一种测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌毒力的方法
【专利摘要】本发明公开一种测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌毒力的方法，属于植物病害防控领域。通过本发明的方法，香蕉尾孢菌在特定液体培养基中菌丝体生长良好，采用菌丝体干重测定法可以达到有关室内毒力测定的目的要求，相比大田活体病斑扩展法，节省大量人力、物力成本，试验影响因素小，数据准确可信。真空抽滤法过滤菌液，有效将菌丝球内的水分过滤掉，保证菌丝干湿度有效统一。香蕉尾孢菌在液体培养基中形成菌丝球，若采用烘箱干燥法，菌丝球容易粘附在滤纸上，菌丝量不同烘干效果不一致，对称重误差影响较大。
【专利说明】一种测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌毒力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害防控领域中一种测定杀菌剂对病原菌毒力的方法，特别涉及 一种离体条件下测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病原菌毒力的方法。
【背景技术】
[0002] 香蕉叶斑病（Sigatoka disease of banana)是香蕉叶部病害的总称，是香蕉生产 中最为严重、具有毁灭性的病害之一。在华南香蕉产区，香蕉叶斑病普遍发生，危害严重，该 病主要危害功能叶片，引起叶片布满病斑，光合作用面积明显减少，发病严重的植株早衰干 枯，严重影响果实发育充实，病株减产可达30%?50%。香蕉叶斑病的常见种类有：尾孢菌 (Cercospora musae)叶斑病、小窦氏霉叶斑病、暗双孢霉叶斑病、弯孢霉叶斑病等，以尾孢 菌叶斑病发生最普遍、危害最严重、危害性最大。香蕉尾孢菌叶斑病主要危害香蕉叶片，从 植株下部叶片开始发病，逐步向上部叶片扩展，在叶片上产生大量病斑，使叶片在短期内早 衰干枯，病斑初为米粒状或线条状、淡黄色或褐色，后发展成椭圆形或长条形、黄褐色或黑 褐色，多个病斑汇合引起蕉叶大面积干枯加速蕉叶衰老死亡田间病株可达50%?100%， 叶发病率可高达70%?80%。在珠江三角洲蕉区5?6月始见发病，7?8月高温多雨季 节，病害传播迅速，9?10月病害进入高峰，严重危害香蕉叶片，损失严重时可减产50%以 上，目前仍是生产上需重点进行药剂防治的病害。
[0003] 针对一般病原菌，杀菌剂毒力测定方法通常采用离体条件下，在实验室条件下进 行的不依附于作物体的农药本身对靶标菌的抑菌作用的测定，如传统的毒力测定方法中的 菌丝生长速率测定法和孢子萌发法等。
[0004] 香蕉尾孢菌可在马铃薯琼脂（PDA)培养基上人工分离获得，但在PDA平板培养基 上生长速度特别缓慢，难以产生分生孢子，室温27°C、培养15d菌落直径也只有3?5mm， 因此，难以通过孢子萌发法和菌丝生长速率法来进行有关室内毒力测定试验，目前一般通 过大田活体病斑扩展法进行毒力测定，即在田间发病蕉园选择初始发病的中部蕉叶，用油 墨笔标记新形成的病斑（约5. OmmX2. Omm)，将各处理药剂均匀喷施在标记蕉叶的正反面。 喷药前和喷药后分别调查并记录病斑长度，计算病斑长度增加值和抑菌效果，对不同处理 的抑菌效果进行回归分析，并计算EC 5tl值和EC9tl值。该方法目前虽已作为一种香蕉尾孢菌 毒力测定的方法，但在测定过程中存在工作量大、测定周期长、环境条件影响因素较多等缺 点。
[0005] 国家农药检定部门及药剂生产厂家急切需要建立一种新的快速、准确和有效的测 定方法，以确定和比较杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌的抑菌效果和毒力，为进一步的田间药 效试验和混配药剂的研制提供理论依据。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种测定杀菌剂对香蕉 尾孢叶斑病菌毒力的方法。该方法可有效测定杀菌剂对香蕉尾孢菌的室内毒力，为进一步 的田间药效试验和混配药剂的研制提供了理论依据，将在香蕉叶斑病的防治中发挥重要作 用，具有重要的社会经济意义。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌毒力 的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)制备相同大小的香蕉尾孢菌（Cercospora musae)菌块；
[0009] (2)在液体培养基中接种步骤（1)制备的香蕉尾孢菌菌丝块，并加入不同浓度梯 度的待测杀菌剂，振荡培养，过滤，通过真空抽滤法测定各处理的菌丝干重，利用DPS数据 处理系统计算试验药剂对香蕉尾孢菌菌丝体生长抑制的EC 5tl和EC9tl，通过计算获得待测杀 菌剂的毒力。
[0010] 本发明根据病原菌生长特性，其毒力测定方法不使用常规的"菌丝生长速率法"、 "大田活体病斑扩展法"，而是采用"菌丝体干重测定法"，可以更好地达到有关室内毒力测 定的目的要求。
[0011] 步骤（1)中所述的香蕉尾孢菌菌块优选按下述方法制备：在PDA平板上培养14? 16d的尾孢菌菌落，用无菌的手术刀切成（3. 0?4. 0)mmX (3. 0?4. 0)mm的菌块；注：该病 原菌菌落硬度强，无法用打孔器打孔处理。
[0012] 所述的PDA平板是指马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板，配方是去皮马铃薯200g/L， 葡萄糖20g/L，琼脂15?20g/L ;
[0013] 步骤⑵中所述的液体培养基的组成优选为：硝酸钠 3. 75g/L+磷酸氢二钾 I. 25g/L+ 硫酸镁 0· 8g/L+ 氯化钾 0· 8g/L+ 硫酸亚铁 0· 02g/L+ 蔗糖 30. Og/L，pH 值 7. 0 ;经 试验配比，筛选出适合香蕉尾孢菌快速生长的液体培养基配方，可以在较短时间内形成大 量菌丝球，达到毒力测定试验的要求；
[0014] 步骤（2)中所述的菌丝块的块数优选为各2块；
[0015] 步骤（2)中所述的振荡培养的条件优选为在26?28°C条件下100?IlOrpm振荡 培养10?14天；
[0016] 步骤（2)中所述的过滤优选用真空抽滤法进行过滤；
[0017] 本发明的机理是：
[0018] 1、香蕉尾孢菌在PDA平板培养基上生长速度特别缓慢，难以产生分生孢子，难以 通过孢子萌发法和菌丝生长速率法来进行有关室内毒力测定试验，目前一般通过大田活体 病斑扩展法进行毒力测定，但在测定过程中存在工作量大、测定周期长、环境条件影响因素 较多等缺点。根据病原菌生长特性，其毒力测定方法采用"菌丝体干重测定法"，可以更好地 达到有关室内毒力测定的目的要求，相比大田活体病斑扩展法，节省大量人力、物力成本， 试验影响因素小，数据准确可信。
[0019] 2、通过对查氏培养基的优化配比，筛选出适合香蕉尾孢菌生长的最优培养基配 方，可以在较短时间内形成大量菌丝球，达到毒力测定试验的要求。
[0020] 3、采用真空抽滤法测定各处理的菌丝干重，其优点在于真空抽滤法过滤菌液，有 效将菌丝球内的水分过滤掉，保证菌丝干湿度有效统一。香蕉尾孢菌在液体培养基中形成 菌丝球，若采用烘箱干燥法，菌丝球容易粘附在滤纸上，菌丝量不同烘干效果不一致，对称 重误差影响较大。
[0021] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0022] (1)香蕉尾孢菌在特定液体培养基中菌丝体生长良好，采用菌丝体干重测定法可 以达到有关室内毒力测定的目的要求，相比大田活体病斑扩展法，节省大量人力、物力成 本，试验影响因素小，数据准确可信。
[0023] (2)真空抽滤法过滤菌液，有效将菌丝球内的水分过滤掉，保证菌丝干湿度有效统 一。香蕉尾孢菌在液体培养基中形成菌丝球，若采用烘箱干燥法，菌丝球容易粘附在滤纸 上，菌丝量不同烘干效果不一致，对称重误差影响较大。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
[0026] 实施例1测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌的毒力及两种杀菌剂的联合毒力测定 和配方筛选。
[0027] 一、试验材料
[0028] (1)供试菌株
[0029] 香蕉尾孢菌（Cercospora musae)，在文献"50 %醚菌酯干悬浮剂对香蕉尾孢菌叶 斑病的毒力测定与防治试验，广东农业科学，2007 (12) :64-66"中公开。
[0030] (2)试验药剂
[0031] 95%丙环唑原药，陕西上格之路生物科学有限公司生产；
[0032] 96%嘧菌酯原药，陕西上格之路生物科学有限公司生产。
[0033] 丙环唑和嘧菌酯分别按照15. 7 :3、13. 7 :5、11. 7 :7、9. 7 :9、7. 7 :11的配比制成混 配制剂。
[0034] (3)供试液体培养基
[0035] 硝酸钠3. 75g/L+磷酸氢二钾I. 25g/L+硫酸镁0· 8g/L+氯化钾0· 8g/L+硫酸亚铁 0· 02g/L+ 蔗糖 30. Og/L，pH 值 7. 0。
[0036] (4)供试试剂
[0037] 无菌水、丙酮、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖。
[0038] (5)仪器设备
[0039] 三角瓶、电子天平、移液器、超净工作台、高压灭菌锅、全温度摇瓶柜、真空泵等。
[0040] 二、试验方法
[0041] 共设7个药剂配比：95 %丙环唑原药、96 %嘧菌酯原药、15. 7 %丙环唑+3 %嘧菌 酯混剂、13. 7%丙环唑+5%嘧菌酯混剂、11. 7%丙环唑+7%嘧菌酯混剂、9. 7%丙环唑+9% 嘧菌酯混剂和7. 7%丙环唑+11%嘧菌酯混剂，各配比分别配制成0. 1、0. 25、0. 5、1、2. 5和 5 μ g/mL共6个不同浓度的含药培养基，并设空白对照。
[0042] 每浓度处理均设4次重复。
[0043] 将供试药剂按不同剂量加入定量的液体培养基中，配制成系列浓度的含药培养 基。7个试剂配方分别配制成6个不同浓度的含药培养基，每浓度处理均设4次重复。在无菌 状态下将2块大小3. OmmX 3. Omm尾孢菌菌丝块，接入含药的定量液体培养基中，在27. (TC、 120r/min条件下恒温振荡培养。
[0044] 香蕉尾孢菌振荡培养12天后，先将菌丝体用滤纸过滤，再用真空泵进行抽滤，然 后用电子天平称量菌丝体干重，与空白对照比较，利用DPS数据处理系统计算试验药剂对 香蕉尾孢菌菌丝体生长抑制的EC5tl和EC9tl，以及试验药剂的毒力回归方程。
[0045] 三、试验结果
[0046] 表1香蕉尾孢菌培养12天后各浓度处理的菌丝体干重及抑菌效果
[0047]
【权利要求】
1. 一种测定杀菌剂对香蕉尾孢叶斑病菌毒力的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 制备相同大小的香蕉尾孢菌（Cercospora musae)菌块； (2) 在液体培养基中接种步骤（1)制备的香蕉尾孢菌菌丝块，并加入不同浓度梯度的 待测杀菌剂，振荡培养，过滤，通过真空抽滤法测定各处理的菌丝干重，利用DPS数据处理 系统计算试验药剂对香蕉尾孢菌菌丝体生长抑制的EC 5(I和EC9(I，通过计算获得待测杀菌剂 的毒力。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的液体培养基的组成为： 硝酸钠3. 75g/L+磷酸氢二钾1. 25g/L+硫酸镁0· 8g/L+氯化钾0· 8g/L+硫酸亚铁0· 02g/L+ 蔗糖 30.0g/L，pH 值 7.0。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的香蕉尾孢菌菌块按下 述方法制备：在PDA平板上培养14?16d的尾孢菌菌落，用无菌的手术刀切成（3. 0?4. 0) mmX (3. 0 ?4. 0)mm 的菌块。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的PDA平板是指马铃薯葡萄糖琼脂 培养基平板，配方是去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15?20g/L。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的菌丝块的块数为各2 块。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的振荡培养的条件为在 26?28°C条件下100?llOrpm振荡培养10?14天。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的过滤用真空抽滤法进 行过滤。
【文档编号】G01N5/00GK104237047SQ201410428735
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】宋晓兵, 彭埃天, 凌金锋, 陈霞 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所