FIP 正向内引物:5’ -CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’ (SEQ IDN0.3)； BIP 反向内引物:5’ -CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’ (SEQ IDN0.4)；
LF 正向环化引物:5’ -ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)；
LB 反向环化引物:5’ -GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’ (SEQ ID N0.6)；
b)菌体培养和DNA模版制备:玉米内州萎蔫病菌的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25 °C恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25°C培养12h (0D600 = 0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20°C备用；
c)LAMP扩增:步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为620C ;设置内引物、环化引物和外引物比例分别为8:4:1 (40pmol:20pmol:5pmol);设置反应时间梯度为15min ；
d)分析:步骤c)得到的扩展产物于2.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。
[0022]实施例3
一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，包括如下步骤:
a)设计引物，引物序列为:
F3 正向外引物:5’ -CGCTCATGGGTGGAACAT-3’ (SEQ ID N0.1)；
B3 反向外引物:5’ -GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’ (SEQ ID N0.2)；
FIP 正向内引物:5’ -CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
BIP 反向内引物:5’ -CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’ (SEQ IDN0.4)；
LF 正向环化引物:5’ -ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)；
LB 反向环化引物:5’ -GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’ (SEQ ID N0.6)；
b)菌体培养和DNA模版制备:玉米内州萎蔫病菌的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25 °C恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25°C培养12h (0D600 = 0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20°C备用；
c)LAMP扩增:步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为630C ;设置内引物、环化引物和外引物比例分别为2:2:1 (1pmol:1pmol:5pmol);设置反应时间梯度为45min ；
d)分析:步骤c)得到的扩展产物于2.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。
[0023]特异性验证:利用TIANGEN细菌基因组提取试剂盒提取玉米内州萎蔫病菌、参比菌株的DNA，紫外分光光度计Nanodrop 2000验证提取效果，取2ul为模版分别进行LAMP扩增反应和PCR扩增反应，验证LAMP优化体系的特异性。从电泳跑胶图可以看出，只有以玉米内州萎蔫病菌为模版进行LAMP扩增的样液凝胶成像跑出清晰的梯度性条带，其他以参比菌株DNA为模版的LAMP扩增均没有出现梯度性条带(图2)。结果表明，本发明建立的针对玉米内州萎蔫病菌的LAMP检测方法特异性强。
[0024]参比菌株为玉米细菌性枯萎病菌(Pantoeastewartii subsp.Stewartii，Pss)、燕麦食酸菌(Acidovorax avenae subsp.Avenae，Aaa)、西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae subsp.citrull，Aac)、黄单胞菌(Xanthomonas oryzae，Xo)、凤梨泛菌(Pantoeaananatis，Pa)、高粱假单胞菌(Pseudomonas andropogonis (Smith) stapp，Pas)。
[0025]灵敏度检测:取10ul玉米内州萎蔫病菌菌悬液原液，用双蒸水进行10倍梯度稀释，涂板测定玉米内州萎蔫病菌菌悬液浓度为3.6X 106CFU/ml，分别取I μ L稀释液为模版进行LAMP扩增和普通PCR扩增反应，验证LAMP优化体系针对菌体的灵敏性。由LAMP结果图2可以看出LAMP检测体系检测灵敏度能够达到3.6CFU/mL，而图3普通PCR的检测灵敏度为3.6X 102CFU/mL。对比LAMP体系和普通PCR体系凝胶成像结果表明，LAMP检测体系的灵敏度比普通PCR的灵敏度高100倍。
[0026]我国玉米的产量和种植面积均居世界第二位，玉米在我国粮食生产中占据重要的地位。从2010年起，我国出现玉米净进口态势，2012年到2014年，三年玉米进口总量超过1000万吨。玉米内州萎蔫病菌随进口玉米传入我国的风险很高。目前针对玉米内州萎蔫病菌的检疫方法主要有分离培养法、酶联免疫法、常规PCR、TagMan-PCR、巢氏PCR、REP-PCR基因指纹技术以及两种或两种以上方法的结合，各种方法都有其优缺点，分离培养法的不足之处在于操作复杂，耗时较长。酶联免疫法主要受限与其灵敏度不够高，且特异性与制备抗体直接相关。常规PCR以及由此发展而来的巢氏PCR、TagMan-PCR, REP-PCR基因指纹技术其检测灵敏度提高不少，但是其操作过程需要专门的仪器且耗时较长，无法实现基层检疫人员现场、快速检疫的要求。并且其特异性受制备的抗体影响。常规PCR以及荧光定量PCR检测提高了检测的灵敏度，但它们都需要专门的设备，对于一些实验条件有限的机构特别是基层检验检疫部门，不利于推广。本发明采用环介导等温扩增技术(LAMP)，可以有效克服以上方法的不足，其反应过程仅需要金属浴小型装备的支持，且结果不需要通过电泳仪等设备可以直接目视或者加入荧光染料紫外照射观察，这有效克服了实验场地的限制；结果表明，LAMP反应菌体检测灵敏度高达3.6CFU，现场检测可以直接淋取菌液进行实验，这就有效弥补其他分子生物学实验菌体灵敏度不高，需提取基因组DNA进行检测，减少了操作的复杂性；同时LAMP检测反应时间缩短到30分钟，这大大提高了检测的效率。当然，LAMP技术也有一些自身的问题。首先，引物设计复杂，LAMP反应包含3对引物(内引物、外引物、环化引物)且很多情况下环化引物设计不成功。其次，扩增产物不易验证，LAMP扩增出现一系列梯度性条带，除非在靶标设计一对特异性酶切位点，否则无法验证其扩增序列与靶标序列是否一致。
【主权项】
1.一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤: a)设计引物，引物序列为: F3 正向外引物:5’ -CGCTCATGGGTGGAACAT-3’ (SEQ ID N0.1)； B3 反向外引物:5’ -GTTCTCAATATACGGGCGGT-3’ (SEQ ID N0.2)； FIP 正向内引物:5’ -CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA-3’ (SEQ IDN0.3)； BIP 反向内引物:5’ -CGCTGTTGGGTCCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG-3’ (SEQ IDN0.4)； LF 正向环化引物:5’ -ACCCCACAAGGAGGCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)； LB 反向环化引物:5’ -GCACCTTCGGGTGTGTCTG-3’ (SEQ ID N0.6)； b)菌体培养和DNA模版制备:菌体的活化培养用LB固体培养基，涂板后放入25°C恒温培养箱中培养24h，后挑取单菌落入LB培养液25°C培养12h(0D600 = 0.8)，离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20°C备用； c)LAMP扩增:步骤b)得到的基因组进行LAMP扩增，LAMP体系设置反应温度梯度为61°〇、62°〇、63°〇、64°〇或65°〇;设置内引物、环化引物和外引物比例分别为2:2:I (1pmol:1pmol:5pmol)，4:4: I (20pmol:20pmol:5pmol)，6:4: I (30pmol:20pmol:5pmol)或 8:4:1 (40pmol:20pmol:5pmol);设置反应时间梯度为 15min、30min、45min 或 60min ； d)分析:步骤c)得到的扩展产物以阴性对照进行目测或于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析。2.根据权利要求1所述的一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤c)内引物、环化引物和外引物的梯度比为6:4:1或8:4:1，扩增反应时间为15min或30min，LAMP扩增反应温度为62°C、63°C或64°C。3.根据权利要求2所述的一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤c)内引物、环化引物和外引物的梯度比为6:4:1，扩增反应时间为30min，LAMP扩增反应温度为64°C。4.根据权利要求1所述的一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，其特征在于，所述菌体为玉米内州萎蔫病菌。
【专利摘要】本发明涉及一种玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法，利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌16S-23S序列设计LAMP引物，建立了玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系，并对反应条件进行了优化。以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模版检测LAMP体系的灵敏度，结果显示，LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.8CFU/mL，比普通PCR灵敏度高100倍。结果表明，LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好，在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104962610
【申请号】CN201510293468
【发明人】单长林, 李孝军, 李雪松, 叶露飞, 周圆, 杨赛军
【申请人】舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月1日