一种ssr分子标记技术在油用牡丹上的标记方法
【专利摘要】本发明提公开一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法。本方法包括设计引物、牡丹基因组DNA的提取、扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等步骤。本方法通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳检测，条带丰富，不使用同位素实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果，并且具有标记数量多，随机分布于动植物整个基因组；每个标记等位位点有较高多态性，多态信息含量高；标记呈孟德尔方式遗传，共显性标记；实验操作过程对DNA质量要求不高，DNA用量少，可靠性好，重复性好；适合油用牡丹属SSR分子标记的扩增，还改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，既节省时间，又节约成本，进一步提高了SSR分子标记在牡丹属上应用的效率。
【专利说明】
-种SSR分子标巧技术在油用壮丹上的标巧方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体的说是一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的 标记方法。
【背景技术】
[0002] 牡丹(Paeonia suffruticosa An化.）为巧药科巧药属牡丹组的木本植物，是原产 于中国的传统名花。其品种丰富，花朵硕大，多姿多彩，雍容华贵。素有"国色天香"、"花中之 王"之称。每年4~5月开花，朵大色艳，奇丽无比，姿丰典雅，花香袭人，深受人们的喜爱。因 此，提高牡丹的研究水平，为促进牡丹产业化发展具有重要意义。
[0003] 分子标记是W个体间遗传物质内核巧酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平 遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记，例如:形态学标记、生物化学标记、细胞学标 记相比，DNA分子标记具有的优越性，体现在大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选 择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶 段，不同组织的DNA都能够用于标记分析;分子标记掲示来自DNA的变异;表现为中性，不影 响目标性状的表达，与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传 育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
[0005] SSR(Simple Sequence R邱eats)标记是近年来发展起来的一种W特异引物PCR为 基础的分子标记技术，也称为微卫星0臟(1；[(31'03日1日11；[1日0酷），是一类由几个核巧酸(一般 为1~6个)为重复单位组成的长达几十个核巧酸的串联重复序列。SS財示记的基本原理为： 根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核屯、序列串联 重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电 泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，通过PCR反 应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等 位基因频率，达到实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果。
[0007] 本发明所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:包括W 下步骤：
[000引步骤一、设计引物
[0009] 利用前人已开发的SSR引物序列，在油用牡丹中进行多态性筛选，选择多态性好的 引物或引物组合作为鉴定油用牡丹的分子身份证；
[0010] 步骤二、牡丹基因组DNA的提取
[00川 1)向离屯、管中预先加入1ml CTAB抽提液及的0-琉基乙醇，混匀，65°C预热；
[0012] 2)称取0.20g油用牡丹幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离屯、管中，摇匀，于65°C 水浴45min;
[0013] 3)冷却至室溫后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，100(K)巧m室溫离屯、 lOmin；
[0014] 4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀；
[0015] 5)将白色絮状沉淀进行漂洗；
[0016] 6)漂洗后白色絮状沉淀于37°CW下的恒溫箱中干燥至半透明；
[0017] 7)用50化1 IxTE溶解沉淀，溶解后-20°C保存；
[001引 S、扩增反应
[0019] 1)将引物稀释到10皿〇1/1后备用；
[0020] 2)在PCR离屯、管内配制PCR反应液；
[0021] 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为： 94°(：预变性3111111，94°(：变性3〇3，退火3〇3,72°(：延伸1111111，30个循环；
[0022] 四、聚丙締酷胺凝胶电泳检测
[0023] 1)在8%聚丙締酷胺凝胶，倒入1XTBE电泳缓冲液，没过短板约2~3mm;
[0024] 2)吸取2~化1样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入化1适合的 DNA分子量标记W作参考；
[0025] 3)接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择lOOv，开始电泳；
[0026] 4)取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05 %硝酸银溶液，置 于摇床上50巧m，染色10~15分钟，冲洗；
[0027] 5)加入新配制好的显色液，5化pm轻摇5~10分钟，直至条带清晰可见，倒出显色 液，用超纯水冲洗凝胶后拱出，扫描图像，储存文件；
[002引五、数据处理
[0029] 使用凝胶成像系统分析软件，对所扫描的图片进行分析，可根据标准分子量的大 小，计算目的条带的分子量大小，并记录；
[0030] 六、分析结果。
[0031] 所述CTAB溶液由lYis-Hcl、EDTA、化cl和水组成，其中10ml CTAB溶液按体积比取 1ml lmol/1 Tris-Hcl，0.4ml 0.5m〇Vl 邸TA，3ml 5m〇Vl Nacl，余量为水。
[0032] 所述PCR反应液由化wer Taq PCR MastermixJorward Primer、Reverse Primer、 DNA和水组成，其中20]ilPCR反应液由2XP〇wer hq PCR MastermixlOuLForward Primer l]il，Reverse Primer l]il，DNA 化1，余量为水。
[0033] 所述TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中50化口 E溶液按体积比取扣1 lmol/1 的Tris-Hcl，lml 0.5m〇Vl的邸TA，余量为水。
[0034] 所述T邸溶液由化is、棚酸、EDTA和水组成，其中1LT邸溶液按体积比取Tri S 108g， 棚酸55g，0.5M/L的邸TA 40ml，余量为水。
[0035] 所述聚丙締酷胺凝胶由TBE、丙締酷胺、过硫酸锭、TEM抓和水组成，其中21ml灭菌 水、3ml 10XTBE、6ml 40%丙締酷胺、240iU 10%过硫酸锭、3化1 TEMED。
[0036] 所述显影液由NaOH、四棚酸钢和水组成，其中1L显影液按体积比取15g化0H、0.2g 四棚酸钢，余量为水。
[0037] 所述显影液的显色方法为，甲醒在显色时加，显色液400ml加入甲醒1.6ml。
[003引10 XT邸电泳缓冲液配方 [0039]
L0042J 本发明所述一种SSR分于标记技术在油用牡丹上的标记方法，其有益效果在于：通 过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳检测，条带丰富，不使用同位素实验 过程简单、实用、耗时短成本低的效果，并且具有标记数量多，随机分布于动植物整个基因 组;每个标记等位位点有较高多态性，多态信息含量高;标记呈孟德尔方式遗传，共显性标 记;实验操作过程对DNA质量要求不高，DNA用量少，可靠性好，重复性好;对油用牡丹SSR分 子标记意义重大，在本发明中选择性扩增PCR体系得到优化，更适合油用牡丹属SSR分子标 记的扩增，而且还改进了聚丙締酷胺凝胶电泳中银染的方法，将银染中固定和染色步骤合 二为一，既节省时间，又节约成本，进一步提高了SSR分子标记在牡丹属上应用的效率。
【附图说明】
[0043] 图1为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[0044] 图2为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[0045] 图3为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[0046] 图4为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[0047] 图5为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[004引图6为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图；
[0049] 图7为选择性扩增聚丙締酷胺凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0050] 实验材料:甘肃紫斑牡丹、六安凤丹、金川凤丹、铜陵凤丹、毫州凤丹、荷泽凤丹、巫 山凤丹、南川凤丹、垫江凤丹、巧药、千年牡丹王。
[0化1] 实施例1
[0052] -种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:包括W下步骤：
[0053] 步骤一、设计引物
[0054] 利用前人已开发的SSR引物序列，在甘肃紫斑牡丹中进行多态性筛选，选择多态性 好的引物或引物组合作为鉴定油用牡丹的分子身份证；
[0化5 ]步骤二、牡丹基因组DNA的提取
[0化6] 1)向离屯、管中预先加入1ml CTAB抽提液及20山的0-琉基乙醇，混匀，65°C预热;所 述CTAB溶液由lYis-Hcl、EDTA、化c巧P水组成，其中10ml CTAB溶液按体积比取1ml lmol/1 Tris-Hcl，0.4ml 0.5mol/l 邸TA，3ml 5mol/l Nacl，余量为水；
[0057] 2)称取0.20g油用牡丹幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离屯、管中，摇匀，于65°C 水浴45min;
[0化引 3)冷却至室溫后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，100(K)巧m室溫离屯、 lOmin;
[0059] 4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀；
[0060] 5)将白色絮状沉淀进行漂洗；
[0061] 6)漂洗后白色絮状沉淀于37°CW下的恒溫箱中干燥至半透明；
[0062] 7)用50化1 IxTE溶解沉淀，溶解后-20°C保存;所述TE溶液由化i s-Hc 1、EDTA和水 组成，其中500iilTE溶液按体积比取扣1 lmol/1的Tris-Hcl，lml 0.5m〇Vl的抓TA，余量为 水；
[0063] S、扩增反应
[0064] 1)将引物稀释到10皿oVl后备用；
[00化]2)在PCR离屯、管内配制20iU PCR反应液;所述20山PCR反应液由2XI^wer Taq PCR Mastermix lOulJorward Primer l]il，Reverse Primer l]il，DNA 化 1，超纯水补齐至20]i 1;
[0066] 3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为： 94°(：预变性3111111，94°(：变性3〇3，退火3〇3,72°(：延伸1111111，30个循环；
[0067] 四、聚丙締酷胺凝胶电泳检测
[006引1)在8%聚丙締酷胺凝胶，倒入1 XTBE电泳缓冲液，没过短板约2~3mm;。
[0069] 所述聚丙締酷胺凝胶由TBE、丙締酷胺、过硫酸锭、TEM抓和水组成，其中21ml灭菌 水、3ml 10XTBE、6ml 40%丙締酷胺、240iU 10%过硫酸锭、3化1 TEMED;
[0070] 所述T邸溶液由化is、棚酸、EDTA和水组成，其中1LT邸溶液按体积比取Tri S 108g， 棚酸55g，0.5M/L的邸TA 40ml，余量为水；
[0071] 2)吸取2~化1样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入化1适合的 DNA分子量标记W作参考；
[0072] 3)接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择lOOv，开始电泳；
[0073] 4)取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05 %硝酸银溶液，置 于摇床上50巧m，染色10~15分钟，冲洗；
[0074] 5)加入显色液，5化pm轻摇5~10分钟，直至条带清晰可见，倒出显色液，用超纯水 冲洗凝胶后拱出，扫描图像，储存文件；
[0075] 所述显影液由NaOH、四棚酸钢和水组成，其中1L显影液按体积比取15g化0H、0.2g 四棚酸钢，余量为水；
[0076] 所述显影液的显色方法为，甲醒在显色时加，显色液400ml加入甲醒1.6ml;
[0077] 五、数据处理
[0078] 使用凝胶成像系统分析软件，对所扫描的图片进行分析，可根据标准分子量的大 小，计算目的条带的分子量大小，并记录；
[0079] 六、分析结果
[0080]将甘肃紫斑牡丹数据图像载入分析软件，根据不同条带大小(bp)排序如下 「mfti 1
[0082] 按照引物1到引物7的顺序依次排列标号可得该样品的分子身份证为： 13547766515
[0083] 综上所述:本方法节省时间、节约成本，进一步提高SSR分子标记在牡丹属上应用 的效率。
【主权项】
1. 一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤一、引物序列 引物 1: F: 5 ' -AACTGCTGAGGGCATAGAG-3 ' R:5 '-CATGATGTTGAGCCACCC-3 '； 引物2: F: 5 ' -ACCTCCTAGACCCAGAGC-3 ' R:5，-GCAACAATCCTGGTAGTGA-3，； 引物3: F: 5 ' -CAATCCGAGTCGTAAGC-3 ' R:5，-CACCTCCTAGACCCAGAG-3，； 引物4: F: 5 ' -GGGGACTCAAATCCTTGCGAAAACCA-3 ' R:5 '-AGGCCTAGTTTTGGTCTGGGCG-3 '； 引物5: F: 5 ' -AGGAGATTGACCGATTGATA-3 ' R:5，-CTGTCTGGCATGGAACG-3，； 引物6: F: 5 ' -GACCGATTTGACCCTCTA-3 ' R:5 '-CTCCCATGTGATGTTGTG-3 '； 引物7: F: 5 ' -TCCTAGACCCAGAGCACC-3 ' R:5 '-GATGTCCCTGAGCCAAGT-3 '； 步骤二、牡丹基因组DNA的提取 1) 向离心管中预先加入lml CTAB抽提液及20μ1的β-巯基乙醇，混匀，65°C预热； 2) 称取0.20g幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离心管中，摇匀，于65°C水浴45min; 3) 冷却至室温后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，10000rpm室温离心 lOmin； 4) 吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀； 5) 将白色絮状沉淀进行漂洗； 6) 漂洗后白色絮状沉淀于37°C以下的恒温箱中干燥至半透明； 7) 用500μ1 ΙχΤΕ溶解沉淀，溶解后-20 °C保存； 三、 扩增反应 1) 将引物稀释到10^11〇1/1后备用； 2) 在PCR离心管内配制20μ1 PCR反应液； 3 )PCR反应程序:将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C 预变性3min，94°C变性30s，退火30s，72°C延伸lmin，30个循环； 四、 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 1) 在8%聚丙烯酰胺凝胶，倒入1 X TBE电泳缓冲液，没过短板约2~3mm; 2) 吸取2~3μ1样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入2μ1适合的DNA分 子量标记以作参考； 3) 接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择ΙΟΟν，开始电泳； 4) 取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05 %硝酸银溶液，置于摇 床上50rpm，染色10~15分钟，冲洗； 5) 加入新配制好的显色液，50rpm轻摇5~10分钟，直至条带清晰可见，倒出显色液，用 超纯水冲洗凝胶后捞出，扫描图像，储存文件； 五、 数据处理 使用凝胶成像系统分析软件，对所扫描的图片进行分析，可根据标准分子量的大小，计 算目的条带的分子量大小，并记录； 六、 分析结果。2. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述(^六8溶液由1^8-此140了六、似(：1和水组成，其中1〇1111(^六8溶液按体积比取111111111〇1/1 Tris-Hcl，0.4ml 0.5mol/l EDTA，3ml 5mol/l Nacl，余量为水。3. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述PCR反应液由Power Taq PCR Mastermix、Forward Primer、Reverse Primer、DNA和水组 成，其中20ylPCR反应液由2XPower Taq PCR Mastermix 10yl，Forward Primer ΙμL， Reverse Primer lyl，DNA 2μ1，余量为水。4. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中500μ1ΤΕ溶液按体积比取5μ1 lmol/1的1^8_ Hcl，lml 0.5mol/l的EDTA，余量为水。5. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述TBE溶液由Tr i s、硼酸、EDTA和水组成，其中1LTBE溶液按体积比取Tri s 108g，硼酸55g， 0.5M/L的EDTA 40ml，余量为水。6. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述聚丙烯酰胺凝胶由TBE、丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED和水组成，其中21ml灭菌水、3ml 10 X TBE、6ml 40%丙烯酰胺、240μ1 10%过硫酸铵、30μ1 TEMED。7. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述显影液由NaOH、四硼酸钠和水组成，其中1L显影液按体积比取15g Na0H、0.2g四硼酸钠， 余量为水。8. 如权利要求1所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于:所 述显影液的显色方法为，甲醛在显色时加，显色液400ml加入甲醛1.6ml。
【文档编号】C12Q1/68GK106048066SQ201610670350
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610670350.8, CN 106048066 A, CN 106048066A, CN 201610670350, CN-A-106048066, CN106048066 A, CN106048066A, CN201610670350, CN201610670350.8
【发明人】张涛, 黄兴琳, 陆俊杏, 廖冰楠, 白瑞英
【申请人】重庆师范大学