七种不同种属来源细胞的pcr检测引物和检测方法与应用
【专利摘要】本发明公开了对实验室常用的七种不同种属来源的细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的PCR检测引物和检测方法与应用。本发明的检测引物包括7对引物，且各引物仅对各自种属细胞的细胞色素b(Cytb)基因片段有特异性扩增，因此，用本发明的引物可以一次性对7种种属来源的细胞进行检测，具有较高的特异性，不仅可以对实验室常用细胞的种属来源(即细胞来源的可靠性)进行鉴定，还可以对培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染进行判定，对细胞培养以及后续实验的顺利进行提供科学依据。本发明具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点。
【专利说明】
-t种不同种属来源细胞的PCR检测引物和检测方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于细胞检测领域，特别是设及实验室常用的屯种不同种属来源细胞 (MD服、10邸、8服21、51\5?20、293、￥61?0)的？0?检测引物和检测方法，适用于细胞来源的鉴 定及细胞间交叉污染的检测。
【背景技术】
[0002] 体外培养的动物细胞是目前医学与生命科学领域应用最为广泛、最重要的实验工 具之一，确定细胞来源的可靠性W及培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染，对 于实验成功至关重要。目前，实验室常用的检测方法主要有染色体分析、STR分析、同工酶图 谱分析法，运些方法成本较高、费时费力，并且可鉴定的种属范围较窄。针对运些情况，后续 又开发出了 PCR检测方法。与传统方法比较，PCR检测方法具有快速、简便、灵敏度高、检测范 围宽等特点，并且细胞使用量小，利于在实验室中广泛使用。
[0003] 在PCR检测方法中，常选用线粒体DNA(mtDNA)作为目的基因。线粒体DNA是动物体 内唯一存在的核内遗传信息载体，为共价闭合的双链环状分子，大多数脊椎动物的线粒体 DNA约为16化，包括由37个基因组成的编码区和一段长度可变的非编码序列（又称控制区或 D-1 OOP)，37个基因中包括2个rRNA基因（12SrRNA和16SrRNA)，22个tRNA基因和13个蛋白质 基因。线粒体基因分子量小、结构简单，并且种属间特异性高、进化速度快、严格遵守母性遗 传。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于对实验室常用的屯种不同种属来源细胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、 SP20、293、VER0)的切tb基因设计特异性引物并建立PCR检测方法，用W检测细胞来源是否 可靠，W及鉴别培养过程中细胞是否存在交叉污染。
[0005] 本发明所提供的用于对屯种不同种属来源细胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)进行PCR检测的引物，其序列如下(见表1):
[0006] 1)用于检测来源于牛的MDBK细胞(牛肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 1所示，其下游引物如序列表中序列2所示；
[0007] 2)用于检测来源于狗的MDCK细胞(狗肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 3所示，其下游引物如序列表中序列4所示；
[000引3)用于检测来源于仓鼠的B皿21细胞(仓鼠肾细胞）的引物，其上游引物如序列表 中序列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示；
[0009] 4)用于检测来源于猪的ST细胞(猪睾丸细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列 7所示，其下游引物如序列表中序列8所示；
[0010] 5)用于检测来源于鼠的SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)的引物，其上游引物如序列表 中序列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示；
[0011] 6)用于检测来源于人的293细胞(人肾上皮细胞）的引物，其上游引物如序列表中 序列11所示，其下游引物如序列表中序列12所示;和/或
[0012] 7)用于检测来源于非洲绿猴的VERO细胞(猴肾细胞)的引物，其上游引物如序列表 中序列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。
[0013] 本发明所提供的用上述引物对屯种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VERO)进行PCR检测的方法，可包括W下步骤：
[0014] 1)提取待测细胞的基因组DNA;
[001引2似待测细胞的基因组DNA为模板，用上述7对引物分别进行PCR扩增，PCR反应体 系为（2扣L):2XDream Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司）12.扣L，DNA模板（lOng/ 化)化L，上游引物0.化L，下游引物0 .扣L，此0 9.5化;PCR反应程序为：先95 °C预变性5min; 然后95°C变形30s，退火(退火溫度见表l)30s，72°C延伸Imin，共35个循环;最后72°C完全延 伸lOmin;
[0016] 3)PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10化， 若出现93化p(序列表中序列15)的目的条带，则待测细胞中含有来源于牛的MD服细胞;若出 现439bp(序列表中序列16)的目的条带，则待测细胞中含有来源于狗的MDCK细胞;若出现 198bp(序列表中序列17)的目的条带，则待测细胞中含有来源于仓鼠的B皿21细胞;若出现 780bp(序列表中序列18)的目的条带，则待测细胞中含有来源于猪的ST细胞;若出现839bp (序列表中序列19)的目的条带，则待测细胞中含有来源于鼠的SP20细胞;若出现689bp(序 列表中序列20)的目的条带，则待测细胞中含有来源于人的293细胞;若出现39化p(序列表 中序列21)的目的条带，则待测细胞中含有来源于非洲绿猴的VER0细胞。
[0017]在上述检测方法中，所述步骤2)中用于检测牛源MDBK细胞的退火溫度为55。用 于检测狗源MDCK的退火溫度为60°C ;用于检测仓鼠源BHK21细胞的退火溫度为60°C ;用于检 测猪源ST细胞的退火溫度为65°C ;用于检测鼠源SP20细胞的退火溫度为55°C ;用于检测人 源293细胞的退火溫度为58°C ;用于检测非洲绿猴源VER0细胞的退火溫度为60°C。
[0018] 本发明还进一步提供鉴别细胞污染与否的方法，用前述方法对待测细胞分别进行 针对屯种不同种属来源细胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0 )DNA的PCR检测，依据所 出现的目的条带进行W下鉴别：
[0019] 仅出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，不出现用其它细胞检测引物 扩增的目的条带，判定待测物细胞无污染;和
[0020] 出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，同时出现用其它细胞检测引物 扩增的目的条带，判定待测物细胞被其它细胞污染，且出现目的条带的对应细胞为污染细 胞。或
[0021] 出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，同时微弱出现用其它细胞检测 引物扩增的目的条带，判定待测物细胞可能被其它细胞污染，且出现微弱目的条带的对应 细胞为可疑细胞。
[0022] 本发明还提供一种用于对屯种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、SP20、 293、VERO)进行PCR检测的试剂盒。
[0023] 本发明所提供的试剂盒包括上述用于对屯种不同种属来源细胞（MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)进行 PCR检测的引物。
[0024] 本发明所提供的试剂盒还包括用于25化PCR反应体系的试剂，包括：2 X化earn Taq? Green PCR Master ]?1又（化6^11〇公司）12.化L，上游引物0.扣L，下游引物0.化L，此0 9.如L。
[0025] 本发明针对实验室常用的屯种不同种属来源的细胞(MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)提供了 PCR检测引物和检测方法。本发明的检测引物包括7对引物，且各引物仅对 各自种属细胞的细胞色素 b(切tb)基因片段有特异性扩增，因此，用本发明的引物可W-次 性对巧巾种属来源的细胞进行检测，具有较高的特异性，不仅可W对实验室常用细胞的种属 来源（即细胞来源的可靠性)进行鉴定，还可W对培养过程中是否存在不同种属间细胞的交 叉污染进行判定，对细胞培养W及后续实验的顺利进行提供科学依据。本发明具有特异性 强、灵敏度高、快速、简便的优点，应用前景广阔。
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0027] 图1为巧中引物对PCR产物的电泳图；
[002引图2为牛源引物对(C-F和C-R)对牛源MD服细胞的特异性检测结果；
[0029] 图3为狗源引物对(D-F和D-R)对狗源MDCK细胞的特异性检测结果；
[0030] 图4为仓鼠源引物对(M-F和M-R)对仓鼠源B服21细的特异性检测结果；
[0031] 图5为猪源引物对(P-F和P-R)对猪源ST细胞的特异性检测结果；
[0032] 图6为鼠源引物对(R-F和R-R)对鼠源SP20细胞的特异性检测结果；
[0033] 图7为人源引物对化-F和H-R)对人源293细胞的特异性检测结果；
[0034] 图8为非洲绿猴源引物对(GM-F和GM-R)对非洲绿猴源VER0细胞的特异性检测结 果；
[0035] 图9为牛源引物对(C-F和C-R)对牛源MDBK细胞的灵敏性检测结果；
[0036] 图10为狗源引物对(D-F和D-R)对狗源MDCK细胞的灵敏性检测结果；
[0037] 图11为仓鼠源引物对(M-F和M-R)对仓鼠源B服21细胞的灵敏性检测结果；
[0038] 图12为猪源引物对(P-F和P-R)对猪源ST细胞的灵敏性检测结果；
[0039] 图13为鼠源引物对(R-F和R-R)对鼠源SP20细胞的灵敏性检测结果；
[0040] 图14为人源引物对化-F和H-R)对人源293细胞的灵敏性检测结果；
[0041 ] 图15为非洲绿猴源(GM-F和GM-R)对非洲绿猴源VER0细胞的灵敏性检测结果；
[0042 ]图16为仓鼠源B服21细胞样品的检测结果；
[0043] 图17为猪源ST细胞样品的检测结果；
[0044] 图18为牛源MD服细胞样品的检测结果。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russel1，David W.， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
[0046] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、质 量/体积(W/V，单位g/lOOmU百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/lOOmU百分比浓度。
[0047] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径W达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可W按照实施例中的提 示替换使用。
[0048] 所用引物由华大基因公司合成。
[0049] 实施例在W本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[(K)加]实施例1、设计用于对屯种不同种属来源的细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VER0)进行PCR检测的引物
[0051 ] PCR检测中常选用线粒体DNA(mtDNA)作为目的基因，发明人分析确认线粒体DNA中 的细胞色素 b(切tb)基因作为种属鉴定的目的基因较为适宜。运是因为切tb基因全长约为 1100-1200bp，在物种间序列长度没有明显差异，但在核巧酸组成上具有偏好，并且具有种 间的差异。Cytb基因的编码序列区进化缓慢、相对保守，在所有哺乳动物中都存在。
[0化2] 基于W上构思，发明人检索Genbank上屯种不同种属来源的细胞（MDBK、MDCK、 6服21、51\5?20、293、￥61?0)的细胞色素6化7计)基因的核巧酸序列，用生物信息学的方法对 细胞色素 b基因的核巧酸序列进行比对，选取各种细胞的细胞色素 b基因高度保守且具有特 异性的序列(保守区）为PCR检测的各祀目标(发明人分析细胞色素 b基因长度较小，可W将 其全长当做保守序列设计引物），用引物设计软件PrimerE邱ress6.0分别设计用于PCR检测 的特异性引物。
[0053] 屯种不同种属来源细胞(MD服、]\?)〇(、8服21、51'、5口20、293、￥61?0)细胞色素6基因保 守区核巧酸序列参见表1:
[0054] 表1引物设计参考序列
[0化5]
[0056]获得的各引物序列如表2所不：
[0057] 表2用于对屯种不同种属来源细胞(]\?)61(、]\?)〇(、8服21、51'、5?20、293、￥邸0)进行 PCR检测的引物
[0化引 [0化9]
[0060] 实施例2、建立屯种不同种属来源的细胞(MD服、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、VER0) 的PCR检测方法
[0061 ] 本发明用实施例1中的引物对屯种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、B服21、ST、 SP20、293、VER0)进行PCR检测，包括W下步骤：
[0062] 1)提取待测细胞的基因组DNA
[0063] 选取实验室培养的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7种细胞，提取基因组 DNA，具体步骤如下：
[0064] (1)取冻存的MD服、MDCK、BHK21、ST、SP20、293和VER0 7种细胞各两支，将冻存管置 于37 °C溫水中快速解冻，收集细胞于1.5mL离屯、管中，800化mp离屯、lOmin，弃上清，分别用 ImL PBS重悬细胞；
[00化](2)取重悬后的细胞20化L至新的1.5mL离屯、管中，加入ImL DNAzol裂解液振荡混 匀，静置10分钟裂解；
[0066] (3)12000rpm离屯、10分钟，取上清约800化至新的1.5mL离屯、管中，加入500化无水 乙醇，轻轻混匀静置5分钟，使DNA析出；
[0067] (4) 1200化pm离屯、10分钟，弃上清，加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀，轻轻混匀后 12000巧m离屯、5分钟；
[0068] (5)重复上一步骤；
[0069] (6)弃上清，待离屯、管中残留液体惊干后，加入20化无酶水溶解DNA沉淀，-20°C冻 存备用。
[0070] 2) W待测细胞的基因组DNA为模板，用化no化op对各细胞的基因组DNA测定浓度， 分别稀释至lOng/化，用上述7对引物分别进行PCR扩增，PCR反应体系为（2化L): 2 X化earn Taq? Green PCR Master Mix^hermo公司）12.5化，0臟模板（10雌/化）2化，上游引物0.5^ L，下游引物0.扣L，此0 9.5化;PCR反应程序为:先95°C预变性5min;然后95°C变形30s，退火 (退火溫度见表l)30s，72°C延伸Imin，共35个循环;最后72°C完全延伸lOmin。
[0071] 3)PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10化， 如图巧日表1所示，若出现93化p(序列表中序列15)的目的条带，则待测细胞中含有来源于牛 的MDBK细胞;若出现439bp(序列表中序列16)的目的条带，则待测细胞中含有来源于狗的 MDCK细胞;若出现198bp (序列表中序列17)的目的条带，则待测细胞中含有来源于仓鼠的 BHK21细胞;若出现780bp(序列表中序列18)的目的条带，则待测细胞中含有来源于猪的ST 细胞;若出现839bp(序列表中序列19)的目的条带，则待测细胞中含有来源于鼠的SP20细 胞;若出现689bp(序列表中序列20)的目的条带，则待测细胞中含有来源于人的293细胞;若 出现39化p(序列表中序列21)的目的条带，则待测细胞中含有来源于非洲绿猴的VER0细胞。
[0072] 实施例3、本发明引物及检测方法的特异性检测
[0073] W浓度为lOng/化的屯种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 V邸0)的基因组DNA为模板，分别用实施例1设计的屯对引物对屯种模板进行PCR扩增，检测 各对引物的特异性。PCR反应体系和PCR反应程序与实施例2相同，PCR反应完成后对PCR产物 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10化。
[0074] 结果如图2-图8所示：
[0075] 图2为牛源引物对(C-F和C-R)对巧巾细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结果 显示牛源特异性引物仅对牛源MDBK细胞的DNA模板扩增出932bp片段，对其它种属细胞的 DNA模板无扩增条带;说明牛源引物对(C-F和C-R)对牛源MD服细胞DNA有特异性。
[0076] 图3为狗源引物对(D-F和D-R)对巧巾细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结果 显示狗源特异性引物仅对狗源MDCK细胞DNA模板扩增出439bp片段，对其它种属细胞的DNA 模板无扩增条带;说明狗源引物对(D-F和D-R)对狗源MDCK细胞DNA有特异性。
[0077] 图4为仓鼠源引物对(M-F和M-R)对巧中细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结 果显示仓鼠源特异性引物仅对仓鼠源B皿21细胞DNA模板扩增出198bp片段，对其它种属细 胞的DNA模板无扩增条带;说明仓鼠源引物对(M-F和M-R)对仓鼠源BHK21细胞DNA有特异性。 [007引图5为猪源引物对(P-F和P-R)对巧中细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结果 显示猪源特异性引物仅对猪源ST细胞的DNA模板扩增出780bp片段，对其它种属细胞的DNA 模板无扩增条带;说明猪源引物对(P-F和P-R)对猪源ST细胞的DNA有特异性。
[0079] 图6为鼠源引物对(R-F和R-R)对巧中细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结果 显示鼠源特异性引物仅对鼠源SP20细胞的DNA模板扩增出839bp片段，虽然对其它种属细胞 的DNA模板有扩增条带，但位置与目的片段不符;说明鼠源引物对(R-F和R-R)对鼠源SP20细 胞的DNA有特异性。
[0080] 图7为人源引物对化-F和H-R)对巧巾细胞基因组DNA模板的特异性检测结果，结果 显示人源特异性引物仅对人源293细胞的DNA模板扩增出689bp片段，虽然对其它种属细胞 的DNA模板有扩增条带，但位置与目的片段不符;说明人源引物对化-F和H-R)对人源293细 胞的DNA有特异性。
[0081 ]图8为非洲绿猴源引物对(GM-F和GM-R)对巧巾细胞基因组DNA模板的特异性检测结 果，结果显示非洲绿猴源特异性引物仅对非洲绿猴源VER0细胞的DNA模板扩增出390bp片 段，虽然对其它种属细胞的DM模板有扩增条带，但位置与目的片段不符。说明洲绿猴源引 物对(GM-F和GM-R)对对非洲绿猴源VERO细胞的DNA有特异性。
[0082] 实施例4、本发明引物及检测方法的灵敏性检测
[0083] 将巧中不同种属来源细胞（MDBK、MDCK、B服21、51\5口20、293、￥61?0)的基因组0麻 (lOng/化)按照10倍梯度稀释后作为模板，浓度分别为10ngAiL、lngAiL、0.1ngAiL、0.01ng/ 化，分别用实施例1设计的7对引物对7种不同浓度的模板进行PCR扩增，检测各对引物的灵 敏性。PCR反应体系和PCR反应程序与实施例2相同，PCR反应完成后对PCR产物进行1.5 %琼 脂糖凝胶电泳检测，上样量均为lOyL。
[0084] 结果如图9-图15所示：
[0085] 图9为牛源引物对(C-F和C-R)对牛源MDBK细胞的灵敏性检测结果，结果显示模板 浓度为0.0 lng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0086] 图10为狗源引物对化-F和D-R)对狗源MDCK细胞的灵敏性检测结果，结果显示模板 浓度为0.0 lng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0087] 图11为仓鼠源引物对(M-F和M-R)对仓鼠源B皿21细胞的灵敏性检测结果，结果显 示模板浓度为0.0 lng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0088] 图12为猪源引物对(P-F和P-R)对猪源ST细胞的灵敏性检测结果，结果显示模板浓 度为0.0 lng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0089] 图13为鼠源引物对(R-F和R-R)对鼠源SP20细胞的灵敏性检测结果，结果显示模板 浓度为0.1 ng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0090] 图14为人源引物对化-F和H-R)对人源293细胞的灵敏性检测结果，结果显示模板 浓度为0.0 lng/iiL时仍能检测到明亮条带；
[0091] 图15为非洲绿猴源(GM-F和GM-R)对非洲绿猴源VER0细胞的灵敏性检测结果，结果 显示模板浓度为0.1 ng/iiL时仍能检测到明亮条带。
[0092] 实施例5、用本发明的引物及检测方法对仓鼠源BHK21细胞、猪源ST细胞、牛源MD服 细胞进行检测
[0093] 将仓鼠源B皿21细胞、猪源ST细胞、牛源MDBK细胞的基因组DNA(lOngAiL)作为模 板，分别用实施例1设计的7对引物对S种不同的模板进行PCR检测。PCR反应体系和PCR反应 程序与实施例2相同，PCR反应完成后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均 为10化。
[0094] 结果如图16-图18所示，仓鼠源B皿21细胞仅在用仓鼠源引物对(M-F和M-R)进行 PCR扩增时出现198bp的目的条带，用其它引物进行扩增时虽有扩增条带，但不属于目的条 带，说明细胞无污染；
[0095] 猪源ST细胞除在用猪源引物对(P-F和P-R)进行PCR扩增时出现780bp的目的条带 夕h在用非洲绿猴源引物对（GM-F和GM-R)和仓鼠源引物对(M-F和M-R)扩增时分别出现 390bp和198bp的条带，判定该猪源ST细胞可能有非洲绿猴源和仓鼠源细胞的污染；
[0096] 牛源MD服细胞除在用牛源引物对(C-F和C-R)进行PCR扩增时出现932bp的目的条 带外，在用仓鼠源引物对(M-F和M-R)进行PCR扩增时中也出现较浅的198bp的条带，可能有 仓鼠源细胞的污染，判定为可疑。
[0097] 实施例6、制备用于对屯种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、B皿21、ST、SP20、293、 VERO)进行PCR检测的试剂盒
[009引本发明的试剂盒包括实施例1中用于对屯种不同种属来源细胞（MDBK、MDCK、 B服21、ST、SP20、293、VERO)进行 PCR检测的引物；
[0099] 本发明的试剂盒还包括用于25化PCR反应体系的试剂，包括：2X化earn Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.^iL，上游引物O.^iL，下游引物O.^iL，出0 9.扣L。
[0100] 本发明试剂盒的使用方法参见实施例2。
【主权项】
1. 用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)进行PCR检测 的引物，其序列如下： 1) 用于检测来源于牛的MDBK细胞（牛肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列1所 示，其下游引物如序列表中序列2所示； 2) 用于检测来源于狗的MDCK细胞(狗肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列3所 示，其下游引物如序列表中序列4所示； 3) 用于检测来源于仓鼠的BHK21细胞(仓鼠肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示； 4) 用于检测来源于猪的ST细胞(猪睾丸细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列7所 示，其下游引物如序列表中序列8所示； 5) 用于检测来源于鼠的SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示； 6) 用于检测来源于人的293细胞（人肾上皮细胞）的引物，其上游引物如序列表中序列 11所示，其下游引物如序列表中序列12所示;和/或 7) 用于检测来源于非洲绿猴的VERO细胞(猴肾细胞）的引物，其上游引物如序列表中序 列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。2. 对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)进行PCR检测的方 法，包括以下步骤： 1) 提取待测细胞的基因组DNA; 2) 以待测细胞的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的七对引物分别进行PCR扩增， PCR反应体系为（25yL):2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.5yL，DNA 模板（1 〇ng/yL) 2yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，H20 9.5yL; PCR反应程序为:先95 °C预 变性5min;然后95°C变形30s，退火(退火温度见表l)30s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后 72°C完全延伸lOmin; 3 )PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10yL，若出 现932bp(序列表中序列15)的目的条带，则待测细胞中含有来源于牛的MDBK细胞;若出现 439bp(序列表中序列16)的目的条带，则待测细胞中含有来源于狗的MDCK细胞；若出现 198bp(序列表中序列17)的目的条带，则待测细胞中含有来源于仓鼠的BHK21细胞;若出现 780bp(序列表中序列18)的目的条带，则待测细胞中含有来源于猪的ST细胞;若出现839bp (序列表中序列19)的目的条带，则待测细胞中含有来源于鼠的SP20细胞;若出现689bp(序 列表中序列20)的目的条带，则待测细胞中含有来源于人的293细胞;若出现390bp(序列表 中序列21)的目的条带，则待测细胞中含有来源于非洲绿猴的VER0细胞。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述步骤2)中的退火温度为： 用于检测牛源MDBK细胞的退火温度为55°C ; 用于检测狗源MDCK的退火温度为60°C ; 用于检测仓鼠源BHK21细胞的退火温度为60°C ; 用于检测猪源ST细胞的退火温度为65°C ; 用于检测鼠源SP20细胞的退火温度为55°C ; 用于检测人源293细胞的退火温度为58°C ; 用于检测非洲绿猴源VERO细胞的退火温度为60°C。4. 鉴别细胞污染与否的方法，用权利要求2或3所述方法对待测细胞分别进行针对七种 不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)DNA的PCR检测，依据所出现的目 的条带进行以下鉴别： 仅出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，不出现用其它细胞检测引物扩增 的目的条带，判定待测物细胞无污染;和出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带， 同时出现用其它细胞检测引物扩增的目的条带，判定待测物细胞被其它细胞污染，且出现 目的条带的对应细胞为污染细胞。5. 根据权利要求4所述鉴别细胞污染与否的方法，还包括以下鉴别： 出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，同时微弱出现用其它细胞检测引物 扩增的目的条带，判定待测物细胞可能被其它细胞污染，且出现微弱目的条带的对应细胞 为可疑细胞。6. -种用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VER0)进行PCR 检测的试剂盒，包括权利要求1所述的用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、 ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的引物。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括用于25yL PCR反应体 系的试剂，包括：2XDream Taq? Green PCR Master Mix(Thermo公司）12.5yL，上游引物 〇.5yL，下游引物0.5yL，H20 9.5yL。8. 权利要求1所述的用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、 VERO)进行PCR检测的引物在对细胞来源的可靠性以及培养过程中是否存在不同种属间细 胞的交叉污染进行判定中的应用。9. 权利要求6或7所述的用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、 293、VER0)进行PCR检测的试剂盒在对细胞来源的可靠性以及培养过程中是否存在不同种 属间细胞的交叉污染进行判定中的应用。
【文档编号】C12Q1/04GK106048054SQ201610634844
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月3日 公开号201610634844.0, CN 106048054 A, CN 106048054A, CN 201610634844, CN-A-106048054, CN106048054 A, CN106048054A, CN201610634844, CN201610634844.0
【发明人】韩志玲, 郝鹏, 陈光达, 商晓桂, 闫聪, 陈君彦, 张贵刚, 范秀丽, 刘国英, 魏学峰
【申请人】金宇保灵生物药品有限公司