利用ssr分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种仁用杏种质鉴定的方法，特别是设及一种利用特异SSR分子标记 结合巧光毛细管电泳检测技术进行仁用杏种质鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 仁用杏化ernel-using apricots)又称"大扁杏"（俞德竣等，1984)，属菩薇科杏 属，仁大、出仁率高、饱满、杏仁味香甜或无苦味，是W产杏仁为主的我国特有杏种质资源 (张加延和张創，2003)。目前，生产栽培中主栽品种W优一、=杆旗、围选一号、龙王帽和一 窝蜂等品种为主，仁用杏适应性强，栽培范围广，具有经济价值高(张眷和魏安智，2005)和 广阔的开发利用前景。
[0003] 长期W来仁用杏不同地区之间引种混乱或地方品种没有准确学名，且一些品种在 形态上类似，传统的形态分类法很难满足仁用杏品种的鉴定，使仁用杏出现"同物异名"、 "同名异物"现象，随着现代分子生物学技术的快速发展，分子标记技术已广泛应用在物种 起源、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种(韩晓颖和梁英海，2009;张靖国和胡红 菊,2009)等研究领域，其中，SSR(simple sequence repeat)标记具有多态性丰富、共显性 遗传等优点，在杏资源中也得到广泛的应用（R. Sa^ Iichez-Pe^rez et al. ,2005; Hedia Bou 巧 Uiba et al.，2010;张淑青和刘冬成，2010;陈娇和王小蓉，2013; Zhe Wang et al.， 2014;)，但对于仁用杏品种鉴别及指纹图谱构建，在SSR标记基础上研究的报道少见；与此 同时，应用RAPD标记技术对鉴别白玉扁、龙王帽、一窝蜂和优一等4个仁用杏品种也较困难 (王玉柱等，2006)。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决上述问题而提供了一种利用特异SSR分子标记进行仁用杏种质鉴 定的方法，该方法所利用的SSR分子标记鉴别能力强且数量合适，能够覆盖主要仁用杏种质 资源的遗传多样性。
[0005] 本发明提供了一种利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法，包括如下步骤： 利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为 待鉴定的种质；将W上两个步骤得到的扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测后进行比 对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用的分子标记选自如下SS財示记:UDP98-409、 抓口98-406、抓？97-401、9油卵312、]^039日、]^020日、8??(：1'002、8??(：1'007和8??(：1'008，抓口98-409的正向引物和反向引物分别如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，UDP98-406的正向引物 和反向引物分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，UDP97-401的正向引物和反向引物分 别如沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6所示，pchgmsl2的正向引物和反向引物分别如沈Q ID NO: 7和SEQ ID N0:8所示，MA039a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID N0:9和沈Q ID N0:10 所示，]^020曰的正向引物和反向引物分别如569 10顯：11和569 10^:12所示，8口口(：1'002 的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示，BPPCT007的正向引物和 反向引物分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示，BPPCT008的正向引物和反向引物分别 如沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18所示。
[0006] 所用的分子标记可W优选自所述SSR分子标记中的MA039a、UDP98-409、MA020a、 pch卵sl2和BPPCT007。
[0007] 所用的分子标记例如为所述SSR分子标记中的MA039a。
[000引所述分子标记MA039a还与第二分子标记组合，所述第二分子标记为pchgmsl2、 MA020a、BPPCT002、UD97-401和UD98-406。
[0009] 在上述技术方案的基础上，PCR扩增采用2条引物来进行，第一引物为所述SSR分子 标记的正向引物和M13序列相连组成带M13尾的引物;第二引物为所述SSR分子标记的反向 引物;M13尾的序列如SEQ ID NO: 19所示。
[0010] 本发明还提供了一种鉴定仁用杏种质的SSR分子标记检测试剂盒，所述仁用杏SSR 分子标记为所述所用的分子标记。
[0011] 本发明还提供了一种仁用杏遗传资源多样性的分析方法，为分子标记扩增分析 法，其利用上述仁用杏SSR分子标记的扩增引物进行扩增分析。
[0012] 优选地，所述PCR扩增利用SSR巧光标记，扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测。 [001引优选地，PCR扩增采用2条引物来进行，第一引物为SSR分子标记的正向引物和M13 序列相连组成带M13尾的引物;第二引物为SSR分子标记的反向引物;M13尾的序列如SEQ ID NO: 19所示。
[0014] 本发明从来自桃基因组DNA的17对SSR引物中筛选出多态性高、重复性好且条带清 晰9对SSR引物，对我国16个仁用杏主栽品种建立指纹图谱，并利用该技术对仁用杏品种鉴 定、多样性评价和亲缘关系分析等奠定基础，为仁用杏品种进行改良及合理利用提供技术 和理论依据，特别是使用单独一个引物MA039a就能鉴别80D05、白玉扁、薄香甜、迟掷子、丰 仁、龙王帽、围选一号、新四号、一窝蜂、优一和油仁共11个品种。此外，本发明采用毛细管电 泳法检测巧光SSR引物扩增PCR产物，比传统的聚丙締酷胺凝胶电泳检测法，简单准确、无毒 害，通量高。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记UDP98-409 的16个仁用杏品种指纹图谱；
[0016] 图2为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记MA020a的16 个仁用杏品种指纹图谱；
[0017] 图3为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记pchgmsl2的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[001引图4为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记BPPCT002的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[0019] 图5为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记MA039a的16 个仁用杏品种指纹图谱；
[0020] 图6为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记BPPCT007的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[0021] 图7为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记BPPCT008的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[0022] 图8为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记UD97-401的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[0023] 图9为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SS財示记UD98-406的 16个仁用杏品种指纹图谱；
[0024] 图10为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中16个仁用杏品种的 SSR扩增谱带的UPGMA聚类图。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过具体实施例进一步说明本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的 方法的技术方案。
[0026] 第一实施例、仁用杏材料的获得及其DNA的提取
[0027] 1、获得仁用杏材料
[00%] 2013年6月-7月期间从中国林业科学研究院经济林研发中屯、杏基因库采集了 16份 仁用杏样品，选取无病虫害，新鲜当年生的嫩叶，保存于-8(TC低溫冷藏冰箱备用。采集的该 16份仁用杏样品为我国主要栽培的仁用杏品种，具体信息如表1所示。
[0029] 表1、16个仁用杏品种的具体信息
[0030]
[(
[0032] 2、基因组DNA的提取及浓度测定
[0033] 采用改良的CTAB法(冯晨静和张元慧，2005)提取上述16份杏品种基因组DNA，用浓 度为1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并用紫外分光光度计检测含量及纯度后，将DNA 样品浓度调至50ng ? ykl，保存于-80°C度超低溫冰箱备用。
[0034] 第二实施例、SSR引物筛选和PCR扩增
[0035] 1、获得供试筛选的SSR引物
[0036] 选取17对来自桃基因组DNA的SSR引物供试筛选，最终筛选多态性高、条带清晰并 重复性好的9对开发自桃基因组DNA的SSR引物，具体信息如表2所示。
[0037] 表2、9对供试筛选的SSR引物信息
[00381
[0039] 2、PCR 扩增
[0040] 利用SSR巧光标记检测技术TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)(Markus S.et al.，2000)毛细管电泳巧光检测法对16个仁用杏不同品种进行 研究。SSR正向引物和携带巧光标记FAM、肥D、VIC或阳T等的M13序列（如沈Q ID NO: 19所示） 相连组成带Ml3尾的巧光正向引物(例如:某正向引物序列为5/ -CGGACTCTTATCCTCTATCAACA -3'，则该引物的正向引物为5' -TGTAAAACGACGGCCAGT CGGACTCTTATCCTCTATCAACA-3' ); PCR 扩增反应体系为20ul的混合体系，具体如表3所示。
[0041 ] 表3 PCR反应体系<