一种利用hrm法进行牛/羊肉鉴别的标记引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品技术领域，涉及利用HRM法进行牛肉、羊肉鉴别的标记引物以方 法。
【背景技术】
[0002] 食品中肉类掺杂掺假已经发展成我国食品质量安全控制面临的重要挑战之一。在 我国，由于羊肉、牛肉价格较高，而猪肉、鸡肉等相对廉价，这使得很多不法商家为谋取暴 利，使用相对廉价的肉类原料冒充牛/羊肉制品进行销售。目前，传统的以经验与感官为主 的鉴别方法已远远无法满足对食品中肉制品掺假现象进行监管与控制的需要，建立科学、 准确的羊肉、牛肉鉴别方法非常必要。
[0003] 肉品的物种鉴别方法主要有蛋白质水平的检测方法和核酸水平的检测方法，与蛋 白质水平的检测相比，核酸检测具有灵敏、特异、快速等优点，已逐渐成为肉品成分鉴别的 发展趋势。
[0004] 目前，在国内外相关的研宄中，对于肉品成分的鉴别，主要采用DNA探针杂交、 RFLP-PCR法（限制性片段长度多态性扩增）、RAPD-PCR法（随机扩增多态性PCR)等方法。 但DNA探针杂交法存在对交叉感染灵敏度差，灵敏度低的缺点，RFLP-PCR法操作复杂，且易 受到目标基因序列中酶切位点随机突变的影响，产生检测结果的不确定性，RAPD-PCR法灵 敏度低，实验重复性差，这成为了基于核酸水平进行肉品物种鉴别的一个障碍。因此，若能 找到一种简单、快捷、准确的检测方法，将有助于牛、羊肉鉴别技术的大规模推广应用。
【发明内容】
[0005] 为了克服目前牛/羊肉检测过程复杂、效率低下等问题，提供一种利用HRM法进行 牛/羊肉鉴别的标记引物和方法。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现
[0007] 1.本发明提供一种牛肉鉴别的标记，，标记为3个，分别为：
[0008] 牛肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0009] 牛肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0010] 牛肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 2.本发明还提供一种利用HRM法进行牛肉鉴别的标记引物，其中，根据牛肉基因 标记1，设计标记引物对1 ;其中，
[0012] 牛肉标记引物 IF :GITTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC，
[0013] 牛肉标记引物 1R :GGAGGCAGTCGTCAGGCTAITCAA ;
[0014] 根据牛肉基因标记2，设计标记引物对2 ;其中，
[0015] 牛肉标记引物 2F :GCAGTGAGATGACCCCGTGGA，
[0016] 牛肉标记引物 2R :GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC ;
[0017] 根据牛肉基因标记3，设计标记引物对3 ;其中，
[0018] 牛肉标记引物 3F :ACAGTGGGAACAITTCAAAGGAGGC，
[0019] 牛肉标记引物 3R :GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。
[0020] 3.本发明还提供一种羊肉鉴别标记，标记为3个，分别为：
[0021] 羊肉基因标记1，序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0022] 羊肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 5所示；
[0023] 羊肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0024] 4.本发明还提供一种利用HRM法进行羊肉鉴别的标记引物，根据羊肉基因标记1， 设计标记引物1 ;其中，
[0025] 羊肉标记引物 IF :GGTGCTGAATGAGAAATG，
[0026] 羊肉标记引物 1R :CTAAATGGGTCAGAAACC ;
[0027] 根据羊肉基因标记2,设计标记引物2;其中，
[0028]羊肉标记引物 2F :CGAITCAGATGCCAAGAG，
[0029]羊肉标记引物 2R :TGAGAAGGGATACAAGCA;
[0030] 根据羊肉基因标记3,设计标记引物3 ;其中，
[0031]羊肉标记引物 3F :CTTTGCCACAITCATTAC，
[0032]羊肉标记引物 3R :TCAGTGTACGCTCAACTC。
[0033] 5.本发明还提供一种利用HRM法进行牛肉鉴别的方法，该方法包括如下步骤，包 括如下步骤：
[0034] 1)选取特异存在于牛基因中的位点，并根据选取位点，设计相应引物；
[0035] 2)取牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种7个样品，每份样品 150mg-250mg，分别提取 DNA;
[0036] 3)利用HRM法对每个样品进行检测：样品DNA在实时荧光PCR仪中进行PCR扩增 过程，扩增结束后，在此仪器中测试每个样品的熔解温度，仪器通过收集到的荧光信号绘制 相应的熔解曲线；
[0037] 4)分析不同品种检测得到的溶解曲线图，可以发现牛肉标记引物1、2、3用于牛肉 检测时可以形成单一的明显熔解峰，而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，均无单一的熔 解峰，因此可以确定通过牛肉标记引物1、2、3可以特异性地检测出牛肉存在；
[0038] 5)后期，提取待检测肉样品的DNA，用HRM法对DNA样品进行检测后，与真牛肉的 检测结果进行比对，验证所分析的待检测肉样品是牛肉。
[0039]6.上述5提供的牛肉鉴别的方法，其中，所述牛基因中的位点为：
[0040] 牛肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0041] 牛肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0042] 牛肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 3所示；
[0043] 所述引物为：
[0044] 标记引物对1;其中，
[0045] 牛肉标记引物 IF :GITTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC，
[0046] 牛肉标记引物 1R :GGAGGCAGTCGTCAGGCTAITCAA ;
[0047] 标记引物对2;其中，
[0048]牛肉标记引物 2F :GCAGTGAGATGACCCCGTGGA，
[0049]牛肉标记引物 2R:GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC;
[0050] 标记引物对3;其中，
[0051]牛肉标记引物 3F:ACAGTGGGAACAITTCAAAGGAGGC，
[0052]牛肉标记引物 3R:GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。
[0053]7.本发明还提供一种利用HRM法进行羊肉鉴别的方法，该方法包括如下步骤：
[0054]1)选取特异存在于羊基因中的位点，并根据选取位点，设计相应引物；
[0055] 2)取羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种7个样品，每份样品 150mg-250mg，提取其DNA;
[0056]3)利用HRM法对每个样品进行检测：样品DNA在ABI QuantStudio? 6 Flex实时 荧光PCR仪中进行PCR扩增过程，扩增结束后，在此仪器中测试每个样品的熔解温度，仪器 通过收集到的荧光信号绘制相应的熔解曲线；
[0057] 4)分析不同肉的检测得到的溶解曲线图，可以发现羊肉标记引物1、2、3用于羊肉 检测时可以形成单一的明显熔解峰，而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，均无单一的熔 解峰，因此可以确定通过羊肉标记引物1、2、3可以特异性地检测出羊肉存在；
[0058] 5)后期，提取待检测肉样品的DNA，用HRM法对DNA样品进行检测后，与真羊肉的 检测结果进行比对，验证所分析的待检测肉样品是羊肉。
[0059] 8.上述7提供的羊肉鉴别的方法，其中，
[0060] 所述羊基因中的位点，
[0061] 羊肉基因标记1，序列如SEQIDN0. 4所示；
[0062] 羊肉基因标记2,序列如SEQIDNO. 5所示；
[0063] 羊肉基因标记3,序列如SEQIDNO. 6所示；
[0064] 所述引物为：
[0065] 标记引物1;其中，
[0066]羊肉标记引物IF:GGTGCTGAATGAGAAATG，
[0067]羊肉标记引物 1R:CTAAATGGGTCAGAAACC;
[0068] 标记引物2;其中，
[0069]羊肉标记引物 2F :CGAITCAGATGCCAAGAG，
[0070]羊肉标记引物 2R :TGAGAAGGGATACAAGCA;
[00川标记引物3;其中，
[0072]羊肉标记引物 3F :CTTTGCCACAITCATTAC，
[0073]羊肉标记引物 3R:TCAGTGTACGCTCAACTC
[0074] 9.上述5-8任一项提供的方法，其中，
[0075]反应体系：以 10yL计量，5yL的MeltDoctor? HRM Master Mix，10yM上下游引 物各 0? 3yL，3. 4yL的水，30ng/yL样品DNA1yL。
[0076] 反应条件：95°C热启动反应lOmin;95°C反应158,60°〇反应11^11，反应结束后收集 荧光信号，共进行40个循环；95°〇反应108,601：反应1111111，逐渐升温至951：，连续收集荧 光信号（0. 025°C/次），反应完成后降温至60°C。
[0077] 有益效果：
[0078] 本发明通过HRM法鉴别牛、羊肉，具有快速、简便的特点，整个过程仅需2个小时完 成，而RFLP-PCR法操作复杂，检测时间长，通常需要20个小时。HRM法灵敏度高、重复性好， 相较DNA探针杂交法对交叉感染灵敏度差，RAPD-PCR法灵敏度低、实验重复性差，具有检测 更为准确的优点。因此，本发明是一种简单、快捷、准确的检测方法，代替上述的检测方法， 将有助于牛、羊肉鉴别技术的大规模推广应用。
【附图说明】
[0079] 图1针对牛肉标记基因1利用HRM法检测牛肉的溶解曲线
[0080] 图2针对牛肉标记基因1利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线
[0081] (a)猪肉；(b)鸡肉；（c)鸭肉；（d)鹅肉
[0082] 图3针对牛肉标记基因2利用HRM法检测牛肉的溶解曲线
[0083] 图4针对牛肉标记基因2利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线
[0084] (a)猪肉；(b)鸡肉；（c)鸭肉；（d)鹅肉
[0085] 图5针对牛肉标记基因3利用HRM法检测牛肉的溶解曲线
[0086] 图6针对牛肉标记基因3利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线
[0087] (a)猪肉；(b)鸡肉；(c)鸭肉；（d)鹅肉
[0088] 图7针对羊肉标记基因1利用HRM法检测羊肉的溶解曲线
[0089] 图8针对羊肉标记基因1利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线 [0090] (a)猪肉；(b)鸡肉；（c)鸭肉；（d)鹅肉
[0091] 图9针对羊肉标记基因2利用HRM法检测羊肉的溶解曲线
[0092] 图10针对羊肉标记基因2利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线
[0093](a)猪肉；(b)鸡肉；（c)鸭肉；（d)鹅肉
[0094] 图11针对羊肉标记基因3利用HRM法检测羊肉的溶解曲线
[0095] 图12针对羊肉标记基因3利用HRM法检测猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉的溶解曲线
[0096] (a)猪肉；(b)鸡肉；（c)鸭肉；（d)鹅肉
【具体实施方式