对第一和第二组分中的每一组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变 化率；以及g)使用所确定的第一和第二组分中的每一组分的荧光发射值的变化率来识别 第一组分和第二组分。本发明的一个优点在于本发明可以用来利用极少的样本量来确定血液样本的特 性，该极少的样本量可以通过毛细管穿刺从病人直接获得，从而使得本发明对现场护理应 用更加有用，或者可以根据需要从静脉样本获得该极少的样本量。本发明的方法的另一个优点在于其对于外部和内部流体都适用，并且与重力和方 位无关，因此该方法适于用在手持式设备中和微重力条件下。通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加显 然。


图1至图4是可用在本发明的方法中的分析腔室的截面示意图。图5是具有多个分析腔室的条带的示意平面图。图6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面图。图7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面图。图8是可与本发明的方法一起使用的分析设备的示意图。图9是用图解法示出针对中性粒细胞的作为时间的函数的荧光衰减量的图表。图10是用图解法示出针对淋巴细胞的作为时间的函数的荧光衰减量的图表。
具体实施例方式本发明的方法利用了分析腔室，该分析腔室可用于静止地保持基本上未稀释的抗 凝全血样本以进行分析。该腔室的典型大小可以保持大约0. 2至1. 0 μ 1的样本，但是该腔 室不限于任何特定的体积容量，该容量可以为适应分析应用而改变。在此使用的术语“基本 上未稀释的”表示根本未被稀释的血液样本或者未被故意稀释的血液样本，但是为了进行 分析，可以对血液样本添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂添加对样本稀释的程 度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。通常，将在执行本发明的方法 过程中使用的试剂只有抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)和染色剂。这些试剂通常以干粉形式 来添加，其目的是不稀释样本。在某些情况下(例如，非常快速的分析)，不必添加抗凝血 剂，但是在大多数情况下优选的是添加抗凝血剂以确保样本处于分析可接受的形式。术语 “静止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔 室故意移动；即，样本静止地处于腔室内。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样本的 形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。
掺合到血液样本的至少一部分中的染色剂(colorant)(例如，染料、着色剂等)有 助于对吸收该染色剂的组分(例如，WBC和其他包含细胞的核，包括血小板的微粒，其他包 含DNA和/或RNA的组分-例如，细胞内或细胞外的血液寄生虫-等)的定量分析。细胞和 微粒可以统称为样本内的“组分”。当被某些波长(例如，大约470nm)的光激发时，染色剂发 出特征波长(例如，530nm、585nm和660nm)的荧光。细胞将要发出的荧光的特定波长是该 细胞和激发光的波长的特性。作为细胞内的染色剂的浓度的函数，染色剂还吸收一个或多 个预定波长的光。可接受的染色剂的示例包括体外活体染料吖啶橙和astrozone orange. 然而，本发明不限于体外活体染料。现在参照图1，分析腔室10由具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第 二平板16限定。平板12、16都是足够透明的，以使得能够传输通过足量的预定波长的光， 以执行如下所述的光密度分析。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内，内表 面14和内表面18彼此间隔开高度20，该高度可以是已知的或者是可测量的。所示出的RBC 22置于腔室10内。本发明的方法可以利用具有上述特性的各种不同的分析腔室类型，因此不限于任 何特定类型的分析腔室。具有平行的平板12、16的分析腔室简化了该分析，因此是优选的， 但是并不是本发明所必需的；例如，可以使用这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于 另一个平板成已知的非平行角度布置。现在参照图2至图5，示出了一个可接受的腔室10的示例，该腔室10包括第一平 板12、第二平板16、以及至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离物沈可 以是可布置在平板12和平板16之间的可用于将平板12和平板16彼此分隔的任何结构。 在平板12和平板16之间延伸的隔离物沈的尺寸28在此被称为隔离物沈的高度28。隔 离物26的高度观通常不精确地彼此相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业上可接受 的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个示例，并且 商业上可从例如 Bangs Laboratories of Fishers, Indiana, U. S. Α.获得。在图3所示的腔室实施例中，隔离物沈由弹性大于第一平板12和第二平板16中 的一个或者两个的材料组成。从图3可以看出，较大的隔离物沈被压缩到大多数隔离物 26接触平板12、16的内表面14、18的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平均的隔离物 26的直径。在图4所示的腔室实施例中，隔离物沈由弹性小于第一平板12和第二平板16 中的一个或两个的材料组成。在图4中，第一平板12由比球状隔离物沈和第二平板16更 有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离物沈。在该实施例中， 虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度20将非 常接近平均的隔离物26的直径高度。分析显示使用该实施例可以将平均腔室高度20控 制为小于4微米的腔室高度的上下或更好。除了受到上述的弹性特性(以及诸如隔离 物的分布密度之类的其他因素)的限制，隔离物沈和平板12、16可以由各种材料制备，只 要平板12、16足够透明。由丙烯酸(acrylic)或者聚苯乙烯(polystyrene)组成的透明 塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbonate)、硅 酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物沈。可接受的隔离物的特定示例是由聚 苯乙烯制成的球体，在商业上可以从例如Thermo Scientific of Fremont, Californi a, U. S. Α.目录编号为4204A获得4微米G μ m)直径的这种球体。参照图5，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括多个以规则的间隔布置的口 30(例如，用作气孔)，并且平板 12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材料32形成了可用于将样本 34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。这个可接受的分析腔室的示例在美国专利申 请公开No. 2007/0对3117、2007/0087442、以及2008年4月2日提交的美国临时专利申请 No. 61/041，783和2008年10月31日提交的美国临时专利申请No. 61/110，341中详细地进 行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。另一个可接受的腔室10的示例布置在如图6和图7所示的一次性容器36中。腔 室10形成在第一平板12和第二平板16之间。第一平板12和第二平板16都是透明的，以 允许光穿过腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在该部分内，内表 面14和内表面18彼此间隔开高度20。该腔室10的实施例在美国专利No. 6，723，290中更 详地进行了描述，该专利以引用方式整体并入本文。图2至图7所示的分析腔室表示可接 受的用于本发明方法的腔室。然而，本发明的方法不限于这些特定实施例。样本内的一些WBC将很可能接触腔室平板的两个内表面，而其他的则不会接触。 不要求这些WBC接触内表面，并且不必为了本发明的目的而知道腔室的确切高度。基于典 型的WBC大小和WBC在一定程度上可以变形(例如，在腔室内表面之间被部分压缩)的事 实，对于大多数动物品种来说，大约2至6微米μ m)的腔室高度是可接受的。大约3 至5微米(3-5 μ m)的腔室高度20特别好地适于分析人类血液。可以在分别具有较大或较 小的腔室高度的腔室中执行对WBC实质上大于或小于人类WBC的动物品种的分析。使用分析设备来执行对静止地置于腔室10内的样本的分析，该分析设备可用于 对样本的至少一部分照射和成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本单位来确定来自 样本的所述部分的荧光发射和光密度的方式产生该图像。术语“基本单位”或者“图像单位” 是指所定义的能够分辨样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处 理的最小图元的像素是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少 量像素。还可以以线性项(例如，在焦平面上每像素几微米)来描述成像设备的放大倍数， 其中线性维度沿着应用于图像的正交网格的一个特定轴。在焦平面上被传感器像素捕获的 实际样本面积因此是成像设备所应用的放大系数的函数。因此，已知成像设备的放大倍数 是有用的，但不是必要的。与该像素有关的体积因此是每个像素的图像的面积与腔室高度 的乘积。例如，如果放大倍数为每像素0. 5微米，则占据200个像素的图像将具有50平方 微米的面积，而体积则为50平方微米与腔室高度的乘积。现在参照图8，适用于本发明的方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、析 像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46包括光源，该光源选择性地产生某些期望波 长的光。例如，可以使用发射期望波长(例如，420nm，440nm，470nm等)的光的LED。作为 选择，可以使用产生宽波长范围(例如，大概400-670nm)的光的光源，虽然在一些情况下， 这种光源可能需要滤波。分析设备44可以包括用于控制光的光学器件。样本照明器46包 括透射光源和表面照明光源，每一个均可用于照射停留在腔室10内的样本中的一些或者 全部。可接受的析像器48的示例是电耦合器件(CCD)，其将穿过样本的光的图像转换成为 电子数据形式(即，信号)。可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并且连接至样本照 明器46和析像器48。CPU适于(即，被编程为)选择性地执行实现本发明方法所必需的功 能。题目为"Apparatus for Analyzing Biologic Fluids，，且于 2005 年 3 月 15 日发布的美国专利No. 6，866，823公开了这种分析设备44，该美国专利内容以引文方式整体并入本文。该分析设备适于1)对样本的至少一部分成像，并且基于每个像素，产生表示来 自被成像的样本的荧光发射和被成像的样本的光密度的图像信号；幻使用图像信号，确定 所有静止地停留在样本部分内的第一类型的一个或多个组分和第二类型的一个或多个组 分的荧光值；幻确定被成像的第一和第二类型的组分中的每一个的光密度值；以及4)使用 所确定的荧光值和光密度值，来识别第一类型的组分和第二类型的组分。根据本发明的方法，基本上未稀释的全血样本被引入腔室10内，然后如上所述， 静止地停留在腔室内。在将样本弓I入腔室前或者在将样本弓I入腔室时，在样本中掺合抗凝 血剂和染色剂。染色剂被样本内的细胞(例如，WBC和血小板)吸收。此后，当单独讨论WBC 时，同样的过程适用于单独讨论血小板或者样本内的其他组分。静止地停留在腔室内的样 本的至少一部分被发射穿过样本的光的分析设备44照射。虽然不要求对停留在腔室内的 整个样本成像，但是这是优选的，因为这么做通常会提供对样本的更全面的分析并且伴随 着准确性的提高。用已知能够激发来自细胞的与被WBC吸收的染色剂有关的荧光发射的波长的光 来照射样本。当被大约470nm波长的紫光照射时用吖啶橙染色的WBC产生荧光发射。特定 的发光取决于所使用的染色剂和被照射细胞的细胞内成分(例如，染色剂与细胞的RNA和 /或DNA相互作用会引起发光)。一些WBC具有作为荧光标记的荧光发射，荧光标记对于该 WBC来说是相对唯一的，因此可以用来识别该WBC。其他WBC具有不易于彼此区分开的荧光 发射标记。可以将具有那些“共享的”发射标记的WBC分组成第一类型的WBC或者第二类 型的WBC，但是仍然需要某事物来区分这两种WBC类型。在样本被照射引起荧光发射的同时(或者在顺序上为其后)，样本还被染色剂 所吸收的一个或多个波长的光照射。用吖啶橙染色的WBC由于存在吖啶橙例如吸收大约 420nm波长的光。可以以光密度(OD)方式描述的吸收量是WBC内的染色剂的浓度和局部条 件(例如，PH)的函数。当暴露于相同量的染色剂时，WBC吸收染色剂的倾向作为细胞的生 物学特性的函数而在一些WBC细胞类型之间有所不同。例如，WBC内的不同生物学特性(例 如，核材料、细胞质等)将吸收不同浓度的染料。每个细胞类型的这些不同的生物学特性， 以及与此相关的这些特性所吸收的染色剂的不同浓度可以被用来区分某些细胞类型。作为 细胞内的染色剂的浓度的函数，细胞的OD可以被用来区分和识别不同的细胞类型。在一些 应用中，细胞之间的OD的差异能够提供足够信息来实现细胞识别。在其他情况下，使用细 胞的荧光标记和OD来实现识别。为了示出本发明的示例，基本上未稀释的血液样本被掺合有吖啶橙并且被引入到 具有两个透明的平板的腔室内。样本静止地存在，并且样本内的多个WBC接触腔室的两个 内表面。以470nm和420nm波长的光照射样本。470nm波长的光照射产生荧光发射。420nm 波长的光照射被染色剂吸收。获得被照射的样本的数字图像。在存在于被成像的样本内的 整个WBC族群内识别包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(eosinophil)的一组WBC，该组在图 像内是“分离的”；例如，通过对图像进行滤波，使得只能看见这个组。中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞被识别，这是因为这些WBC类型中的每一个在激发时都产生由显著的红色细胞质荧 光和绿色细胞核荧光组成的标记荧光图案。然而，该组内的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的
10荧光发射彼此间非常类似，从而很难区分这两种类型的WBC。为了区分该组内的这两种类型的WBC，比较分离的WBC的光密度。平均来说，嗜酸 性粒细胞内吸收的吖啶橙的浓度大于中性粒细胞内吸收的吖啶橙的浓度，虽然荧光可能是 相同的。这是因为相对于中性粒细胞内的染色剂的荧光来说，嗜酸性粒细胞内的染色剂的 荧光被淬灭，这是由嗜酸性粒细胞的细胞内容物的特有属性导致的。例如，使用预定的OD 截断值(cutoff value)可以将这两种不同类型的WBC区分成分离的子组；例如，OD大于截 断值的分离组内的细胞被归入嗜酸性粒细胞，而OD值小于截断值的那些细胞被归入中性 粒细胞。作为选择，可以通过将这两种类型的WBC的测量到的OD值与存储在分析设备内 (例如，在查找表中，等等)的根据经验获得的OD值进行比较来区分这两种类型的WBC。进一步地，可以通过确定单个细胞的细胞质荧光与细胞质OD的比率(荧光/0D) 来将这两个WBC子组彼此区分开。为了产生该比率，可以确定和平均针对特定细胞的基于 每个像素的荧光发射值和光密度值，该平均值可以用于产生该比率。可以使用其他方法，例 如确定每个像素的比率并且对每个像素的比率进行平均，来确定该比率。荧光与OD的比率 定量地表示特定细胞内的着色剂的荧光的淬灭。具有较低比率的细胞显示出荧光信号的 “淬灭”。可以统计估计分离组内的所有细胞的比率，以确定两个族群之间的分离点。统计 上低于分离点的细胞是嗜酸性粒细胞，这是因为荧光与OD的比率低于与中性粒细胞族群 相关的比率。类似地，统计上高于分离点的细胞是中性粒细胞，这是因为荧光与OD的比率 高于嗜酸性粒细胞族群的比率。在上述荧光/OD比率分析的另一个实施例中，可以只使用来自被检查细胞的上述 平均OD值和荧光发射值(或者OD值和处于大于50%的百分比内的荧光发射值)来确定 所述比率。具体地讲，暴露于染色剂的特定细胞中的第一区域(例如，核区域)中的染色剂 浓度可能小于第二区域(例如，细胞质区域)中的染色剂浓度。因此，细胞的第二区域(例 如，细胞质)的OD将大于细胞的第一区域(例如，核)的0D。类似地，来自细胞的特定区域 的荧光发射可能大于来自另一区域的荧光发射。有选择地使用荧光发射/OD值中代表较大 的发射强度或OD的一部分值，将获得改进的噪声信号比，这将有助于分析。这方面利用了 染色剂通常优选地分布在例如细胞的细胞质内的颗粒(granule)内的事实。在本发明的另一个实施例中，用激发荧光发射的一定波长(例如，470nm)的光的 恒定发射来“漂白(bleaching) ”掺合有染色剂的细胞，并且在一段时间内的分立时间点感 测发射光的强度，从而可以将样本内的细胞彼此区分开。来自一个特定细胞类型的荧光发 射强度的降低的平均速度对于该细胞类型来说是恒定的，但是在多种细胞类型之间该平均 速度有所不同。因此，可以使用光发射强度的下降速度来区分细胞类型。例如，图9示出了 暴露于光致漂白的各个中性粒细胞的绿色荧光发射的衰减速度52、54、56，以及这些中性粒 细胞的绿色荧光发射的平均衰减速度58。图10示出了暴露于同样的光致漂白的各个淋巴 细胞的绿色荧光发射的衰减速度60、62，以及这些淋巴细胞的绿色荧光发射的平均衰减速 度64。图9和图10所示的曲线清楚地显示出不同细胞类型的不同衰减速度，以及可以使用 不同的衰减速度来识别出被分析的细胞的类型。还可以使用光发射强度的下降速度来通过 其他特征(诸如，年龄)区分细胞；例如，某一类型的细胞，但是年龄不同，将具有特有的光 发射强度的下降速度，该特有的光发射强度的下降速度可以用来区分各种不同的年龄组。
虽然已经通过本发明的具体实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人 员应当理解在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以在形式上或细节上进行各种变化。
权利要求
1.一种用于分析血液样本的方法，包括以下步骤将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二 平板限定，这两个平板都是透明的，所述样本具有一个或多个第一组分和一个或多个第二 组分，其中，第二组分与第一组分不同；将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定的第一波 长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和第二组分的荧光发射 以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值；使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个光密度值，所述 光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分。
2.如权利要求1所述的方法，其中血液样本实质上未被稀释。
3.如权利要求1所述的方法，其中血液样本是全血。
4.如权利要求1所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由白细胞和微粒组成的组中。
5.如权利要求4所述的方法，其中第一组分和第二组分均是白细胞的类型。
6.如权利要求5所述的方法，其中基于每个像素来确定第一组分中的每一个和第二组 分中的每一个的一个或多个荧光发射值。
7.如权利要求6所述的方法，其中每个第一组分和每个第二组分中的至少一个是使用 从该组分内的一个区域确定的荧光发射值来识别的，该区域的荧光发射值相对于该组分的 其他区域中的荧光值来说高于平均强度。
8.如权利要求7所述的方法，其中基于每个像素来确定第一组分中的每一个和第二组 分中的每一个的一个或多个光密度值。
9.如权利要求8所述的方法，其中每个第一组分和每个第二组分中的至少一个是使用 从该组分内的一个区域确定的光密度值来识别的，该区域的光密度值相对于该组分的其他 区域中的光密度值来说高于平均大小。
10.根据权利要求7所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个 的至少一部分内的光密度值进行平均的步骤；以及其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将 所确定的每个组分的平均光密度值与预定的光密度值进行比较。
11.如权利要求10所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
12.如权利要求5所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个的 至少一部分内的光密度值进行平均的步骤；以及其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将 所确定的光密度值与经验数据进行比较以将第一组分和第二组分区分开。
13.如权利要求12所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
14.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一 组分和第二组分的步骤包括为特定细胞来确定所确定的荧光发射值与所确定的光密度值 的比率。
15.如权利要求14所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述比率是为一个细胞确定的荧光发射值的平均 与为该细胞确定的光密度值的平均的比。
17.如权利要求14所述的方法，还包括为第一组分和第二组分中的每一个来确定所确 定的荧光发射值与所确定的光密度值之间的比率并且对该比率进行统计估计以识别第一 组分和第二组分的步骤。
18.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一 组分和第二组分的步骤仅仅利用了第一组分和第二组分中的每一个的细胞质区域的荧光 发射和光密度。
19.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一 组分和第二组分的步骤包括对被成像的样本内的实质上所有的组分的荧光发射值进行比较。
20.如权利要求19所述的方法，其中第一组分和第二组分具有实质上类似的荧光发射 值的图案。
21.如权利要求20所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个的 至少一部分内的光密度值进行平均；以及其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将 为第一组分中的至少一个和第二组分中的至少一个确定的平均光密度值与预定的光密度 值进行比较。
22.如权利要求4所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的微粒。
23.如权利要求22所述的方法，其中第一微粒和第二微粒选自由血小板和血液寄生虫 组成的组中。
24.一种分析血液样本的方法，包括以下步骤将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二 平板限定，这两个平板都是透明的，所述样品具有一个或多个第一组分和一个或多个第二 组分，其中，第二组分与第一组分不同；将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定波长的光 时发出荧光；在一段时间内，以恒定方式用所述波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至 少一部分；在所述的一段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分成像，并且产生表示每 个分立时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；使用每个分立时间点的图像信号来确定静止地置于样本内的第一组分和第二组分中 的每一组分的一个或多个荧光发射值，以及针对第一组分和第二组分中的每一组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变化速度；以及使用所确定的第一组分和第二组分中的每一组分的荧光发射值的变化速度来识别第 一组分和第二组分。
25.如权利要求M所述的方法，其中血液样本实质上未被稀释。
26.如权利要求M所述的方法，其中血液样本是全血。
27.如权利要求M所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由白细胞和微粒组成的 组中。
28.如权利要求27所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的白细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的微粒。
30.如权利要求四所述的方法，其中第一微粒和第二微粒选自由血小板和血液寄生虫 组成的组中。
31.一种分析血液样本的设备，包括腔室，适于静止地保持样本；照明器，用于以一个或多个荧光激发波长的光和一个或多个吸收波长的光来照射样本；析像器，用于对样本进行成像，并且产生表示来自置于样本内的第一组分和第二组分 的荧光发射和置于样本内的第一组分和第二组分的光密度的图像信号，其中第一组分和第 二组分不同；以及分析设备，适于使用图像信号来确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个 荧光发射值，和使用图像信号来确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个光密 度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及使用所确定的荧光发射值和光密度值 来识别第一组分和第二组分。
32.—种分析具有第一组分和第二组分的血液样本的设备，其中第一组分和第二组分 不同，该设备包括腔室，适于静止地保持样本；照明器，用于在一段时间内，以恒定方式用一个或多个荧光激发波长的光来照射包含 一个或多个第一组分和一个或多个第二组分的样本的至少一部分；析像器，用于在所述的一段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分进行成 像，并且产生表示每个分立时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；以 及分析设备，适于使用每个分立时间点的图像信号来确定静止地置于样本内的第一组分 和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值，和针对第一组分和第二组分中的每一 组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变化速度；以及使用所确定的第一组分和第二组 分中的每一组分的荧光发射值的变化速度来识别第一组分和第二组分。
全文摘要
提供一种用于分析血液样本的方法，包括以下步骤a)提供具有一个或多个第一组分以及一个或多个第二组分的血液样本，第二组分与第一组分不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和第二组分的荧光发射以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；f)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的荧光值；g)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的光密度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定的荧光值和光密度值来识别第一组分和第二组分。
文档编号G01N21/64GK102084241SQ200980116634
公开日2011年6月1日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月21日
发明者尼滕·V·拉尔普里亚, 斯蒂芬·C·沃德洛, 罗伯特·A·莱文, 达瑞恩·W·温弗里希特 申请人:艾博特健康公司