】
[0097] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0098] 实施例1
[0099] 1)检测位点的选取及引物的设计
[0100] 选取在牛基因中特异存在的标记基因片段，设计HRM法检测的引物。
[0101] 标记基因片段，分别为：
[0102] 牛肉基因标记1，序列如SEQIDNO. 1所示；
[0103] 牛肉基因标记2,序列如SEQIDNO. 2所示；
[0104] 牛肉基因标记3,序列如SEQIDNO. 3所示。
[0105] 本发明中所用的引物信息见表1，由生工生物（上海）有限公司合成。
[0106] 表1牛肉HRM法检测的引物
[0107]
[0108] (2)DNA样品制备
[0109] 采集任一牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种7个样品。采用酚、氯仿法提 取肉样品的DNA，并经紫外分光光度计检测后，将每份样品中DNA的浓度稀释到30ng/ul左 右。
[0110](3)HRM法检测
[0111]HRM法反应体系见表2:
[0112] 表2HRM法反应体系
[0114] MeltDoctor?HRM Master Mix产自ABI公司，货号为4415440。
[0115]HRM法反应条件：
[0116]使用仪器为：ABI QuantStudio? 6 Flex实时荧光PCR仪。
[0117] 95°C热启动反应lOmin;95°C反应15s，60°C反应lmin，反应结束后收集荧光信 号，共进行40个循环；95°〇反应108,601：反应1111111，逐渐升温至951：，连续收集荧光信号 (0. 025°C/次），反应完成后降温至60°C。
[0118] (4)检测结果比对
[0119] 从图1、3、5中可以看出，牛肉的检测位点用于牛肉检测时可以形成单一的明显熔 解峰，说明引物在牛的DNA样品中可以进行特异性扩增，本实施例中所选用的3个牛肉位点 的熔解温度分别为：标记基因1 :76. 327°C，标记基因2 :84. 450°C，标记基因3 :85. 313°C。 而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，检测出的熔解峰均较杂，无单一的熔解峰（如图2、 4、6)，说明在这些品种肉的DNA样品中，该引物不能进行特异性扩增。在实际检测时，可以 明显看出牛肉的检测熔解峰与其他品种肉的区别，因此可以轻松分辨出检测样品是否为牛 肉。
[0120] 实施例2 :
[0121] (1)检测位点的选取及引物的设计
[0122] 选取在羊基因中特异存在的标记基因片段，设计HRM法检测的引物。本发明中所 用的引物信息见表3,由生工生物（上海）有限公司合成。
[0123] 标记基因片段，分别为
[0124] 羊肉基因标记1，序列如SEQIDN0. 4所示；
[0125] 羊肉基因标记2,序列如SEQIDNO. 5所示；
[0126] 羊肉基因标记3,序列如SEQIDNO. 6所示
[0127] 表3羊肉HRM法检测的引物
[0129] (2)DNA样品制备
[0130] 采集任一羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种各7个样品。采用酚、氯仿法 提取肉样品的DNA，并经紫外分光光度计检测后，将每份样品中DNA的浓度稀释到30ng/ul 左右。
[0131] (3)HRM法检测
[0132]HRM法反应体系及反应条件同实施例1(3)中所述。
[0133] (4)检测结果比对
[0134] 从图7、9、11中可以看出，羊肉的检测位点用于羊肉检测时可以形成单一的明 显熔解峰，说明引物在羊的DNA样品中可以进行特异性扩增，本实施例中所选用的3个 羊肉位点的熔解温度分别为：标记基因1 :79.871°C，标记基因2 :84.047°C，标记基因3 : 78. 812°C。而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，检测出的熔解峰均较杂，无单一的熔解 峰（如图8、10、12)，说明在这些品种肉的0嫩样品中，该引物不能进行特异性扩增。在实际 检测时，可以明显看出羊肉的检测熔解峰与其他品种肉的区别，因此可以轻松分辨出检测 样品是否为羊肉。
[0135] 可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发 明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这 些改进和变更也属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种牛肉鉴别标记，其特征在于：标记为3个，分别为： 牛肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 1所示； 牛肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 2所示； 牛肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 3所示。2. -种利用HRM法进行牛肉鉴别的标记引物，其特征在于：根据牛肉基因标记1，设计 标记引物对1 ;其中， 牛肉标记引物 IF :GITTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC， 牛肉标记引物 IR :GGAGGCAGTCGTCAGGCTAITCAA ; 根据牛肉基因标记2,设计标记引物对2 ;其中， 牛肉标记引物 2F :GCAGTGAGATGACCCCGTGGA， 牛肉标记引物 2R :GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC ; 根据牛肉基因标记3,设计标记引物对3 ;其中， 牛肉标记引物 3F :ACAGTGGGAACAITTCAAAGGAGGC， 牛肉标记引物 3R :GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。3. -种羊肉鉴别标记，其特征在于：标记为3个，分别为： 羊肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 4所示； 羊肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 5所示； 羊肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 6所示。4. 一种利用HRM法进行羊肉鉴别的标记引物，其特征在于：根据羊肉基因标记1，设计 标记引物1 ;其中， 羊肉标记引物 IF :GGTGCTGAATGAGAAATG， 羊肉标记引物 IR :CTAAATGGGTCAGAAACC ; 根据羊肉基因标记2,设计标记引物2 ;其中， 羊肉标记引物 2F :CGAITCAGATGCCAAGAG， 羊肉标记引物 2R :TGAGAAGGGATACAAGCA ; 根据羊肉基因标记3,设计标记引物3 ;其中， 羊肉标记引物 3F :CITTGCCACAITCATTAC， 羊肉标记引物 3R :TCAGTGTACGCTCAACTC。5. -种利用HRM法进行牛肉鉴别的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，包括如下 步骤： 1) 选取特异存在于牛基因中的位点，并根据选取位点，设计相应引物； 2) 取牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种7个样品，每份样品150mg-250mg，分 别提取DNA ; 3) 利用HRM法对每个样品进行检测：样品DNA在实时荧光PCR仪中进行PCR扩增过 程，扩增结束后，在此仪器中测试每个样品的熔解温度，仪器通过收集到的荧光信号绘制相 应的熔解曲线； 4) 分析不同品种检测得到的溶解曲线图，可以发现牛肉标记引物1、2、3用于牛肉检 测时可以形成单一的明显熔解峰，而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，均无单一的熔解 峰，因此可以确定通过牛肉标记引物1、2、3可以特异性地检测出牛肉存在； 5)后期，提取待检测肉样品的DNA，用HRM法对DNA样品进行检测后，与真牛肉的检测 结果进行比对，验证所分析的待检测肉样品是牛肉。6. 权利要求5所述的牛肉鉴别的方法，其特征在于，所述牛基因中的位点为： 牛肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 1所示； 牛肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 2所示； 牛肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 3所示； 所述引物为： 标记引物对1;其中， 牛肉标记引物 IF :GITTGACCTGCTCCTAACTCCATCCC， 牛肉标记引物 IR :GGAGGCAGTCGTCAGGCTAITCAA ; 标记引物对2;其中， 牛肉标记引物 2F :GCAGTGAGATGACCCCGTGGA， 牛肉标记引物 2R :GCCATAAGGGAGGAACACTCTGAC ; 标记引物对3;其中， 牛肉标记引物 3F :ACAGTGGGAACAITTCAAAGGAGGC， 牛肉标记引物 3R :GGTGTCAGAGGACCTGTCAGTGGAGT。7. -种利用HRM法进行羊肉鉴别的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1) 选取特异存在于羊基因中的位点，并根据选取位点，设计相应引物； 2) 取羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉品种，每个品种7个样品，每份样品150mg-250mg，提 取其DNA ; 3) 利用HRM法对每个样品进行检测：样品DNA在ABI QuantStudio? 6 Flex实时荧光 PCR仪中进行PCR扩增过程，扩增结束后，在此仪器中测试每个样品的熔解温度，仪器通过 收集到的荧光信号绘制相应的熔解曲线； 4) 分析不同肉的检测得到的溶解曲线图，可以发现羊肉标记引物1、2、3用于羊肉检 测时可以形成单一的明显熔解峰，而在用于猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉检测时，均无单一的熔解 峰，因此可以确定通过羊肉标记引物1、2、3可以特异性地检测出羊肉存在； 5) 后期，提取待检测肉样品的DNA，用HRM法对DNA样品进行检测后，与真羊肉的检测 结果进行比对，验证所分析的待检测肉样品是羊肉。8. 权利要求7所述的羊肉鉴别的方法，其特征在于： 所述羊基因中的位点， 羊肉基因标记1，序列如SEQ ID NO. 4所示； 羊肉基因标记2,序列如SEQ ID NO. 5所示； 羊肉基因标记3,序列如SEQ ID NO. 6所示； 所述引物为： 标记引物1 ;其中， 羊肉标记引物 IF :GGTGCTGAATGAGAAATG， 羊肉标记引物 IR :CTAAATGGGTCAGAAACC ; 标记引物2;其中， 羊肉标记引物 2F :CGAITCAGATGCCAAGAG， 羊肉标记引物 2R :TGAGAAGGGATACAAGCA ; 标记引物3;其中， 羊肉标记引物 3F :CITTGCCACAITCATTAC， 羊肉标记引物 3R :TCAGTGTACGCTCAACTC。9.权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于： 反应体系：以IOyL计量，5yL的MeltDoctor?HRM Master Mix，10yM上下游引物各 0? 3 y L，3. 4 y L 的水，30ng/ y L 样品 DNAl y L。 反应条件：95°C热启动反应10min ;95°C反应15s，60°C反应lmin，反应结束后收集荧光 信号，共进行40个循环；95°C反应10s，60°C反应lmin，逐渐升温至95°C，连续收集荧光信 号（0. 025°C /次），反应完成后降温至60°C。
【专利摘要】本发明属于食品技术领域，提供一种利用HRM法进行牛肉、羊肉鉴别的标记引物以方法。牛肉鉴别的标记，分别为：牛肉基因标记1，序列如SEQ ID NO.1所示；牛肉基因标记2，序列如SEQ ID NO.2所示；牛肉基因标记3，序列如SEQ ID NO.3所示。羊肉鉴别标记，分别为：羊肉基因标记1，序列如SEQ ID NO.4所示；羊肉基因标记2，序列如SEQ ID NO.5所示；羊肉基因标记3，序列如SEQ ID NO.6所示。本发明通过HRM法鉴别牛、羊肉，具有快速、简便的特点，整个过程仅需2个小时完成。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104962618
【申请号】CN201510309901
【发明人】李春保, 吴洽宇, 周光宏
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月8日