一种融合荧光素和罗丹明结构光学信号可控的深红氧杂蒽染料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学传感成像检测技术中的分子荧光染料的制备，介绍了一种将荧光 素和罗丹明结构融合于一体来增大染料共辄基团，从而调控染料的吸收和发射波长处于深 红区域的氧杂蒽染料的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，发展高灵敏度和高选择性的光学检测方法进行生物和环境中一些重要物 质的识别、检测和监控已经成为化学传感器的重要发展方向。尽管一些常规检测方法如：高 分辨液相色谱、质谱、原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、电化学传感等方法 已经被用于相关目标物的分析，由于这些检测方法需要复杂的仪器，并且具有检测步骤繁 琐、分析检测耗时等缺陷。因此，发展各类高效、快速和灵敏的检测技术一致是该领域的热 点。近年来，以有机荧光探针为基础的荧光分析检测技术展现出灵敏度高、操作简便、重现 性好等众多优点；同时，将一些荧光探针进行生物相容性修饰后可获得具有膜透性好、原位 检测等功能的各类具有生物标记检测性能的荧光探针，当与荧光成像技术相结合时，便可 以用于生物体系中目标分子的原位、实时无损伤检测，并可用于监控活细胞与活体中生物 分子及其生物过程。因此，以分子荧光探针为基础的各类荧光分析检测技术日益成为现代 生命科学及疾病诊断等领域不可缺少的研究手段；同时，分子荧光探针的设计、合成及其生 物成像应用已经成为当前跨学科的前沿交叉研究领域。
[0003] 迄今为止，已有各种具有不同激发和发射波长的荧光染料如氧杂蒽、香豆素、芘、 1，8-萘二甲酰亚胺、花菁、氟硼萤等已经被广泛的用于化学传感器的荧光信号基团。这 些传统染料均在识别与标记领域中得到一定的应用，其光谱性质也具有一定的优势。但 是上述染料中，除花菁染料等少部分染料之外，其余染料其最大吸收和发射波长均处于紫 外-可见区域，不能达到深红或者近红外波段，不能很好的满足生物分子检测中对荧光染 料的吸收和荧光发射波长的要求。就花菁染料而言，虽然通过改变其甲川链的长度可以将 其吸收和发射波长调控至深红以及近红外区域，但普遍具有量子效率低、抗光漂白能力差 等缺陷，从而限制了其在生物分子检测中的广泛应用。因此设计各类具有吸收和荧光发射 波长处于深红、近红外区域以及具有抗光漂白能力强等性能的荧光染料一直是新染料开发 和荧光探针设计的重点和热点目标。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种新的吸收和发射波长处于深红区域，并且具有荧光可 控的氧杂蒽类染料的制备方法，该荧光染料合成产率高，外界环境可以控制染料的荧光开 启和关闭，具有荧光可控性。同时氧杂蒽的螺环内酯的羧基位置能够很容易被修饰成生物 相关的不踪物。
[0005] 氧杂蒽类染料具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、光稳定性好、生物相容性好 等优势，常被用于测定量子效率的基准物质，但是这两种染料的吸收和发射波长较短，为了 提高染料的吸收和发射波长，我们通过融合荧光素和罗丹明基团于一体来增大染料的共辄 程度，并增大染料的吸收和发射波长，从而设id种量子产率尚、吸收和发射波长长的双氧 杂蒽杂化荧光染料。同时，可利用这种新型双氧杂蒽染料的羧酸螺环结构对不同环境条件 (如PH、温度、质子性溶剂等）的响应，产生螺环开启或者关闭所导致的染料共辄体系的改 变引起光学信号变化的特性来进行各类荧光探针设计。如PH可以控制染料的光学信号：在 强酸性条件下，染料螺环以羧酸（-COOH)形式存在，染料结构以共辄形式存在，因此具有光 学信号；中性条件下，螺环以内酯形式存在，共辄体系阻断，从而关闭染料光学信号；碱性 条件下，螺环以羧酸根负离子（-COO )形式存在，染料共辄程度达到最大，从而光学信号开 启。
[0006] 本发明所提供的荧光染料化合物，其结构通式如下式所示。
[0008] 本发明的技术方案：
[0009] -种融合荧光素和罗丹明结构光学信号可控的深红氧杂蒽染料的制备方法，详细 步骤如下：
[0010] 1)将2-(2, 4-二羟基苯甲酰）苯甲酸和1，5-二羟基萘在甲磺酸中加热搅拌，加热 温度为85-95 °C，反应时间6-8h，冷却后得产物溶液。
[0011] 2)将步骤1)所得反应液中加水后，用碳酸氢化钠中和，热的乙酸乙酯萃取，收集 有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，用二氯甲烷和乙醇进行柱层析分离，即得到中间产物1。
[0012] 3)中间产物1和2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸于浓硫酸中加热搅 拌，加热温度为83°C，反应时间6h，冷却后得产物溶液。
[0013] 4)将步骤3)所得反应液中加水后，用碳酸氢化钠中和，二氯甲烷萃取，收集有机 相并用无水硫酸钠干燥，过滤，用二氯甲烷和乙醇进行柱层析分离，得到目标产物2,即本发 明染料最终产品。
[0014] 进一步的，步骤1)中所述2-(2, 4-二羟基苯甲酰）苯甲酸和1，5-二羟基萘的摩 尔比为1:1. 3,二者的总重量与溶剂甲磺酸的重量比为1:2-5。
[0015] 进一步的，步骤3)中所述中间产物1和2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基）苯
[0016] 甲酸的摩尔比为1:1. 2。
[0017] 进一步的，步骤3)中所述中间产物1和2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基）苯甲 酸的总重量与溶剂浓硫酸的重量比为1:2-5。
[0018] 进一步的，步骤4)中所述中和时加入水的体积与反应液的体积比是10-14:1。
[0019] 本发明提供的荧光化合物2在多数有机溶剂中以螺环内酯的结构稳定存在，但对 酸较敏感。化合物2在不同溶剂中的光物理性质如表1所示。
[0020] 表1化合物2在不同溶剂中的光物理性质
[0022] 注：a: "-TFA" 不加 TFA ;b: "+TFA" 加 1% TFA ;c: "一" 吸收值为负数。
[0023] 控制染料介质的pH可以控制染料的光学信号。如下式所示，于酸性介质下，染 料2的双螺环以双羧酸a形式存在，于529nm和和573nm处分别呈现最大吸收峰；在中性 溶剂介质中，双螺环以内酯的关环b形式存在，吸收强度很弱；在强碱性条件下，染料螺环 内酯开启，以双羧酸负离子c形式存在，共辄程度达到最大，最大吸收峰分别位于557nm和 605nm〇
[0024]
[0025] 本发明的优点和有益效果：
[0026] 本发明设计并合成了一种新型氧杂蒽染料，该染料将融合传统染料荧光素和罗丹 明于一体，形成具有双螺环的六元环稠合体系。染料的吸收和发射波长处于深红区域，从而 具备能够用于生物荧光标记成像的可能性。同时染料的光学信号具有可控性，染料的双螺 环结构可以在螺环内酯和开环羧酸以及羧酸负离子之间转换，通过螺环结构转换，调控整 个分子结构中荧光团氧杂蒽环共辄体系（醌式体系形成或消失），拓展其吸收和发射波长， 使光学信号强度发生相应变化。同时所设计的氧杂蒽染料螺环内酯的羧基位置能够很容易 被修饰，从而得到可用于细胞标记成像的荧光探针。 【【附图说明】】
[0027] 图1是本发明的荧光染料化合物2的结构式；
[0028] 图2是化合物2在不同pH水溶液中的紫外吸收光谱图；
[0029] 图3是化合物2在不同pH水溶液中的荧光发射光谱图；
[0030] 图4是化合物2在二氯甲烷溶剂中逐渐滴加 TFA的紫外吸收光谱图。
【具体实施方式】
[0031 ] 实施例1、中间体产物1的制备，具体方法如下：
[0032] 氧杂蒽中间产物1的制备步骤如下：
[0034] 1)将2-(2, 4-二羟基苯甲酰）苯甲酸（0· 492g，2mmol)和1，5-二羟基萘 (0. 427g，2. 6mmol)加入5mL甲磺酸中搅拌，85°C油浴加热反应6-8h，冷却后得产物溶液。
[0035] 2)将上步所得反应液中加入60mL水中，加适量~&!10)3固体中和反应液，热的乙 酸乙酯萃取收集有机相，并用无水Na 2SO4干燥，过滤，所得固体粗产物用二氯甲烷和乙醇过 硅胶色谱柱进行柱层析分离，得到中间产物1，粉白色固体粉末〇.471g，产率62%。熔点： 25