专利名称：一种甘蓝种子遗传纯度的快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蓝种子遗传纯度的快速鉴定方法，利用ISSR和SSR分子标记技术进行甘蓝品种新夏50种子遗传纯度的检测，属于生物技术领域。
背景技术：
蔬菜杂种制种过程中，母本系自交的种子常混杂于F1中，严重影响种子的质量和纯度。目前甘蓝杂交种子主要是利用自交不亲和系或雄性不育系制种，但是由于自交不亲和性本身的缺陷以及雄性不育的微粉问题常常会导致母本自交产生假杂种(Crockett，P.A.，Bhalla，P.L.，Lee，C.K.，Singh，M.B..RAPD analysis of seed purity in a commerical hybrid cabbage(Brassica oleracea var.capitata)cultivar.Genome 2000，43，317-321.)，这将给育种工作者、生产销售者及购买者带来不必要的损失。因此，在杂种种子销售用于生产之前，对杂种一代种子的遗传纯度进行准确鉴定是极其重要的。
对甘蓝品种的纯度检测目前主要有田间形态学鉴定、同工酶鉴定，但田间形态学鉴定需要播种育苗，移栽入大田中，然后对形态特征进行观察，耗时长，工作量大，受季节影响，费用高。且有时由于甘蓝假杂种与真杂种之间形态学的差异表现不是很明显，在苗期及成株期不容易鉴别，尤其当亲本之间遗传基础很近时，更加不易鉴别。同工酶分析易受到环境和所取材料部位的影响，且对于一些亲本遗传差异较小的杂交品种，同工酶有时难以进行纯度检测与品种鉴定，准确度不高(柳李旺，侯喜林，龚义勤，张玉明，王开荣，郑军飞.分子标记技术在蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中的作用.分子植物育种，2004，2(4)563～568.)。基于PCR技术的ISSR和SSR分子标记技术经体系优化和操作程序优化，稳定性好，且成本较低，准确可靠，简便快速的优点，成为甘蓝品种种子纯度鉴定的首选技术之一。
发明内容
技术问题本发明的目的是提出甘蓝品种‘新夏50’种子遗传纯度的快速鉴定方法，筛选出能够在一代杂种中产生具有父母本特异标记条带且不受环境影响的分子标记，用于鉴定甘蓝商品种子的遗传纯度，可以大大提高纯度鉴定的效率，从而为其种子纯度的快速鉴定建立起高效准确的质量控制方法。
技术方案甘蓝品种‘新夏50’种子纯度的快速鉴定方法，包括以下步骤(1)提取甘蓝新夏50幼苗基因组DNA；(2)采用任一种特征性引物ISSR引物NAUISR1034AGAGAGAGAGAGAGAGAA或SSR引物组合NAUSSR1011正引物GCAAACGATTTGTTTACCCGNAUSSR1011反引物CGTGTAGGGTGATCTAGATGGG
以甘蓝‘新夏50’基因组DNA为模板；进行PCR扩增；(3)将扩增后的DNA片段，分别进行琼脂糖和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(4)只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带即被记为假杂种，对电泳结果进行分析，计算其种子纯度，其中ISSR引物NAUISR1034产生大小为600 bp的母本特异标记NAUISR1034600，产生大小为1900 bp的父本特异标记NAUISR10341900；SSR引物NAUSSR1011产生大小为210bp的母本特异标记NAUSSR1011210，产生大小为260bp的父本特异标记NAUSSR1011260。
上述PCR扩增程序为ISSR-PCR反应体系含20ng基因组DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1ISSR引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35个循环，72℃10min延伸，4℃保存；SSR-PCR反应体系含20ng基因组DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1正引物和0.5umol·L-1反引物，0.5U TaqDNA聚合酶；PCR扩增程序95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32个循环，72℃7min延伸，4℃保存。
不同分子量与序列差异的DNA片段在电泳图谱上分布于不同的位置，通过比较和分析DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段及电泳图谱的位置差异，进行对甘蓝‘新夏50’杂种遗传纯度的鉴定。有益效果本发明的检测方法，具有准确性高，不受被测样品环境的影响，成本低，且可在整个生长季节都可检测等优点。能够在1～2周内准确地鉴定出种子遗传纯度。
图1是甘蓝‘新夏50’及其亲本的DNA片段引物NAUISR1034的ISSR电泳图谱；图2是甘蓝‘新夏50’及其亲本的DNA片段引物NAUSSR1011的SSR电泳图谱。
1母本；2父本；3杂种；M是用于纠正实验偏差的标准分子量。
具体实施例方式
首先从DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测等环节对现有ISSR和SSR技术进行优化，建立了一套快速准确的适于甘蓝杂种遗传纯度检测的ISSR和SSR操作程序如下(1)DNA提取参考Liu，L.W.，W.Z.Guo，X.F.Zhu，and T.Z.Zhang.Inheritance and fine mapping of fertilityrestoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.Theor.Appl.Gene.2003，106461-469.所述CTAB法并加以改进。在甘蓝‘新夏50’两叶一心时取幼嫩叶片约0.2g，经液氮研磨，加入500μlCTAB裂解液(2％CTAB，2M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)与0.2％的β-巯基乙醇)转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合物后轻轻摇晃，将乳状物离心12000r/min，8～10min，上清液用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1～2次，加入预冷异丙醇后4℃冰箱静置3小时以上，收集絮状DNA用70％乙醇洗涤，干燥后溶于TE中备用。利用紫外分光度计进行DNA纯度分析和定量检测。
(2)标记分析ISSR反应体系含20ng基因组DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。在PTC-100热循环仪上进行PCR扩增，扩增程序为94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35个循环，72℃10min延伸，4℃保存。SSR反应体系含20ng基因组DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5umol·L-1正引物和0.5umol·L-1反引物，0.5U Taq DNA聚合酶；在PTC-100热循环仪上进行PCR扩增，扩增程序为95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32个循环，72℃7min延伸，4℃保存。
(3)扩增产物检测ISSR-PCR扩增产物采用含有溴化乙锭(EB)的1.2％琼脂糖凝胶电泳。采用1×TAE电泳缓冲液(1L中含有0.242g Tris，0.057ml冰醋酸，0.2ml 0.25mol/L EDTA pH8.0)。扩增后的DNA样品加入4ul 6×加样缓冲液(含有0.25％溴酚蓝、30％蔗糖)，混匀后用移液器加样，在120V恒压条件进行电泳0.8-1小时，以扩增的DNA条带充分展开为止。
SSR-PCR扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。25mL凝胶中含有Arc∶Bis(29∶1)6.65mL，5×TBE 5mL，TEMED 20uL，10％AP 0.3mL。PCR产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶上分离。预电泳50-60V 30min；120V电泳2-2.2小时。凝胶采用0.5％冰醋酸，10％的乙醇固定12-20min；0.2％AgNO3溶液染色10-20min；蒸馏水洗涤两次后于显影液(1.5％NaOH，0.4％甲醛，0.002％Na2S2O3)显影；最后放于0.75％Na2CO3保存。
(4)特征性引物的筛选适用于甘蓝品种‘新夏50’种子遗传纯度鉴定的ISSR和SSR引物应具有以下两个特征①要求引物本身多态性信息量要高，从而具有较强的鉴别假杂种的能力；②在甘蓝杂交种及其双亲表现多态性，从而可以鉴别杂交种中最常见的自交苗。从72个ISSR引物和44对SSR引物中筛选出多态性高、带型清晰、重复性好的ISSR引物50个和SSR引物16对，作为甘蓝优良品种种子遗传纯度鉴定的核心引物；从核心引物中进一步筛选出在甘蓝新夏50杂种图谱中具有父本、母本特异条带的特征性引物，并通过田间常规鉴定与室内鉴定比较，验证引物可靠性，确定出可以应用于甘蓝新夏50遗传纯度鉴定的特征引物2个NAUISR1034和NAUSSR1011，引物NAUISR1034产生母本标记NAUISR1034600，及父本标记NAUISR10341900(图1)；引物NAUSSR1011产生母本标记NAUSSR1011210，及父本标记NAUSSR1011260(图2)。
(5)杂种种子遗传纯度的判定2个特征引物均能在杂种中鉴定出父母本特异互补条带，ISSR引物NAUISR1034产生大小为600bp的母本特异标记NAUISR1034600，及大小为1900bp的父本特异标记NAUISR10341900(图1)；SSR引物NAUSSR1011产生大小为210 bp的母本特异标记NAUSSR1011210，及大小为260bp的父本特异标记NAUSSR1011260(图2)。这1个ISSR标记和1个SSR标记在多次重复中表现稳定，可有效用于鉴定甘蓝杂交种种子的纯度。应用这2个特征引物分别对杂种幼苗中一定数量(100株以上)的单株进行遗传纯度的鉴定。只有能同时检测到父母本特异标记的甘蓝杂种单株才能视为真杂种，缺少其中任意一条带即认为是假杂种。通过应用特征引物NAUISR1034和NAUSSR1011对杂种单株标记基因型进行分析，将两特征引物检测获得的纯度结果的平均值记为甘蓝杂种种子的遗传纯度。ISSR和SSR分子标记技术方法简便，经济实用，适合用于甘蓝的品种鉴定和种子纯度检测，并且利用复合标记分析可以更加准确地进行甘蓝杂种种子的纯度鉴定。
其中ISSR引物NAUISR1034，其含义为“NAU”代表“南京农业大学”；“ISR”代表ISSR引物，“1034”代表实验室引物编号；SSR引物代号NAUSSR1011，其含义是“NAU”代表“南京农业大学”；“SSR”代表简单重复序列标记引物，“1011”代表实验室引物编号。
权利要求
1.甘蓝品种‘新夏50’种子遗传纯度的鉴定方法，包括以下步骤(1)提取甘蓝幼苗基因组DNA；(2)采用ISSR引物NAUISR1034AGAGAGAGAGAGAGAGAA和SSR引物NAUSSR1011正向引物GCAAACGATTTGTTTACCCGNAUSSR1011反向引物CGTGTAGGGTGATCTAGATGGG以甘蓝基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(3)将扩增后的DNA片段，分别进行琼脂糖(ISSR扩增产物)和非变性聚丙烯酰胺凝胶(SSR扩增产物)电泳检测；(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一个条带即记为假杂种，计算其种子纯度，其中ISSR引物NAUISR1034产生大小为600bp的母本特异标记NAUISR1034600，产生大小为1900bp的父本特异标记NAUISR10341900；SSR引物NAUSSR1011产生大小为210bp的母本特异标记NAUSSR1011210，产生大小为260bp的父本特异标记NAUSSR1011260。
2.根据权利要求1所述的甘蓝品种‘新夏50’种子纯度的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增程序为ISSR-PCR反应体系含20ng基因组DNA，2.5mmol·L-1MgCl2，0.156mmol·L-1dNTPs，0.5μmol·、L-1ISSR引物NAUISR1034，0.64U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序94℃3min，94℃30S，55℃1min，72℃1.5min，35个循环，72℃10min延伸，4℃保存；SSR-PCR反应体系含20ng基因组DNA，2.0mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTPs，0.5 μ mol·L-1正向引物和0.5μmol·L-1反向引物，0.5U Taq DNA聚合酶；PCR扩增程序95℃2min，94℃40S，60℃45S，72℃1min，32个循环，72℃7min延伸，4℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝种子遗传纯度的快速鉴定方法，属于生物技术领域。其步骤是提取甘蓝基因组DNA，利用筛选出的特征引物NAUISR1034和NAUSSR1011进行PCR扩增，将扩增后的DNA片段分别进行琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别电泳0.8－1和2－2.2小时后，拍摄电泳图谱。通过比较和分析电泳图谱中DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段大小与位置差异，进行甘蓝“新夏50”杂种遗传纯度的鉴定。本发明的检测方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段与环境影响，成本低，且可在整个生长季节都可进行等优点。
文档编号G01N21/84GK101017152SQ20071002004
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者柳李旺, 刘广, 龚义勤, 归为民 申请人:南京农业大学