一种玉米内州萎蔫病菌lamp快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法。
【背景技术】
[0002]玉米内州萎蔫病(Goss’sBacterial Wilt and Leaf Blight of Corn)是由执安棒形杆菌内布拉斯加亚种(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis, Cmn)引起的一种严重的细菌性病害，可导致玉米产量损失率高达50%。自从1969年首次发现于内布拉斯加州中部，该病通过种子传带进行远距离传播[3]，目前已扩散至美国多州和加拿大部分地区，在我国尚未发现。玉米在我国的播种面积和产量均居世界第二位，而且我国大部分玉米种植区适合Cmn的发生与传播，该病菌一旦传入，将严重威胁我国玉米粮食生产安全，因此预防和控制玉米内州萎蔫病，对确保玉米生产可持续发展具有极为重要的意义。
[0003]Cmn为革兰氏阳性，不产孢，不固酸，严格好氧性，隶属于厚壁菌门(Firmicutes)，厚壁菌纲(Firmibacteria)，棒型杆菌属(Clavibacter)。目前针对其检测方法主要有分离培养法、血清学检测和分子生物学检测等方法，分离培养法和血清学检测方法操作复杂、耗时较长且灵敏度较低不适合快速检测。分子生物学检测方法具备快速、准确和灵敏的特点，但是其检测过程需PCR仪等设备支持，无法实现现场操作。
[0004]玉米内州萎蔫病菌Cmn可危害马齿玉米、甜玉米、硬粒玉米、爆玉米、狗尾草和甘鹿。Cmn可随种子传播(Biddle et al.1990)，而且我国大部分玉米种植区适合病害发生。病菌一旦传入定殖，容易暴发造成病害流行，且病害防治难度大。我国玉米产量和种植面积均居世界第二，在国民经济中占有重要地位。2011年，仅饲用玉米我国每年进口量已达数百万吨。因此，病菌传入我国并扩散传播的潜在风险巨大。目前，国内尚未见进境玉米样品中Cmn检测的报道，准确快速实用的微量病菌检测方法具有十分重要的潜在应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为了解决现有无法实现现场操作、快速、准确、灵敏的检测玉米内州萎蔫病菌的缺陷而提供一种方便现场操作、快速、准确、灵敏的玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，包括如下步骤:
a)设计引物，引物序列为:
F3 正向外引物:5’ -CGCTCATGGGTGGAACAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
B3 反向外引物:5’ -GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’ (SEQ ID N0.2)；
FIP 正向内引物:5’ -CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
BIP 反向内引物:5’ -CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’ (SEQ IDN0.4)；
LF 正向环化引物:5’ -ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)；
LB 反向环化引物:5’ -GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’ (SEQ ID N0.6)；
b)菌体培养和DNA模版制备:菌体的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25°C恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25°C培养12h(0D600 = 0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20°C备用；
c)LAMP扩增:步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为61°〇、62°〇、63°〇、64°〇或65°〇;设置内引物、环化引物和外引物比例分别为2:2:I (1pmol:1pmol:5pmol)，4:4: I (20pmol:20pmol:5pmol)，6:4: I (30pmol:20pmol:5pmol)或 8:4:1 (40pmol:20pmol:5pmol);设置反应时间梯度为 15min、30min、45min 或 60min ；
d)分析:步骤c)得到的扩展产物以阴性对照进行目测或于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
[0007]作为优选，步骤c)内引物、环化引物和外引物的梯度比为6:4:1或8:4:1，扩增反应时间为15min或30min，LAMP扩增反应温度为62°C、63°C或64°C。
[0008]作为优选，步骤c)内引物、环化引物和外引物的梯度比为6:4:1，扩增反应时间为30min，LAMP扩增反应温度为64°C。
[0009]作为优选，所述菌体为玉米内州萎蔫病菌。
[0010]本发明的有益效果是:本发明利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis, Cmn)16S-23S 序列设计LAMP (loop-mediated isothermal amplificat1n)引物，建立了玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系，并对反应条件进行了优化。LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6:4:l(30pmol:20pmol:5pmol)的25 μ L体系下64°C反应30min为最佳反应条件，且LAMP引物仅能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带。以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模版检测LAMP体系的灵敏度，结果显示，LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了 50fg和3.8CFU/mL，比普通PCR灵敏度高100倍。结果表明，LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好，在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大。
【附图说明】
[0011]图1是本发明LAMP特异性实验电泳图。
[0012]图中，M:DL2000 ；1:空白对照；2_8代表菌株基因组分别为Cmn，Pss，Aaa，Aac，Xo，
Pa，Paso
[0013]图2是本发明Cmn菌体LAMP灵敏性实验电泳图。
[0014]图3是Cmn菌体普通PCR灵敏性实验电泳图。
[0015]图中，M:DL2000 ；1:空白对照；2代表Cmn菌体模版浓度为3.6X 106CFU/ml，3_8分另Ij代表Cmn菌体模版浓度稀释倍数为，10倍，12倍，10 3倍，10 4倍，10 5倍，10 6倍。
【具体实施方式】
[0016]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施例并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0017]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0018]本发明中使用的菌株玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis，Cmn)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.Stewartii, Pss)由浙江省检验检疫科学技术研宄院张明哲博士提供；燕麦食酸菌(Acidovorax avenaesubsp.Avenae，Aaa)、西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrull，Aac)、黄单胞菌(Xanthomonas oryzae，Xo)由浙江大学李斌博士提供；凤梨泛菌(Pantoeaananatis，Pa)、高粱假单胞菌(Pseudomonas andropogonis (Smith) stapp, Pas)由舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心实验室保存。
[0019]LAMP法脱氧核糖核酸扩增试剂盒(荣研)，细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)，DL 2000DNA Ladder Marker (TaKaRa)，琼脂糖 Agarose H (上海生工)，LB 琼脂(杭州微生物试剂有限公司)。
[0020]实施例1
一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，包括如下步骤:
a)设计引物，引物序列为:
F3 正向外引物:5’ -CGCTCATGGGTGGAACAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
B3 反向外引物:5’ -GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’ (SEQ ID N0.2)；
FIP 正向内引物:5’ -CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
BIP 反向内引物:5’ -CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’ (SEQ IDN0.4)；
LF 正向环化引物:5’ -ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)；
LB 反向环化引物:5’ -GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’ (SEQ ID N0.6)；
b)菌体培养和DNA模版制备:玉米内州萎蔫病菌的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25 °C恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25°C培养12h (0D600 = 0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20°C备用；
c)LAMP扩增:步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为640C ;设置内引物、环化引物和外引物比例分别为6:4:1 (30pmol:20pmol:5pmol);设置反应时间梯度为30min ；
d)分析:步骤c)得到的扩展产物于2.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。
[0021]实施例2
一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，包括如下步骤:
a)设计引物，引物序列为:
F3 正向外引物:5’ -CGCTCATGGGTGGAACAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
B3 反向外引物:5’ -GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’ (SEQ ID N0.2)；