专利名称：：一种整合牛nramp1巨噬细胞特异性表达载体/牛成纤维细胞及其方法
技术领域：
：本发明属于转基因克隆动物
技术领域：
，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及到一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体的牛成纤维细胞。
背景技术：
：布氏杆菌病(Brucellosis)是由布氏杆菌(Brucellaabortus)引起人畜共患的一种慢性传染病，其临床特点主要表现为流产、长期发热、睾丸炎、腱鞘炎和关节炎等，病理特征为全身弥漫性网状内皮细胞增生和肉芽肿结节形成。本病所累及的组织器官很广泛，以单核-巨噬细胞系统、骨关节系统、神经系统等最为常见。布氏杆菌为细小的短杆状或球杆状，不产生芽胞，革兰氏阴性的杆菌。病原布氏杆菌共分为牛、羊、猪、沙林鼠、绵羊和犬布氏杆菌六种。病原菌主要通过体表皮肤粘膜的接触传播，亦可通过消化道传播，且可以通过含有布氏杆菌的气溶胶感染人或动物。布氏杆菌病严重地危害人类的身心健康并影响畜牧业的发展。人感染布病常常是缓慢发病，轻度感染者仅感到疲乏，头痛，关节肌肉酸痛，或无任何自觉症状，典型病例表现体温热型呈波浪状、寒颤、关节痛、神经痛、睾丸炎、滑囊炎、腱鞘炎，个别患者关节硬化。人患布氏杆菌病后严重影响人的生活和生育能力。布病引起雌性动物流产、不孕等症状，母畜流产后多伴发胎衣停滞和子宫内膜炎，影响妊娠并导致不育。布病可引起雄性动物则出现睾丸炎和附睾炎，导致配种能力降低，造成严重经济损失。在世界200多个国家和地区中，170多个国家和地区有布氏杆菌病存在和流行。约占世界1/5-1/6的人口受布病的威胁，全世界现约有500-600万人患布氏杆菌病，年新发病人约有50万(布合丽切木依干巴地，等.布鲁氏杆菌病的危害及其防治.草食家畜，2007，3:60-61)。在中国有25个省(市)、自治区有布氏杆菌病存在和流行，1200多个县市为布鲁氏杆菌病疫区，约有3.5亿人遭受布氏杆菌病威胁，(尚德秋.布鲁氏杆菌病研究进展·中国地方病防治杂志，2004，19):204-212)。布氏杆菌在体内广泛分布且是兼性细胞内寄生菌，普通药物不易生效。目前对于本病的治疗尚无理想的方法，一般采用检疫、淘汰病畜来防止动物的流行和扩散，仍是以预防为主。在疫苗接种过程中也存在一系列问题(赵富有；等.布氏杆菌病防控及疫苗使用的探讨.兽医导刊，2010,3:24-27)，如有些菌苗由于菌株毒力过大，接种反应强烈，有些菌苗效力还不十分理想，有些菌苗不能用于怀孕动物，还有的菌苗不能用于成年动物、种公畜和患病动物等，这些因素限制了菌苗的应用，造成接种密度不高而影响防治效果。随着转基因技术及体细胞克隆技术的日臻完善，通过转基因的方法培育抗病新品种动物已成为可能。1982年美国科学家I^lmiter等将大鼠生长激素(GH)基因导入小鼠受精卵中获得的转基因“超级鼠”被认为是世界上首批转基因动物(PalmiterRDB.R.，etal.Dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes[J].Nature，1982，300:611-615)。Brophy等Q003)报道通过转基因克隆技术提高牛自身β_酪蛋白基因、κ_酪蛋白基因的拷贝数，提高了牛奶中酪蛋白和κ-酪蛋白的含量，通过转基因的方法改变牛奶的组成禾口品质BrophyB.,G.Smolenski,T.Wheeler,etal.Clonedtransgeniccattleproducemilkwithhigherlevelsofbeta-caseinandkappa-casein[J].NatBiotechnol，2003，21(2):157-62)。日本研究人员Kuroira等Q004)首次实现了对免疫球蛋白(Ig)和朊蛋白(PRNP)基因进行依次打靶，获得Ig单基因位点和双基因位点失活的转基因牛(KuroiwaY.,etal.Clonedtranschromosomiccalvesproducinghumanimmunoglobulin[J].NatBiotechnol,2002,20(9):889-94)。Donovan等Q005)将编码溶葡球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛，证明了在转基因奶牛的乳腺中表达的溶葡球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎(DonovanD.M.，etal.Engineeringdiseaseresistantcattle[J],TransgenicRes，2005，14(5):563-7)。2006年世界首例抗疯牛病转基因克隆牛在中国山东淄博诞生(董雅娟等)。同年4月，中国工程院旭日干院士指导完成国内首例携带有人胰岛素基因的转基因克隆牛(李惠子等，2006)。2009年8月，西北农林科技大学张涌教授课题组主持培育的世界首例转人防御素基因克隆奶牛降生。转基因体细胞克隆牛的生产技术体系日趋成熟。人们在研究小鼠对结核分枝杆菌、沙门杆菌和利什曼原虫的易感性时发现小鼠的1号染色体上的显性基因，决定了小鼠对细胞内病原微生物侵染的抗性或易感性，并将该类基因命名为天然抗性相关巨噬蛋白l(NRAMPl)。Vidal通过基因敲除的方法敲除NRAMPl基因后，小鼠丧失了抵抗结核杆菌、沙门伤寒菌等胞内寄生菌的能力(VidalS.M.，etal.Naturalresistancetoinfectionwithintracellularparasites!isolationofacandidateforBcg[J]·Cell，1993，73(3):469-85)。1996年Feng克隆了牛的NRAMPl基因，并定位于牛的第二号染色体上，基因全长约111Λ，含有15个外显子，编码的蛋白含有12个跨膜区域(FengJ.,etal.Bovinenaturalresistanceassociatedmacrophageprotein1(NRAMPl)gene[J].GenomeRes,1996,6(10):956-64)。Barthel等通过克隆牛NRAMPl启动子和牛NRAMPl基因，构建NRAMPl特异性的表达载体并转染到小鼠7巨噬细胞中过度表达，能够抑制布氏杆菌的复制(BarthelR.，etal.StabletransfectionofthebovineNRAMPlgeneintomurineRAW264.7cells:effectonBrucellaabortussurvival[J],Infectlmmun,2001,69(5):3110-9)。这为牛抗布氏杆菌病育种提供了可能利用体细胞转基因和克隆结合的方式，增加牛NRAMPl基因的拷贝数提高NRAMPl在牛巨噬细胞中的表达，以达到抗布氏杆菌病的目的。
发明内容本发明的目的在于提供一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体/牛成纤维细胞及其方法，其包括含有NRAMPl基因的巨噬细胞特异性表达载体，以及基于该载体的整合有NRAMPl基因的巨噬细胞特异性表达载体的牛成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决秦川牛布氏杆菌病的转基因克隆牛提供坚实的基础。本发明的技术解决方案是一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特殊之处在于其包含巨噬细胞特异性启动子SP以及HA标签的目的基因NRAMPl。上述整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特殊之处在于还包括抗性筛选基因neo基因。上述整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特殊之处在于该载体通过用SacII和BamHI酶切将NRAMPl基因克隆到巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP载体上，然后用BamHI和NotI将EGFP切除掉而获得。一种含有上述载体的牛成纤维细胞，其特殊之处在于其宿主细胞是秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞，通过脂质体转染的方法将目的基因NRAMPl整合到牛成纤维细胞的基因组中。上述的宿主细胞是5-8代的秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞。上述牛成纤维细胞，其特殊之处在于该牛成纤维细胞作为核移植共体细胞构建转基因克隆胚。一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性载体的构建方法，其特殊之处在于，该方法包括1)牛NRAMPl基因克隆1.1)在牛NRAMPl基因的开放阅读框首尾两端设计分别含有SacII和BamHI酶切位点的引物，正向引物IF5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3，；反向引物IR5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3，；1.2)取成体秦川黄牛脾脏中约IOmg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA；1.3)以cDNA为模板，用引物对IF和1R，用TriplemsastersystemPCR扩增牛NRAMPl基因；反应条件是95°C，5min；95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36个循环；72°C延伸IOmin；4°C保存；1.4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与pGEM-Tfesy载体连接并转化到DH5ci，经蓝白斑筛选挑选重组子，对EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物学软件进行序列分析；2)牛NRAMPl巨噬细胞特异性载体构建2.1)巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP可以在巨噬细胞中表达，其中包含巨噬细胞特异性启动子SP;以pSP-EGFP载体为骨架，通过插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP构建NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl-HA；2.2)含NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl_HA的构建将pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分别用SacII和BamHI双酶切，回收NRAMPl基因片段和载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5α，用I^stI酶切筛选阳性克隆；得表达载体pSP-NRAMPl-EGFP；将pSP-NRAMPl-EGFP用BamHI和NotI双酶切并用Klenow补平，胶回收除去EGFP的载体并用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化入DH5α，用B10I和HpaI双酶切筛选阳性克隆，得pSP-NRAMPl-HA载体；2.3)pSP-NRAMPl-HA载体的验证小鼠巨噬细胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37°C的C02孵箱中常规培养。将巨噬细胞接种于M孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pSP-NRAMPl-HA，转染4后弃去培养液，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定IOmin；用10%山羊血清封闭15min，0.2%TritonX-IOO处理^iiin后用鼠源HA单抗4°C孵育过夜；用TRITC标记的抗鼠的二抗室温孵育lh，PBS洗5minX2次，用Hochest33342染核lmin，然后用荧光显微镜观察NRAMPl的表达。一种利用pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染犊牛耳朵成纤维细胞构建核移植供体细胞的方法，其特殊之处在于，该方法包括1)牛耳朵成纤维细胞的培养1.1)在37°C解冻一管第四代秦川牛犊牛耳朵成纤维细胞，离心；1.2)弃去培养液，加入Iml培养液重悬细胞，所述培养液为含10%FBS的高糖DMEM；转移至含有培养液60mm培养皿，在(X)2孵箱中37°C培养；1.3)待牛成纤维细胞密度达到70%-80%时，弃去培养液，加入^iilPBS洗涤细胞，所述PBS无Ca2+Mg2+,弃去PBS加入0.25%的胰酶消化细胞，待大多数细胞变圆、飘起时，用含有10%FBS的DMEM培养液终止消化，使用移液器吹打混勻转移到离心管中，1000转离心5分钟后，弃去培养液并悬浮，按照13的比例传代，置于CO2孵箱中37°C培养；1.4)取5-8代的牛成纤维细胞并G418药物筛选作为转染的宿主细胞；2)pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染牛成纤维细胞2.1)转染前1天，将牛成纤维细胞接种至60mm培养皿；培养液为含10%FBS、不含青霉素、链霉素的高糖DMEM；2.2)当细胞汇片达到全皿的10%-15%时，按照脂质体2000说明书陈述的方法将重组质粒pSP-NRAMPl-HA转染牛成纤维细胞，以pEGFP-Nl载体作为阳性对照；2.3)在转染前lh，将培养液换为无血清、无双抗的DMEM；将6μgDNA和15μL脂质体分别用500μL0pti-MEMEIReducedSerumMedium进行稀释，室温孵育5min，将二者混合，再在室温下孵育20min；2.4)最后将DNA/脂质体混合物逐滴加至培养孔内，在5%C02和饱和湿度下37°C培养；2.5)转染Mi后换为含10%FBS的高糖DMEM；转染24h后，更换含有终浓度为800μg/mLG418的细胞培养液进行筛选；同时，以未转染的牛成纤维细胞作为阴性对照；2.6)每隔3-4天换液，筛选2-3周，直至长出阳性细胞克隆，在皿底标记克隆位置；2.7)挑取克隆并逐个将阳性克隆传至M孔培养板，一个孔接一个克隆；培养液中G418含量减半；待细胞汇片达到7080%，胰酶消化后传至六孔培养板；以同样的方法，将六孔培养板中的细胞传至60mm培养皿扩增；最后将60mm培养皿中的细胞消化后冻存。3)pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染牛成纤维细胞的鉴定3.1)扩大培养pSP-NRAMPl-HA阳性牛成纤维细胞，提取基因组DNA，并以基因组为模板，PCR鉴定NRAMPl基因是否整合到牛成纤维细胞中；3.2)取未转染的正常牛成纤维细胞为阴性对照，取质粒pSP-NRAMPl-HA为阳性对照；设计引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR扩增引物对为2F和IR；3.3)PCR反应条件是95°C，5min；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36个循环；72°C延伸IOmin；4°C保存；3.4)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。上述以G418药物筛选是1)以G418药物筛选成纤维细胞，pSP-NRAMPl-HA载体上含有neo基因，整合有该载体并表达neo基因的成纤维细胞能够在一定浓度的G418筛选时存活，未整合该载体的成纤维细胞在该浓度下死亡；需要筛选正常成纤维细胞的G418最小致死浓度；2)牛成纤维细胞G418最小致死浓度的测定将牛成纤维细胞接种12孔板的12个孔，次日换液，每孔分别加入以终浓度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200μg/mLG418进行培养，其间每隔3天换液一次，培养至2周；当细胞培养液中的G418浓度等于或大于800μg/mL时，所有成纤维细胞都死亡，就G418对牛皮肤成纤维细胞的最小致死量是800μg/mL。一种以稳定转染pSP-NRAMPl-HA载体的成纤维细胞为供体细胞的转基因克隆胚的制备方法，其特殊之处在于，该方法包括1)卵母细胞的收集及成熟培养1.1)收集牛卵巢，挑选2_8mm卵泡，获取三层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘细胞卵母细胞复合体；1.2)实体显微镜下将挑选的COCs用成熟液洗涤，用改良TCM-199成熟培养液成熟培养；在38.5°C,5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养2122h；所述改良TCM-199成熟培养液组成TCM_199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF；1.3)卵母细胞成熟培养后，将培养的COCs移入0.2%透明质酸酶溶液中作用5min，用吸管反复吹打去除卵母细胞外周的颗粒细胞；1.4)选择具有第一极体而且胞质均一的卵母细胞用于核移植。2)核移植及重构胚培养2.1)采用体细胞核移植技术将供体细胞转移到去除细胞核并成熟培养后的卵母细胞中；其中，供体细胞的代数应控制在10代以内以防止体外培养过程产生突变；2.2)核移植过程将体外成熟培养212含有第一极体的MII期卵母细胞移入含有5mg/L细胞松弛素B的TCM-199+10%单位为ν/ν的FBS操作液微滴中，利用LEICA倒置显微操作仪，在Spindle-View视野下吸取第1极体及其下方少量细胞质；2.3)用0.25%的胰酶消化稳定转染NRAMPl基因的成纤维细胞，悬浮在DMEM培养液中作为供核细胞；2.4)用注核管吸取大小适中，表面光滑的转基因供体细胞，注入卵母细胞透明带下；2.5)将注核卵母细胞在电融合液中应用两个直流电极给予一次性1.9KV/cm，和20μs电脉冲，使体细胞与卵母细胞质融合；2.6)融合Ih后，检查融合情况，将重组体在TCM-199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+5μmol/L离子霉素中避光激活5min；随后在TCM-199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+2.5mmol/L6-DMAP的培养液中38.5°C、5%单位为ν/ν的C02、饱和湿度下培养46h；转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-I微滴中，4观察分裂率，7将质量较好的分裂激活胚胎转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-2微滴中，第79天观察囊胚发育情况，整合有pSP-NRAMPl-HA载体的转基因克隆胚构建成功。本发明具有以下特点1、本发明构建了一种NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，该载体含有巨噬细胞特异性启动子SP，能够实现目的基因NRAMPl在牛的巨噬细胞中特异性的高效表达。2、本发明将NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体转染到牛成纤维细胞中，构建转基因的牛成纤维细胞系；经过G418筛选获得阳性细胞，并通过PCR验证目的基因NRAMPl整合到牛成纤维细胞的基因组中。3、用整合目的基因NRAMPl的牛成纤维细胞作为供体细胞通过核移植构建转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛有望生产出转NRAMPl基因的牛，该转基因牛可预防牛布氏杆菌病的发生。图1是EcoRI单酶切鉴定pGEM-T-easy-NRAMPl载体的结果图；图2是NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl_HA的载体图谱；图3是XhoI和HpaI双酶切鉴定pSP-NRAMPl_HA载体的结果图；图4是pSP-NRAMPl-HA载体转染小鼠巨噬细胞7后免疫荧光图；图5是pSP-NRAMPl-HA载体转染牛成纤维细胞PCR鉴定的结果图；图6是包含pSP-NRAMPl-HA载体的转基因克隆胚的孵化囊胚图片。具体实施例方式本发明首先构建NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体ρSP-NRAMP1-HA，通过脂质体法将外源表达载体pSP-NRAMPl-HA转染入牛成纤维细胞。经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定证实目的基因NRAMPl整合到牛成纤维细胞的基因组中。将转染NRAMPl的成纤维细胞作为供体细胞移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。具体所涉及的试剂和材料如下G418,高糖DMEM，Trizol，细胞转染试剂Lipofectamine2000和Opti-MEfIReducedSerumMedium购自美国Invitrogen公司；EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；细胞培养板和培养皿购自Corning公司；TriplemasterSystem购自Eppendorf;DNAmaker购自天根公司；pGEM-TEasy载体和质粒提取试剂盒购自Promega公司；限制性核酸内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、Klenow、和反转录试剂盒由!^rmentas公司提供；基因组提取试剂盒购自Axygene；鼠源HA单克隆抗体购自碧云天公司；小鼠巨噬细胞RAW^H.7购自中南大学湘雅中心实验室；秦川犊牛耳部皮肤成纤维细胞由本实验室分离保存。下面结合附图和实验作进一步详细说明。1、巨噬细胞特异性载体pSP-NRAMPl-HA构建1.1牛NRAMPl基因克隆在牛NRAMPl基因(Genebank序列号匪174652.2)的开放阅读框首尾两端设计分别含有McII和BamHI酶切位点的引物，正向引物IF:5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3‘(SacII)；反向引物IR5，-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3，(BamHI)。粗体为酶切位点SacII和BamHI，下划线为Kozak序列，斜体为HA标签序列。引物有北京奥科公司合成。取成体秦川黄牛脾脏中约IOmg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA。以cDNA为模板，用引物对IF和1R，用TriplemsastersystemPCR扩增牛NRAMPl基因。反应条件是95°C，5min;95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36个循环；72°C延伸IOmin；4°C保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与PGEM-Tfesy载体连接并转化到DH5α，经蓝白斑筛选挑选重组子，对EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物学软件进行序列分析。酶切鉴定的结果如图1所示，泳道1是重组质粒pGEM-T-easy-NRAMPl经EcoRI酶切后产生1744bp特异性条带，电泳结果与预期结果一致。测序结果表明，扩增出来的秦川黄牛NRAMPl的序列与Genebank中NM_174652.2通过Blast比对分析，有两个碱基不同。第一个碱基是编码区内第145位A变为G，导致第49位苏氨酸(ACA)变为丙氨酸(GCA)。第二个碱基是157位A变为C，但氨基酸性质没变都是精氨酸(AGG->CGG)。NRAMPl基因虽然较为保守，但在不同品种间存在多态性，造成这种突变可能是种属间差异产生的一种多态现象。1.2牛NRAMPl巨噬细胞特异性载体结构及其构建含有NRAMPl基因和巨噬细胞特异性启动子(SP)以及抗性筛选基因(neo)的表达载体结构如图2所示。SP是巨噬细胞特异性启动子，这样SP启动子驱动的NRAMPl只在巨噬细胞中特异性表达。筛选基因(neo)用来筛选含有该载体的重组细胞，进而为核移植提供供体细胞。1.2.1巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP可以在巨噬细胞中表达，其中包含巨噬细胞特异性启动子SP(文阳安，等。巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究。细胞与分子免疫学杂志，2008，M(5):441-443)0本发明以pSP-EGFP载体为骨架，通过插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP构建NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl-HA。1.2.2含NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl-HA的构建将pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分别用SacII和BamHI双酶切，回收NRAMPl基因片段和载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5α，用I^stI酶切筛选阳性克隆。进而构建表达载体pSP-NRAMPl-EGFP。将ρSP-NRAMPI-EGFP用BamHI和NotI双酶切并用Klenow补平，胶回收除去EGFP的载体并用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化入DH5α，用XhoI和HpaI双酶切筛选阳性克隆，进而构建pSP-NRAMPl_HA载体(如图3)。1.2.3pSP-NRAMPl-HA载体的验证小鼠巨噬细胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37°C的CO2孵箱中常规培养。将巨噬细胞接种于M孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pSP-NRAMPI-HA(具体方法按脂质体-2000说明书进行)，转染4后弃去培养液，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定lOmin。用10%山羊血清封闭15min，0.2%TritonX-100处理aiiin后用鼠源HA单抗4°C孵育过夜。用TRITC标记的抗鼠的二抗室温孵育lh。PBS洗5minX2次。用Hochest33342染核lmin，然后用荧光显微镜观察NRAMPl的表达。pSP-NRAMPl-HA载体转染巨噬细胞后，免疫荧光结果如图4所示，该载体能在巨噬细胞中特异性表达。2.pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染犊牛耳朵成纤维细胞构建核移植供体细胞2.1牛耳朵成纤维细胞的培养在37°C解冻一管第四代秦川牛犊牛耳朵成纤维细胞，离心。弃去培养液，加入Iml培养液(含10%FBS的高糖DMEM)重悬细胞，转移至含有培养液60m培养皿，在CO2孵箱中37°C培养。待牛成纤维细胞密度达到70%-80%时，弃去培养液，加入aiilPBS(无Ca2+Mg2+)洗涤细胞，弃去PBS，加入0.25%的胰酶消化细胞，待大多数细胞变圆、飘起时，用含有10%FBS的DMEM培养液终止消化，使用移液器吹打混勻转移到离心管中，1000转离心5分钟后，弃去培养液并悬浮，按照13的比例传代，置于CO2孵箱中37°C培养。取5-8代的牛成纤维细胞作为转染的宿主细胞。本发明以G418药物筛选成纤维细胞，由于pSP-NRAMPl-HA载体上含有neo基因，因此整合有该载体并表达neo基因的成纤维细胞能够在一定浓度的G418筛选时存活，而未整合该载体的成纤维细胞在该浓度下死亡。因此需要筛选正常成纤维细胞的G418最小致死浓度。牛成纤维细胞G418最小致死浓度的测定将牛皮肤成纤维细胞接种12孔板的12个孔，次日换液，每孔分别加入以终浓度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200yg/mLG418进行培养，其间每隔3天换液一次，培养至2周。当细胞培养液中的G418浓度等于或大于800μg/mL时，所有成纤维细胞都死亡，就G418对牛皮肤成纤维细胞的最小致死量是800μg/mL。2.2pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染牛成纤维细胞转染前1天，将牛成纤维细胞接种至60mm培养皿。培养液为含10%FBS、不含青霉素、链霉素的高糖DMEM。当细胞汇片达到全皿的10%-15%时，按照脂质体2000说明书陈述的方法将重组质粒pSP-NRAMPl-HA转染牛成纤维细胞，以pEGFP-Nl载体作为阳性对照。在转染前lh，将培养液换为无血清、无双抗的DMEM。将6μgDNA和15μL脂质体分别用500μLOpti-MEfIReducedSerumMedium进行稀释，室温孵育5min，将二者混合，再在室温下孵育20min。最后将DNA/脂质体混合物逐滴加至培养孔内，在5%C02和饱和湿度下37°C培养。转染Mi后换为含10%FBS的高糖DMEM。转染24h后，更换含有终浓度为800μg/mLG418的细胞培养液进行筛选；同时，以未转染的牛成纤维细胞作为阴性对照。每隔3-4天换液，筛选2-3周，直至长出阳性细胞克隆，用记号笔在皿底标记克隆位置。挑取克隆并逐个将阳性克隆传至M孔培养板，一个孔接一个克隆。此后培养液中G418含量减半(400g/ml)。待细胞汇片达到7080%，胰酶消化后传至六孔培养板。以同样的方法，将六孔培养板中的细胞传至60mm培养皿扩增。最后将60mm培养皿中的细胞消化后冻存。本发明筛选的阳性细胞都是稳定转染pSP-NRAMPl-HA载体的成纤维细胞。载体整合到细胞的基因组上，随着细胞DNA的复制而复制。在稳定转染的过程中，pSP-NRAMPl-HA载体携带的SP启动子，NRAMPl基因和neo基因等元件会整合到宿主细胞的基因组中，通过G418筛选2周后达到稳定转染的目的，表现为筛选的细胞呈G418抗性。以上通过稳定转染筛选整合有pSP-NRAMPl-HA载体细胞，得到含有NRAMPl基因的秦川牛的牛皮肤成纤维细胞。2.3PSP-NRAMP1-HA载体稳定转染牛成纤维细胞的鉴定扩大培养pSP-NRAMPl-HA阳性牛成纤维细胞，提取基因组DNA，并以基因组为模板，PCR鉴定NRAMPl基因是否整合到牛成纤维细胞中；取未转染的正常牛成纤维细胞为阴性对照，取质粒pSP-NRAMPl-HA为阳性对照。设计引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR扩增引物对为2F和IR0PCR反应条件是95°C，5min；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36个循环；72°C延伸IOmin;4°C保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图5所示，其中泳道1是阴性对照，泳道2-6为pSP-NRAMPl-HA转染的成纤维细胞，泳道7为阳性对照，泳道8为DNAmarker0结果表明，pSP-NRAMPl-HA载体整合到宿主细胞牛成纤维细胞的基因组中。3以稳定转染pSP-NRAMPl-HA载体的成纤维细胞为供体细胞的转基因克隆胚的制备3.1卵母细胞的收集及成熟培养从西安市屠宰场收集牛卵巢，挑选2_8mm卵泡，获取三层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘细胞卵母细胞复合体(Cumulus-OocyteComplexes，COCs)。实体显微镜下将挑选的COCs用成熟液洗涤，用改良TCM-199成熟培养液成熟培养。在38.5°C,5%C02和最大饱和湿度的培养箱中培养2122h。改良TCM-199成熟培养液组成TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF。卵母细胞成熟培养后，将培养的COCs移入0.2%透明质酸酶溶液中作用5min，用吸管反复吹打去除卵母细胞外周的颗粒细胞。选择具有第一极体而且胞质均一的卵母细胞用于核移植。3.2核移植及重构胚培养采用体细胞核移植技术将供体细胞转移到去除细胞核并成熟培养后的卵母细胞中。其中，供体细胞整合有目的基因是转基因克隆胚的关键，同时，供体细胞的代数应控制在10代以内以防止体外培养过程产生突变。核移植过程将体外成熟培养212含有第一极体的MII期卵母细胞移入含有5mg/L细胞松弛素B的TCM-199+10%(v/v)FBS操作液微滴中(上覆石蜡油)，利用LEICA倒置显微操作仪，在Spindle-View视野下吸取第1极体及其下方少量细胞质。用0.25%的胰酶消化稳定转染NRAMPl基因的成纤维细胞，悬浮在DMEM培养液中作为供核细胞。用注核管吸取大小适中，表面光滑的转基因供体细胞，注入卵母细胞透明带下。将注核卵母细胞在电融合液中应用两个直流电极给予一次性1.9KV/cm，和20μs电脉冲，使体细胞与卵母细胞质融合。融合Ih后，检查融合情况，将重组体在TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+5μπι01/1离子霉素中避光激活5min。随后在TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+2.5mmol/L6-DMAP的培养液中38.5°C>5%(v/v)C02、饱和湿度下培养46h。转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-I微滴中，4观察分裂率，7将质量较好的分裂激活胚胎转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-2微滴中，第79天观察囊胚发育情况。如图6所示，转基因克隆胚发育至孵化囊胚，图中6Α是用Hochest33342染核照片，图6B是明场照片。整合有pSP-NRAMPl-HA载体的转基因克隆胚构建成功，为预防牛布氏杆菌病打下了基础。权利要求1.一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于其包含巨噬细胞特异性启动子SP以及HA标签的目的基因NRAMPl。2.根据权利要求1所述整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于还包括抗性筛选基因neo基因。3.根据权利要求1或2所述整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于该载体通过用SacII和BamHI酶切将NRAMPl基因克隆到巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP载体上，然后用BamHI和NotI将EGFP切除掉而获得。4.一种含有权利要求1所述载体的牛成纤维细胞，其特征在于其宿主细胞是秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞，通过脂质体转染的方法将目的基因NRAMPl整合到牛成纤维细胞的基因组中。5.根据权利要求4所述牛成纤维细胞，其特征在于所述的宿主细胞是5-8代的秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞。6.根据权利要求4或5所述牛成纤维细胞，其特征在于该牛成纤维细胞作为核移植共体细胞构建转基因克隆胚。7.一种整合牛NRAMPl巨噬细胞特异性载体的构建方法，其特征在于，该方法包括1)牛NRAMPl基因克隆1.1)在牛NRAMPl基因的开放阅读框首尾两端设计分别含有SacII和BamHI酶切位点的引物，正向引物IF:5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3，；反向引物IR5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3’1.2)取成体秦川黄牛脾脏中约IOmg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA；1.3)以cDNA为模板，用引物对IF和1R，用TriplemsastersystemPCR扩增牛NRAMPl基因；反应条件是95°C，5min；95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36个循环；72°C延伸IOmin；4°C保存；1.4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与pGEM-TEasy载体连接并转化到DH5α，经蓝白斑筛选挑选重组子，对EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物学软件进行序列分析；2)牛NRAMPl巨噬细胞特异性载体构建2.1)巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP可以在巨噬细胞中表达，其中包含巨噬细胞特异性启动子SP;以pSP-EGFP载体为骨架，通过插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP构建NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl-HA；2.2)含NRAMPl巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMPl-HA的构建将pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分别用SacII和BamHI双酶切，回收NRAMPl基因片段和载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5ci，用I^stI酶切筛选阳性克隆；得表达载体pSP-NRAMPl-EGFP；将pSP-NRAMPl-EGFP用BamHI和NotI双酶切并用Klenow补平，胶回收除去EGFP的载体并用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化入DH5α，用B10I和HpaI双酶切筛选阳性克隆，得pSP-NRAMPl-HA载体；.2.3)pSP-NRAMPl-HA载体的验证小鼠巨噬细胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37°C的(X)2孵箱中常规培养。将巨噬细胞接种于M孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pSP-NRAMPl-HA，转染4后弃去培养液，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定IOmin；用10%山羊血清封闭15min，0.2%TritonX-IOO处理^iiin后用鼠源HA单抗4°C孵育过夜；用TRITC标记的抗鼠的二抗室温孵育lh，PBS洗5minX2次，用Hochest33342染核lmin，然后用荧光显微镜观察NRAMPl的表达。8.一种利用pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染犊牛耳朵成纤维细胞构建核移植供体细胞的方法，其特征在于，该方法包括.1)牛耳朵成纤维细胞的培养.1.1)在37°C解冻一管第四代秦川牛犊牛耳朵成纤维细胞，离心；.1.2)弃去培养液，加入Iml培养液重悬细胞，所述培养液为含10%FBS的高糖DMEM；转移至含有培养液60mm培养皿，在(X)2孵箱中37°C培养；.1.3)待牛成纤维细胞密度达到70%-80%时，弃去培养液，加入aiilPBS洗涤细胞，所述PBS无Ca2+Mg2+,弃去PBS加入0.25%的胰酶消化细胞，待大多数细胞变圆、飘起时，用含有10%FBS的DMEM培养液终止消化，使用移液器吹打混勻转移到离心管中，1000转离心5分钟后，弃去培养液并悬浮，按照13的比例传代，置于(X)2孵箱中37°C培养；.1.4)取5-8代的牛成纤维细胞并G418药物筛选作为转染的宿主细胞；.2)pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染牛成纤维细胞.2.1)转染前1天，将牛成纤维细胞接种至60mm培养皿；培养液为含10%FBS、不含青霉素、链霉素的高糖DMEM；.2.2)当细胞汇片达到全皿的10%-15%时，按照脂质体2000说明书陈述的方法将重组质粒pSP-NRAMPl-HA转染牛成纤维细胞，以pEGFP-Nl载体作为阳性对照；.2.3)在转染前lh，将培养液换为无血清、无双抗的DMEM；将6μgDNA和15μL脂质体分别用500μL0pti-MEMEIReducedSerumMedium进行稀释，室温孵育5min，将二者混合，再在室温下孵育20min；.2.4)最后将DNA/脂质体混合物逐滴加至培养孔内，在5%C02和饱和湿度下37°C培养；.2.5)转染他后换为含10%FBS的高糖DMEM；转染24h后，更换含有终浓度为800μg/mLG418的细胞培养液进行筛选；同时，以未转染的牛成纤维细胞作为阴性对照；.2.6)每隔3-4天换液，筛选2-3周，直至长出阳性细胞克隆，在皿底标记克隆位置；.2.7)挑取克隆并逐个将阳性克隆传至M孔培养板，一个孔接一个克隆；培养液中G418含量减半；待细胞汇片达到7080%，胰酶消化后传至六孔培养板；以同样的方法，将六孔培养板中的细胞传至60mm培养皿扩增；最后将60mm培养皿中的细胞消化后冻存。.3)pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染牛成纤维细胞的鉴定.3.1)扩大培养pSP-NRAMPl-HA阳性牛成纤维细胞，提取基因组DNA，并以基因组为模板，PCR鉴定NRAMPl基因是否整合到牛成纤维细胞中；.3.2)取未转染的正常牛成纤维细胞为阴性对照，取质粒pSP-NRAMPl-HA为阳性对照；设计引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR扩增引物对为2F和IR；.3.3)卩0反应条件是95°〇，511^11；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36个循环；72°C延伸IOmin；4°C保存；.3.4)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。9.根据权利要求8利用pSP-NRAMPl-HA载体稳定转染犊牛耳朵成纤维细胞构建核移植供体细胞的方法，其特征在于，所述以G418药物筛选是.1)以G418药物筛选成纤维细胞，pSP-NRAMPl-HA载体上含有neo基因，整合有该载体并表达neo基因的成纤维细胞能够在一定浓度的G418筛选时存活，未整合该载体的成纤维细胞在该浓度下死亡；需要筛选正常成纤维细胞的G418最小致死浓度；.2)牛成纤维细胞G418最小致死浓度的测定将牛成纤维细胞接种12孔板的12个孔，次日换液，每孔分别加入以终浓度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200μg/mLG418进行培养，其间每隔3天换液一次，培养至2周；当细胞培养液中的G418浓度等于或大于800μg/mL时，所有成纤维细胞都死亡，就G418对牛皮肤成纤维细胞的最小致死量是800μg/mL。10.一种以稳定转染pSP-NRAMPl-HA载体的成纤维细胞为供体细胞的转基因克隆胚的制备方法，其特征在于，该方法包括.1)卵母细胞的收集及成熟培养.1.1)收集牛卵巢，挑选2-8mm卵泡，获取三层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘细胞卵母细胞复合体；.1.2)实体显微镜下将挑选的COCs用成熟液洗涤，用改良TCM-199成熟培养液成熟培养；在38.5°C,5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养2122h；所述改良TCM-199成熟培养液组成TCM-199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF；.1.3)卵母细胞成熟培养后，将培养的COCs移入0.2%透明质酸酶溶液中作用5min，用吸管反复吹打去除卵母细胞外周的颗粒细胞；.1.4)选择具有第一极体而且胞质均一的卵母细胞用于核移植。.2)核移植及重构胚培养.2.1)采用体细胞核移植技术将供体细胞转移到去除细胞核并成熟培养后的卵母细胞中；其中，供体细胞的代数应控制在10代以内以防止体外培养过程产生突变；.2.2)核移植过程将体外成熟培养212含有第一极体的MII期卵母细胞移入含有5mg/L细胞松弛素B的TCM-199+10%单位为ν/ν的FBS操作液微滴中，利用LEICA倒置显微操作仪，在Spindle-View视野下吸取第1极体及其下方少量细胞质；.2.3)用0.25%的胰酶消化稳定转染NRAMPl基因的成纤维细胞，悬浮在DMEM培养液中作为供核细胞；.2.4)用注核管吸取大小适中，表面光滑的转基因供体细胞，注入卵母细胞透明带下；.2.5)将注核卵母细胞在电融合液中应用两个直流电极给予一次性1.9KV/cm，和20μs电脉冲，使体细胞与卵母细胞质融合；·2.6)融合Ih后，检查融合情况，将重组体在TCM-199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+5μmol/L离子霉素中避光激活5min；随后在TCM-199+10%单位为ν/ν的胎牛血清+2.5mmol/L6一DMAP的培养液中38.5°C、5%单位为ν/ν的C02、饱和湿度下培养46h；转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-I微滴中，4观察分裂率，7将质量较好的分裂激活胚胎转移到预先准备的有颗粒细胞饲养层的30μLG-2微滴中，第79天观察囊胚发育情况，整合有PSP-NRAMP1-HA载体的转基因克隆胚构建成功。全文摘要一种整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体/牛成纤维细胞及其方法，构建了一种包含NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMP1-HA，以及一种基于该载体的包含NRAMP1基因的秦川牛成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞的方法，为解决秦川牛布氏杆菌病的转基因牛提供坚实的基础。本发明通过脂质体转染法将外源性表达载体pSP-NRAMP1-HA导入牛成纤维细胞，经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定，证实目的基因NRAMP1整合到牛成纤维细胞的基因组中；最后将整合有NRAMP1基因的牛成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。文档编号C12N15/85GK102559749SQ20101060353公开日2012年7月11日申请日期2010年12月17日优先权日2010年12月17日发明者孟书燕,来威锋,王华岩,程祥,邓捷,马晓玲申请人:西北农林科技大学