具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备与应用
【专利摘要】本发明属于荧光染料技术领域，公开了一种具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备与应用。所述荧光染料具有式(1)所示的结构通式。所述制备方法为：将100份木质素或木质素磺酸盐溶于水或有机溶剂和水的混合溶液中，加入碱调节PH值为9～14，加入氯代环氧烷1～20份，在25～50℃的条件下反应0.5～24h，反应完后添加碱保持pH为9～14，加入罗丹明胺基衍生物1～25份的有机溶剂溶液，升温至60～80℃反应0.5～24h，反应完后磺化，然后经透析膜或阴阳离子树脂提纯得到产物。本发明产物具有AIE活性，可用于体外细胞染色，对癌细胞有较强的抑制作用。
【专利说明】
具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备与应用
技术领域
[0001] 本发明属于荧光染料技术领域，具体涉及一种具有pH响应的罗丹明接枝木质素基 荧光染料的制备与应用。
【背景技术】
[0002] 许多有机发光材料在稀溶液状态下具有较强的荧光，但随着浓度的增大或固态 下，分子间发生聚集，导致荧光减弱，甚至完全淬灭，这在很大程度上限制了这些材料的应 用范围。对此，研究人员通过各种方法来限制荧光团的聚集，减少荧光淬灭。2001年唐本忠 等发现四苯乙烯等分子在溶液中不发光或发光很微弱，但在溶液或固态中形成聚集体后发 光急剧增强，唐等将这种现象称为"聚集诱导发光"（AIE)。这些具有AIE特性的有机发光材 料在光学传感和生物标记等领域具有广阔的应用前景。
[0003] 罗丹明是一种具有淬灭效应的荧光分子，为了抑制其淬灭效应，我们设计了具有 pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料，将传统的聚集荧光淬灭的罗丹明分子转化成具有 AIE活性的分子;木质素提供了优异的水溶性和良好的生物相容性；同时利用木质素自身和 罗丹明的发光特性，实现对PH值比率型荧光检测。
[0004] 该发明的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在弱酸性即可发生变色和 产生荧光，可有效对细胞进行体外着色，且具有良好的生物相容性。由于癌细胞整体pH偏 低，该发明的具有PH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料通过荧光成像的方式对癌细胞和 正常细胞有较好的分辨，并且对正常细胞抑制作用弱，对癌细胞有较强杀灭作用。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的首要目的在于提供一种具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光 染料。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种上述具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染 料的制备方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的 应用。
[0008] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0009] -种具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料，所述荧光染料具有式（1)所示 的结构通式：
[0010]
[0011] 其中：Lignin代表木质素分子，X为0、c或者NH，m为2~5的整数，n2为1~2的整数， Π 3为0~4的整数。
[0012] 上述具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，包括以下制备步 骤：以重量份数计，将100份木质素或木质素磺酸盐溶于水或有机溶剂和水的混合溶液中， 加入碱调节PH值为9~14,加入氯代环氧烷1~20份，在25~50 °C的条件下反应0.5~24小 时，反应完后添加碱保持pH为9~14,加入罗丹明胺基衍生物1~25份的有机溶剂溶液，升温 至60~80°C反应0.5~24小时，反应完后，对反应体系进行磺化，然后经过1000分子量透析 膜提纯或阴阳离子树脂提纯后得到具有PH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。
[0013] 所述的罗丹明胺基衍生物的制备方法如下:将罗丹明和多乙烯亚胺或多醚二胺或 烷基二胺溶于无水甲醇中，氮气保护下，60°c~70°C温度下反应0.5h~48h，反应产物经分 离纯化，得到罗丹明胺基衍生物。
[0014] 所述的有机溶剂包括二甲基亚砜、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇和甲醇中 的一种或多种。
[0015] 所述的氯代环氧烷优选环氧氯丙烷或环氧氯丁烷。
[0016] 所述的碱包括碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
[0017] 所述的木质素或木质素磺酸盐为碱木质素、酶解木质素、木质素磺酸钠、木质素磺 酸钙和木质素磺酸镁中的一种或多种。
[0018] 所述磺化的方法包括亚硫酸盐磺化、磺酸内酯磺化或接枝磺化。
[0019] 所述的罗丹明胺基衍生物具有如下结构式：
[0020]
[0021] 其中X为0、C或者NH，n3为0~4的整数。
[0022] 上述反应如下式所示： Γηη?^ι
[0024] 上述具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在体外细胞染色中的应用。所述 的木质素基荧光染料采用共聚焦荧光显微镜进行体外细胞染色时，其浓度为〇.〇1~Img/ mL〇
[0025] 上述具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在杀灭癌细胞试剂的制备具有 潜在应用。
[0026] 本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
[0027] (1)本发明设计了具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料，木质素磺酸提供 了优异的水溶性，良好的生物相容性；同时利用了木质素自身和罗丹明的发光特性，实现了 对pH值比率型荧光检测；
[0028] (2)将传统的聚集荧光淬灭的罗丹明分子转化成具有AIE活性的分子。本发明的具 有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在弱酸性即可发生变色和产生荧光，可有效对细 胞进行体外着色，且具有良好的细胞通透性。由于癌细胞整体PH偏低，该发明的聚合物可以 对癌细胞和正常细胞有较好的分辨。
[0029] (3)本发明的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在相同条件下，对正常 肝细胞没有毒性，对肝癌细胞的抑制率很强，达到70%左右，本发明在杀灭癌细胞领域也有 一定应用前景。
【附图说明】
[0030]图1为实施例1所得产物的1H-NMR图；
[0031]图2为实施例1所得产物的FT-IR图；
[0032]图3为实施例2所得产物的1H-NMR图；
[0033]图4为实施例2所得产物在水和乙醇体系的聚集荧光增强图（激发波长:500nm);
[0034] 图5为加入含有实施例2所得具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的培养 液进行染色后，正常肝细胞(HL-7702，左)和肝癌细胞(SMMC-7721，右）的染色对比图；
[0035] 图6为本发明所得具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的细胞毒性测试结 果图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0037] 实施例1
[0038]将罗丹明Ig和二乙烯三胺4.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，60°C温度下反应 8h，反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物1.3g。取IOg碱木质素溶于40mL的水中，加 入2g NaOH，调节pH至12，同时滴加入0.5g环氧氯丙烷，在常压、50 °C加热条件下反应8h;之 后，加入0.5g NaOH保持反应体系pH为12，滴加合成的罗丹明胺基衍生物(0.2g)的四氢呋喃 溶液，并在80°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生物，最后 向反应后的混合液中加入1，4-丁基磺酸内酯Ig和NaOH 2g，70 °C加热反应8h，反应结束冷却 至室温，然后经过1000分子量透析膜提纯后，冷冻干燥，得到具有PH响应的罗丹明接枝木质 素基荧光染料。
[0039] 实验采用仪器Auto systemxL/1-Series/Spectrum 2000红外光谱仪，用溴化钾压 片法对本实施例所得产物进行红外表征，结果如图1所示。
[0040] 以DMS0_d6为溶剂，米用仪器核磁共振仪（Bruker DRX_400spectrometer(Bruker Co. Ett I ingen，Germany))对本实施例产物进行1H-NMR测试，结果如图2所示。
[0041 ] 实施例2
[0042]将罗丹明Ig和二乙烯三胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应 l〇h，反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物1.2g。取IOg碱木质素溶于40mL的水中， 加入4g NaOH，调节pH至12，同时滴加入1.5g环氧氯丙烷，在常压、50 °C加热条件下反应8h; 之后，加入Ig NaOH保持反应体系pH为12，滴加合成的罗丹明胺基衍生物（lg)的四氢呋喃溶 液，并在80°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生物，最后向 反应后的混合液中加入1，4-丁基磺酸内酯2g和NaOH 4g，70°C加热反应8h，反应结束冷却至 室温，经阴阳离子树脂提纯，冷冻干燥，得到具有PH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。 本实施例所得产物的 1H-NMR图如图3所示。
[0043] 实施例3
[0044]将罗丹明Ig和四乙烯五胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应 l〇h，反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物1.4g。取IOg碱木质素溶于40mL的水和乙 醇的混合溶剂中（水：乙醇=1:9)，加入4g Κ0Η，调节pH至12,同时滴加入2g环氧氯丁烧，在 常压、50°C加热条件下反应8h;之后，加入Ig KOH保持反应体系pH为13,滴加合成的罗丹明 胺基衍生物（2g)的四氢呋喃溶液，并在80°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去 未反应的罗丹明衍生物，最后向反应后的混合液中加入1，3_丙基磺酸内酯Ig和KOH 2g，70 °(：加热反应8h，反应结束冷却至室温，经过1000分子量透析膜提纯，冷冻干燥，得到具有pH 响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。本实施例所得产物的FT-IR图和1H-WR(DMS〇-d6)谱 图与实施例1基本相同，不一一提供。
[0045] 实施例4
[0046]将罗丹明Ig和戊二胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应10h，反 应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物1.4g。取IOg碱木质素溶于30mL的水和甲醇的混 合溶剂中（水：甲醇=1:9)，加入2g NaOH，调节pH至12，同时滴加入1.5g环氧氯丁烷，在常 压、50°C加热条件下反应8h;之后，加入2g NaOH保持反应体系pH为14，滴加罗丹明胺基衍生 物(〇.6g)的四氢呋喃溶液，并在60°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应 的罗丹明衍生物，最后向反应后的混合液中加入亚硫酸钠2g和KOH 2g，70加热反应2h，反应 结束冷却至室温，经过1000分子量透析膜提纯，冷冻干燥，得到具有PH响应的罗丹明接枝木 质素基荧光染料。
[0047] 实施例5
[0048] 将罗丹明Ig和四乙二醇醚二胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反 应l〇h，反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物1.4g。取IOg木质素磺酸钠溶于50mL的 水中，加入2g NaOH，调节pH至12，同时滴加入0.5g环氧氯丙烷，在常压、40 °C加热条件下反 应8h;之后，加入Ig NaOH保持反应体系pH为14，滴加合成的罗丹明胺基衍生物(0.5g)的四 氢呋喃溶液，并在65°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生 物，最后向反应后的混合液中加入Ig甲醛和KOH 2g，70 °C加热反应2h后，加入亚硫酸钠2g， 95°C度继续反应2h，反应结束冷却至室温，经阴阳离子树脂提纯，冷冻干燥，得到具有pH响 应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。
[0049] 实施例6
[0050] 将罗丹明Ig和乙二胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应10h，反 应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物l.lg。取IOg磺甲基化木质素溶于50mL的水和四 氢呋喃的混合溶剂中（水：四氢呋喃=5:5 )，加入2g NaOH，调节pH至12，同时滴加入1.0 g环 氧氯丙烷，在常压、40 °C加热条件下反应8h;之后，加入0.9g NaOH保持反应体系pH为12，滴 加合成的罗丹明胺基衍生物（Ig)的四氢呋喃溶液，并在65 °C加热条件下反应8h，之后用乙 酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生物，最后向反应后的混合液中加入3-溴-丙基磺酸钠 Ig和KOH 2g，70°C加热反应8h，反应结束冷却至室温，经过1000分子量透析膜提纯，冷冻干 燥，得到具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。
[0051 ] 实施例7
[0052]将罗丹明Ig和乙二胺2.5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应10h，反 应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物l.lg。取IOg木质素磺酸钙溶于50mL的水和乙醇 的混合溶剂中（水：乙醇= 3:7)，加入2g NaOH，调节pH至14,同时滴加入I .Og环氧氯丙烷，在 常压、45 °C加热条件下反应8h;之后，加入保持NaOH反应体系pH为13，滴加合成的罗丹明胺 基衍生物(〇.7g)的四氢呋喃溶液，并在80°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去 未反应的罗丹明衍生物，最后向反应后的混合液中加入5-溴-戊基磺酸钠 Ig和KOH 2g，70°C 加热反应8h，反应结束冷却至室温，经阴阳离子树脂提纯，冷冻干燥，得到具有pH响应的罗 丹明接枝木质素基荧光染料。
[0053] 实施例8
[0054]将罗丹明2g和二乙烯三胺5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应10h， 反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物2.7g。取IOg碱木质素溶于30mL的水中，加入 2g NaOH，调节pH至12，同时滴加入0.5g环氧氯丙烷，在常压、50 °C加热条件下反应8h;之后， 加入保持NaOH反应体系pH为12，滴加合成的罗丹明胺基衍生物(0.2g)的四氢呋喃溶液，并 在60°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生物，最后向反应 后的混合液中加入0.3g 1，4-丁磺酸内酯，和NaOH 0.5g，65°C加热反应3h，反应结束冷却至 室温，经阴阳离子树脂提纯，冷冻干燥，得到具有PH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料。 [0055] 实施例9
[0056]将罗丹明2g和二乙烯三胺5mL溶于无水甲醇中，氮气保护下，70°C温度下反应10h， 反应产物经分离纯化，得到罗丹明胺基衍生物2.7g。取IOg木质素磺酸钠溶于50mL的水中， 加入2.3g NaOH，调节pH至13，同时滴加入1.5g环氧氯丙烷，在常压、50 °C加热条件下反应 8h;之后，加入Ig NaOH保持反应体系pH为14，滴加合成的罗丹明胺基衍生物（2.5g)的四氢 呋喃溶液，并在65°C加热条件下反应8h，之后用乙酸乙酯萃取除去未反应的罗丹明衍生物， 最后向反应后的混合液中加入Ig甲醛和KOH 2g，70°C加热反应2h后，加入亚硫酸钠2g，95°C 度继续反应2h，反应结束冷却至室温，经阴阳离子树脂提纯，冷冻干燥，得到具有pH响应的 罗丹明接枝木质素基荧光染料。
[0057]本发明所得具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的性能测试：
[0058] (1)聚集荧光增强性质：
[0059] 将实施例2所得木质素基荧光染料溶解在蒸馏水中，加入不同比例在不良溶剂乙 醇，溶液的荧光强度随乙醇浓度的变化如图4所示。随着非良溶剂乙醇含量的增加，分子间 发生聚集，在乙醇体积达到70%之前，表现为聚集荧光增强现象。
[0060] (2)体外细胞染色测试
[00611 取复苏好的正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞SMMC-7721(商业购买），加入含有实施 例2所得具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的培养液(荧光染料的浓度为0.25mg/ mL)，放入CO2培养箱(培养条件5%CO2、饱和湿度、37°C)培养8小时，消化细胞后吹打散细胞， 计数，调整细胞浓度为I X IO5个/ml，分到96孔板，每孔IOOul，即每孔细胞为I X IO4个。需待 细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。
[0062]做细胞成像实验时，用PBS洗去培养液的细胞4%多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次， 每次5分钟（可以放4°C冰箱保存备用），0.2%Triton X-100处理5分钟，PBS洗3次，每次5分 钟，DAPI室温湿盒避光孵育5分钟，PBS洗一次，5分钟，水洗两次，每次5分钟，荧光抗淬灭剂 封片，镜检，拍照。结果如图5所示。可以看到，在正常肝细胞中，由于细胞pH值偏弱碱性，几 乎没有红色荧光产生。但在肝癌细胞中，由于细胞pH值为弱酸性，有红色荧光产生。
[0063] (3)细胞毒性测试：
[0064] 加入celITiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂（Promega，Cat ·No ·G3582)，比例为 1/10。即IOOul含有实施例2所得荧光染料的培养液加入IOul检测液。在孵育4小时后，酶标 仪读板，MTT检测读取0D490数据，并与空白组(未添加荧光染料)对照，结果如图6所示。与空 白组对照，实施例2对正常肝细胞没有毒性，但对肝癌细胞表现出较强的抑制作用。
[0065]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料，其特征在于所述荧光染料具有式 (1)所示的结构通式：其中：Lignin代表木质素分子，X为0、C或者NH，m为2~5的整数，112为1~2的整数，μ为0 ~4的整数。2. 权利要求1所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其特征 在于包括以下制备步骤:以重量份数计，将100份木质素或木质素磺酸盐溶于水或有机溶剂 和水的混合溶液中，加入碱调节PH值为9~14，加入氯代环氧烷1~20份，在25~50°C的条件 下反应0.5~24小时，反应完后添加碱保持pH为9~14,加入罗丹明胺基衍生物1~25份的有 机溶剂溶液，升温至60~80°C反应0.5~24小时，反应完后，对反应体系进行磺化，然后经过 1〇〇〇分子量透析膜提纯或阴阳离子树脂提纯后得到具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧 光染料。3. 根据权利要求2所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其 特征在于所述的罗丹明胺基衍生物的制备方法如下:将罗丹明和多乙烯亚胺或多醚二胺或 烷基二胺溶于无水甲醇中，氮气保护下，60°C~70°C温度下反应0.5h~48h，反应产物经分 离纯化，得到罗丹明胺基衍生物。4. 根据权利要求2所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其 特征在于:所述的有机溶剂包括二甲基亚砜、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇和甲醇中 的一种或多种;所述的碱包括碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。5. 根据权利要求2所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其 特征在于所述的氯代环氧烷是指环氧氯丙烷或环氧氯丁烷。6. 根据权利要求2所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其 特征在于所述的木质素或木质素磺酸盐为碱木质素、酶解木质素、木质素磺酸钠、木质素磺 酸钙和木质素磺酸镁中的一种或多种。7. 根据权利要求2所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法，其 特征在于:所述磺化的方法包括亚硫酸盐磺化、磺酸内酯磺化或接枝磺化。8. 根据权利要求2或3所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料的制备方法， 其特征在于:所述的罗丹明烷基二胺衍生物具有如下结构式：式中X为0、C或者NH，n3为0~4的整数。9. 权利要求1所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在体外细胞染色中的 应用。10. 权利要求1所述的具有pH响应的罗丹明接枝木质素基荧光染料在制备杀灭癌细胞 试剂中的应用。
【文档编号】G01N21/64GK105860583SQ201610232246
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】邱学青, 李 远, 薛雨源
【申请人】华南理工大学