两种黑芥基因组dna序列及其应用
【专利摘要】本发明公开了两种黑芥基因组DNA序列及其应用。本发明提供了用于鉴定芸薹属植物B基因组的成套DNA分子，为由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本发明的实验证明，CL13和CL76的获得使芸薹属作物的染色体的识别更容易、准确，填补了芸薹属作物染色体鉴定上无理想探针可用的空缺。
【专利说明】
两种黑芥基因组DNA序列及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及两种黑芥基因组DNA序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 十字花科芸臺属蔬菜包括^白菜为代表的4基因组化日33；[。日.拘口日(44，]1=10)，黑 芥的B基因组，B.nigra(BB，n = 8)，和甘蓝为代表的C基因组B.oleracea(CC，n = 9)，W及他 们自然加倍形成的S个异缘四倍体复合种：甘蓝型油菜类B.napus(AACC，n = 19)，芥菜类 B.扣11。6日(4488，11=18)，和埃塞俄比亚芥8.。日'111日1日（880：，11 = 17)，组成了著名的1]^角。 黑芥是芸臺属的野生种，与农业上重要的二倍体种白菜和甘蓝相比，黑芥的遗传及细胞学 研究相对有限，芸臺属物种进化和倍性演化研究也受到B基因组信息缺乏的限制。
[0003] 黑芥在长期的生态适应下保留了很多优良性状，如抗多种病原体(Groat ,2003; Pradhan et al.,2011)，和优异的种油质量（畑6vre et al.,1991;Pradhan et al., 2011)。运些都是芸臺属育种的重要基因源，人们也通过种间杂交尝试转移利用运些优良性 状（Sacristan and Gerdemann,1986； Sjodin and Glimelius,1989；Struss et al.,1991; Gerdemann-Knc6rcket al.,1994;Wang et al.,2011)。然而，B基因组的遗传和细胞学信息 的缺乏阻碍了其基因的转移和利用。
[0004] 作为芸臺属=个基本种之一的二倍体物种，黑芥在栽培种遗传改良、基因组构成 和多倍体进化研究中都是重要的研究材料，随着A、C基因组的快速研究，黑芥B基因组的研 究也将越来越受到重视，黑芥基因组测序计划也已启动，因此其细胞遗传学研究也必须先 前一步。
[0005] 芸臺属蔬菜染色体小，尤其是B基因组的黑芥，完全不可能靠形态识别所有染色 体，核型是细胞遗传学研究的基础和关键。目前，关于芸臺属B基因组的染色体核型分析鲜 有报道，基本还停留在染色体形态和C显带技术上，重复性差，辨别受主观因素影响大，方法 繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供用于鉴定芸臺属植物B基因组的成套DNA分子。
[0007] 本发明提供的成套DNA分子，为如下1)或2):
[000引1)由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组 成；
[0009] 2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成；
[0010] 序列A为与序列1同源性大于95 %的序列；
[0011] 序列B为与序列2同源性大于95%的序列。
[0012] 本发明另一个目的是提供用于鉴定芸臺属植物B基因组的成套载体。
[0013] 本发明提供的成套载体，由表达序列1所示的单链DNA分子的重组载体和表达序列 2所示的单链DNA分子的重组载体组成。
[0014] 表达序列1所示的单链DM分子的重组载体为将序列1所示的化13序列克隆到PMD- 18T载体上得到的质粒。
[0015] 表达序列2所示的单链DNA分子的重组载体为将序列2所示的化76序列克隆到PMD- 18T载体上得到的质粒。
[0016] 本发明第3个目的是提供用于鉴定芸臺属植物B基因组的试剂盒。
[0017] 本发明提供的试剂盒，包括上述的成套DNA分子或上述的成套载体。
[0018] 上述中，所述序列1所示的单链DNA分子的核巧酸和所述序列2所示的单链DNA分子 的核巧酸标记不同的巧光基团。
[0019] 上述成套DNA分子或上述成套载体或上述试剂盒在区分或辅助区分或鉴定或辅助 鉴定芸臺属植物B基因组各条染色体中的应用也是本发明保护的范围。
[0020] 上述成套DNA分子或上述成套载体或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测芸臺属植 物中含有黑芥的B基因组染色体的哪条染色体中的应用也是本发明保护的范围；其中，待测 芸臺属植物具体为非黑芥；
[0021] 或，上述成套DNA分子或上述成套载体或上述试剂盒在鉴定待测植物的基因组中 是否含有来源于黑芥的B基因组的染色体或某条染色体中的应用也是本发明保护的范围。
[0022] 上述中，所述芸臺属植物为黑芥。
[0023] 本发明第4个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测芸臺属植物中来源于黑芥的B 基因组染色体为几号染色体的方法。
[0024] 本发明提供的方法，包括如下步骤:采用上述成套DNA分子中的2个单链DNA分子作 为探针，分别对待测芸臺属植物和黑芥进行双色巧光原位杂交，根据所述待测芸臺属植物B 基因组染色体的信号位置与所述黑芥的B基因组8条染色体的信号位置进行比较，若所述待 测芸臺属植物B基因组染色体的信号位置与黑芥的B基因组某条染色体的信号位置一致，贝U 所述待测芸臺属植物B基因组染色体为或候选为黑芥的B基因组该条染色体。
[0025] 序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子在作为 鉴别黑芥的B基因组的探针中的应用也是本发明保护的范围。
[0026] 本研究将利用两个重复序列结合巧光原位杂交(FISH)技术建立黑芥的细胞遗传 学核型。通过信号强弱和位置关系很容易清晰的地辨别黑芥各条染色体。该技术和方法将 为芸臺属物种进化、基因组和细胞学分析等分子生物学研究提供便利。
[0027] 本发明的实验证明，（1)化13和化76的获得使芸臺属作物的染色体的识别更容易、 准确，填补了芸臺属作物染色体鉴定上无理想探针可用的空缺；（2)通过化13和化76可W对 B基因组来源的每条染色体进行准确的辨别；（3)在利用黑芥进行远缘杂交(包括体细胞杂 交)种质创新中可提供黑芥染色体可视的细胞学标记；（4)结合其它标记对黑芥基因组遗传 图谱和物理图谱的组装进行验证和补充；（5)结合其它标记对检测B基因组的易位、倒位、渐 渗、和附加系的鉴定提供便利。
【附图说明】
[002引图1为化13(绿）和化76(红)在黑芥BB上的FI甜杂交结果，Bar = 5皿。
[0029]图2为化13和化76鉴别黑芥每条染色体的核型模式图。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 白菜北京新2号（8.招9日，44，11=10)、黑芥乂1/1'（8.111旨招，88，11 = 8)、甘蓝类甘蓝 97-6(B.oleracea，CC,n = 9)。
[0033] 实施例1、DNA重复序列化13和化76的分离
[0034] W黑芥'Gl/r为材料，通过随机基因组测序获得0.6G的碱基数相当于约0.8倍的 黑芥基因组（W基因组大小为630Mb计算，Johnston et al.,2005)。结合Nov自k et al. (2010)和Macas et al. (2010)的方法对序列进行重复序列分析，发现了其中两个基因组含 量较丰富的串联重复序列化13和化76，并通过PCR克隆验证。
[0035] 化13的核巧酸序列为序列表中的序列1。
[0036] 化76的核巧酸序列为序列表中的序列2。
[0037] 实施例2、DNA重复序列化13和化76作为检测探针的应用
[003引 一、CL13和化76作为检测探针的巧光原位杂交(FISH)试验方法
[0039] 1、染色体制片
[0040] 1)将待测植物种子放在有湿润滤纸的培养皿中，室溫下生根；
[0041 ] 2)待根尖长度0.5-lcm时，切下根尖放入装有cb出0的试管中，并将该试管放入盛有 冰水混合物的冰盒于冰箱中放置22-24h进行预处理；
[0042] 3)将经过预处理的根尖放入固定液(无水乙醇:冰醋酸=3: l(v/v))中固定1-7天；
[0043] 注意：要想在原位杂交中获得比较好的结果，固定时间不能太长，当然，如果固定 时间少于两天制片时也相对较难。
[0044] 4)将根尖分生组织部分切下与4% (体积百分含量)纤维素酶和1 % (体积百分含 量)果胶酶混合液中，37°C处理50min，软化根尖；
[0045] 5)将软化的根尖用cb出0小屯、清洗，浸泡15min;
[0046] 6)重新用乙醇：冰醋酸体积比3:1的固定液固定，并转移至干净的载玻片上，于 45% (体积百分含量)的冰醋酸中挤碎制片；
[0047] 7)将片子于-70°C冰箱中保存，运样可W长久保存且不严重影响原位杂交的结果， 得到染色体制片。
[004引 2、探针制备
[0049] 1)缺口平移标记探针反应体系
[0050] 缺口平移标记探针反应体系见表1和表2所示。
[0051 ] 含化13序列的质粒为将序列1所示的化13序列克隆到PMD-18T载体上得到的质粒。
[0052] 含化76序列的质粒为将序列2所示的化76序列克隆到PMD-18T载体上得到的质粒。
[0053] 表1为缺口平移标记化13探针反应体系
[0化4]
[0化5]
[0化6]
[0化7] 2)用cb此0调整总缺口平移标记探针反应体系至5化L，每加入一种溶液要混合，加 完后离屯、充分混匀；
[0058] 3)将装有50化反应液的试管于水浴锅中14-15 °C水浴化；
[0化9] 4)加入化L终止缓冲液(200mM的邸TA)终止反应。
[0060] 注意：
[0061] l)l〇X缓冲液:0.5M Tris 肥l，pH 7.5,50mM MgCb
[0062] dNTP溶液：0.5mM dATP，0.5mM dGTP，0.5mM dCTP
[0063] 加 TP溶液:0.166mM加 TP(生物素或地高辛标记），0.333mM dTTP
[0064] 2)探针标记最关键的部分是最后的切口平移产物的大小，当标记的探针大小约为 200-600bp时，原位杂交将获得好的结果。
[0065] 3)为确定探针大小，吸取反应液化L于沸水中变性4min，并立刻置于冰上冷却，然 后在小型凝胶样品上电泳。
[0066] 4)切口平移产物的大小可W通过在反应溶液中加入不同量的DNA酶I进行调整。
[0067] 3、探针与染色体杂交
[006引1)用刀片掲掉盖玻片（片子保存于-80°C冰箱），将片子置于梯度酒精(70% ,95%， 100 % )中洗脱，每个梯度洗5min，室溫下惊干。片子应在原位杂交前干燥几小时。
[0069] 2)杂交液反应体系的制备
[0070] 表3为杂巧液反应体系
[0071]
[0072] 3)用cb也0调整杂交反应体系至20化，确保溶液充分混合，因为50 %的硫酸葡聚糖 非常粘稠。
[0073] 4)将混合液于80°C干浴器上变性5min，并立刻置于冰上。离屯、混匀，得到杂交混合 液。
[0074] 5)向干燥的片子上滴加15化L溶于2X SSC的70%甲酯胺溶液，盖上22X40mm的盖 玻片，放在平板(金属或玻璃)上于80°C烘箱中烘烤1.5minD(10血溶于2X SSC的70%甲酯胺 溶液：7mL 甲酯胺，lmL 20X SSC，2mL d2也0)。
[0075] 6)掲掉盖玻片，然后将其浸到梯度冷乙醇(70% ,95% ,100%，-20°C，每梯度5min) 中洗脱，空气中干燥。
[0076] 7)每张片子加 10化上述4)得到的杂交混合液，盖上18 X 18mm盖玻片，用粘合剂密 封片子，并置于湿盒中。
[0077] 注意：可W用任何一个盒子，盒底垫上两层3mm的湿滤纸，用塑料棒或其他东西支 撑片子。
[007引8)将湿盒放入37 °C恒溫箱中解育，最少六小时或过夜。
[0079] 注意；
[0080] 1)可W用相差显微镜镜检，W确保细胞处于分裂中期，且染色体形态较好，运是非 常重要的，如果洗脱干燥后染色体状态很差很难获得令人满意的杂交结果。
[OOW] 2)甲酯胺的质量很重要，用的购于Sigma公司，效果很好。
[0082] 4、杂交信号巧光检测
[0083] 1)用綴子刮开粘合剂，然后将片子放入盛有2X SSC的染色缸中，轻轻摇洗直至盖 玻片从载玻片上掉下来。
[0084] 2)按下列步骤洗涂玻片：
[00化]表4为杂交液洗脱过程
[0086]
[0087] 注意：可[^通巧提高2X SSC的洗深溫度和时间来降低背景，上还洗深万巧大部分 效果较好。
[008引3)将玻片在纸巾上控干水分(不要太干），滴加10化L FITC异硫氯酸巧光素(根据 不同试剂公司稀释1:50至1:200)，盖上22 X 40mm的盖片，37°C解育30min。
[0089] 4)通过倾斜玻片或将玻片浸入盛有IX PBS的烧杯中，掲掉盖片，然后用IX PBS在 室溫下摇洗玻片=次，每次5min。
[0090] 5)在纸巾上控干水分，滴加10化L罗丹明标记的抗地高辛抗体(根据不同试剂公司 稀释1:50至1:200)，盖上22 X 40mm的盖片，37°C解育30min。
[0091] 6)通过倾斜玻片或将玻片浸入盛有IX PBS的烧杯中，掲掉盖片，然后用IX PBS在 室溫下摇洗玻片=次，每次5min。
[0092] 7)在纸巾上控干水分，滴加一滴含有抗泽灭剂（购自Vector)的化g/mL的DAPI即 4'，6-二脉基-2-苯基吗I噪（4'，6-diamidin〇-2-phenylindole)，盖上盖片。
[0093] 8)巧光显微镜检测原位杂交结果:FITC标记的探针在巧光下呈黄绿色信号，罗丹 明标记的探针在巧光下呈红色信号。染色体为DAPI的蓝色信号。
[0094] 二、检测
[0095] 按照上述一的方法，W化13和化76序列作为检测探针，分别对黑芥（BB)、白菜 (AA)、甘蓝(CC)不同材料的单株进行FISH谈光原位杂交)分析。
[0096] 白菜(AA)和甘蓝(CC)的FI甜结果显示，白菜AA基因组和甘蓝CC基因组上均没有明 显杂交信号。
[0097] 黑芥(BB)的FI甜结果如图1所示，黑芥的BB基因组的8对染色体上分别有不同的杂 交信号特征;两个序列的双色FISH可W将黑芥8对染色体明确的辨别；1号染色体:CL13含量 最多，在染色体两臂端部均有信号;2号染色体:CL13染色体短臂端部有信号，CL76的信号在 长臂上靠近着丝粒;3号染色体:CL13信号位于染色体长臂端部;4号染色体:CL13在染色体 两臂端部均有信号；5号染色体:CL13信号位于染色体长臂端部，CL76的信号在长臂近着丝 粒区；6号染色体:CL13信号最弱，位于染色体长臂端部，CL76的信号最强，含量最多，位于染 色体短臂；7号染色体:没有明显的化13和化76杂交信号；8号染色体:化13在染色体两臂端 部均有信号，CL76的信号在短臂近着丝粒区。
[0098] 图2是化13和化76在黑芥8条染色体上的示意图。
[0099] 上述结果表明，利用化13和化76为探针，通过双色FI甜技术，一次杂交就可W将芸 臺属B基因组的8条染色体准确无误的辨别，提供了黑芥染色体可视的细胞学标记。
【主权项】
1. 用于鉴定芸薹属植物B基因组的成套DNA分子，为如下1)或2): 1) 由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成； 2) 由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成； 序列A为与序列1同源性大于95 %的序列； 序列B为与序列2同源性大于95%的序列。2. 用于鉴定芸薹属植物B基因组的成套载体，由表达序列1所示的单链DNA分子的重组 载体和表达序列2所示的单链DNA分子的重组载体组成。3. 用于鉴定芸薹属植物B基因组的试剂盒，包括权利要求1所示的成套DNA分子或权利 要求2所示的成套载体。4. 根据权利要求1所示的成套DNA分子或权利要求2所示的成套载体或权利要求3所述 的试剂盒，其特征在于:所述序列1所示的单链DNA分子的核苷酸和所述序列2所示的单链 DNA分子的核苷酸标记不同的焚光基团。5. 权利要求1所述成套DNA分子或权利要求2所示的成套载体或权利要求3所述的试剂 盒在区分或辅助区分或鉴定或辅助鉴定芸薹属植物B基因组各条染色体中的应用。6. 权利要求1所述成套DNA分子或权利要求2所示的成套载体或权利要求3所述的试剂 盒在鉴定或辅助鉴定待测芸薹属植物中含有黑芥的B基因组染色体的哪条染色体中的应 用； 或，权利要求1所述成套DNA分子或权利要求2所示的成套载体或权利要求3所述的试剂 盒在鉴定待测植物的基因组中是否含有来源于黑芥的B基因组的染色体或某条染色体中的 应用。7. 根据权利要求1所示的成套DNA分子或权利要求2所示的成套载体或权利要求3所述 的试剂盒或权利要求6或7所述应用，其特征在于:所述芸薹属植物为黑芥。8. -种鉴定或辅助鉴定待测芸薹属植物中来源于黑芥的B基因组染色体为几号染色体 的方法，包括如下步骤:采用权利要求1所述成套DNA分子中的2个单链DNA分子作为探针，分 别对待测芸薹属植物和黑芥进行双色荧光原位杂交，根据所述待测芸薹属植物B基因组染 色体的信号位置与所述黑芥的B基因组8条染色体的信号位置进行比较，若所述待测芸薹属 植物B基因组染色体的信号位置与黑芥的B基因组某条染色体的信号位置一致，则所述待测 芸薹属植物B基因组染色体为或候选为黑芥的B基因组该条染色体。9. 序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子在作为鉴 别黑芥的B基因组的探针中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106048057SQ201610643986
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月8日 公开号201610643986.3, CN 106048057 A, CN 106048057A, CN 201610643986, CN-A-106048057, CN106048057 A, CN106048057A, CN201610643986, CN201610643986.3
【发明人】王桂香, 刘凡, 何群燕, 李静, 宗梅, 郭宁, 韩硕
【申请人】北京市农林科学院