专利名称：荧光偏振筛选法的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选基因表达系统，如基因文库或体外表达系统中编码生物化合物的核苷酸序列的方法。该方法利用荧光偏振(FP)特征，通过与荧光物质反应来检测表达系统中产生的生物化合物。荧光检测法十分灵敏，因此适于检测极少量的生物化合物。然而，使用荧光偏振测定法特别有用是因为该技术能够进行灵敏的检测并能强有力地防止信号散射或淬灭。使用荧光偏振还能进行均匀的筛选试验，即不必将生物化合物和荧光物质的反应产物与未反应的荧光物质分开。
背景技术：
荧光偏振(称为FP)现象是1926年发现地，当时F.Perrin观察到如果用偏振光激发荧光分子，则若分子在激发和发射之间保持不变的话，随后发射的光在固定的平面上也是偏振的(F.Perrin“Polarisation de la lumiere de fluorescence.Vie moyene desmolecules dans L’etatexite”，Le Journal de Physique et leRadium,Tome Ⅶ,Serie Ⅵ,1926,pgs.390-401)。
直至70年代后期，荧光分子的这一特性仍未引起人们足够的重视，这可能是因为缺乏技术上足够精细的能测定发射的偏振光和其中的偏振变化的装置而使其应用有限的缘故。
1979年，H.Maeda阐明了使用FP技术监测大的荧光标记蛋白质的蛋白酶降解过程的试验(Maeda H.，分析生物化学，92,222-227(1979))，随后又有人提供了类似的DNA和RNA降解试验(Bolger R.＆Checovich W.，生物技术，17,585-589,1994；Yonemura K.＆Maeda H.，生物化学杂志，92,1297-1303,1982)。
FP在临床免疫化学领域得到最广泛的使用，在该领域中，已根据生物化合物与荧光标记抗体的结合反应导致的偏振变化开发出多种用于检测特异性生物化合物的不同试验(Checovich W.,Bolger R.＆Burke T.，荧光偏振-细胞和分子生物学的新工具，自然，375,254-256,1995)。该文献还描述了FP技术的特征性要素。
EP 194472 B1描述了通过测定因水解酶降解底物导致的荧光偏振的变化而测定水解酶活性的方法。
Schade,S.Z等描述了在螺旋体细菌上检测表面相关蛋白酶的活性，籍此反映细菌的病理学潜力的试验(Schade,S.Z.,Jolley M.,Sarauer B.J.,Simonson L.G.，通过荧光偏振检测螺旋体蛋白酶，口腔研究杂志，73,p248-248,1994)。
WO93/11249描述了将感兴趣的编码酶的核苷酸序列转化至宿主细胞并通过检测底物琼脂或凝胶中的清亮区域鉴定该序列的方法。
WO98/58085(公开于本申请优先权日之后的98年12月23日)描述了通过产生表达文库，(通过例如染色)将荧光底物插入细胞来筛选原核表达文库中的生物活性(即酶)的方法。细胞产生的酶可与底物反应并产生荧光信号，其在单细胞的基础上可用于在FACS(荧光激活细胞分选)仪上分离阳性细胞。为了使该技术能够运行，需要将底物限制在细胞实体内，反过来说，意味着底物必须具有能插入细胞的特性。因此，该文献仅公开了一种类型底物(C12-FDG)的实施例，该底物可成功插入活细胞。该文献中提及的其它潜在底物是经设计后通过与酶反应可导致强度变化的合成底物，即测定强度变化是该公开内容的基本原理。
通过从核苷酸来源中提取DNA并制备和纯化该DNA的特定片断或其拷贝来制备基因文库是本领域众所周知的，将这些片断或核苷酸序列插入宿主细胞(例如通过连接至质粒中，随后转化至宿主细胞)并表达所述片断的技术也是众所周知的。在体外系统中表达核苷酸序列也是本领域已知的技术。发明简述
筛选编码所需生物化合物的核苷酸序列经常需要将生物化合物与通过与生物化合物反应而发生可测变化的物质接触。通常有很多这种物质可供本领域技术人员选择，但必须选择与在想达到的真正的工业应用中可与生物化合物反应的物质相类似的物质。当生物化合物为酶时，选择在筛选过程中与感兴趣的酶具有高特异性的真正的底物，一个优点是在筛选过程中发现的新酶很可能在想达到的工业应用中也能较好地发挥作用。然而，选择低分子量，低特异性的合成底物可使筛选过程中产生大量假阳性命中，即酶与合成底物能较好地反应，但与想达到的工业应用中真正的底物的反应情况却较差。现有技术未曾教导在高物料流通量的核苷酸序列筛选方法中如何获得上述优点。
然而，我们发现了荧光偏振技术新的多方面的用途，它可提供快速，灵敏和准确的工具，从核苷酸来源中筛选编码适于工业生产和应用的生物化合物(如酶或药物)的核苷酸序列。测定荧光分子的荧光偏振而不是荧光分子发射强度的变化为选择模式荧光分子提供了高水平的自由度。相对于现有技术所述的方法，如肉眼检测涂布于琼脂平板上的微生物菌落周围清亮的区域而言，使用荧光偏振还可发现多得多的编码相关生物化合物的核苷酸序列。
本发明的第一方面提供了筛选编码生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括a)在表达系统中表达核苷酸序列以产生生物化合物，b)使生物化合物与能与生物化合物反应的荧光物质接触以发生反应，c)测定荧光物质的荧光偏振，和d)选择荧光偏振发生变化的表达系统。
本发明反过来还提供了生产生物化合物的方法，所述方法包括a)鉴定本发明的生物化合物和编码该生物化合物的核苷酸序列，b)培养含有经鉴定的核苷酸序列的微生物，c)回收生物化合物和d)任选将生物化合物配制成液体或干燥产物。
本发明的其它方面包括适用于筛选方法的具体荧光偏振测定法。因此，本发明提供了用于下列目的的具体方法
检测木聚糖酶活性，所述方法包括通过用所述木聚糖酶水解测定经荧光标记的木聚糖的荧光偏振变化。
检测果胶酶活性，所述方法包括通过用所述果胶酶降解测定经荧光标记的果胶的荧光偏振变化。
检测淀粉酶活性，所述方法包括通过用所述淀粉酶水解测定经荧光标记的淀粉，极限糊精，直链淀粉或支链淀粉的荧光偏振变化。
检测转谷氨酰胺酶活性，所述方法包括通过用所述转谷氨酰胺酶将经荧光标记的蛋白质上的谷氨酸转移至未经标记的蛋白质上而测定所述经标记的蛋白质的荧光偏振变化。
检测木葡聚糖(xyloglucan)内切转糖基酶活性，所述方法包括通过用所述木葡聚糖内切转糖基酶将经荧光标记的寡木葡聚糖转移至未经标记的木葡聚糖而测定所述经标记的寡木葡聚糖的荧光偏振变化。
检测果胶甲酯酶活性，所述方法包括通过用所述果胶甲酯酶脱甲基化测定经荧光标记的甲基化果胶的荧光偏振变化。
检测阿拉伯聚糖酶活性，所述方法包括通过用所述阿拉伯聚糖酶水解测定经荧光标记的阿拉伯聚糖的荧光偏振变化。
检测甘露聚糖酶活性，所述方法包括通过用所述甘露聚糖酶水解测定经荧光标记的半乳甘露聚糖的荧光偏振变化。
检测鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性，所述方法包括通过用所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶水解测定经荧光标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的荧光偏振变化。
检测纤维素酶活性，所述方法包括通过用所述纤维素酶水解测定经荧光标记的纤维素或纤维素衍生物的荧光偏振变化。
本发明还包括可特别地用于本发明的筛选方法的新的荧光物质，因此，本发明涉及下列几个方面
荧光团标记的纤维素和产生该荧光物质的方法。
荧光团标记的直链淀粉和产生该荧光物质的方法。
荧光团标记的支链淀粉和产生该荧光物质的方法。
荧光团标记的极限糊精和产生该荧光物质的方法。
荧光团标记的聚半乳糖醛酸和产生该荧光物质的方法。
荧光团标记的甘露聚糖和产生该荧光物质的方法。附图简述
图1图示了筛选方法的步骤(1)=含有基因文库的宿主细胞培养物小瓶；(2)=转化子的预增殖；(3)=稀释转化子和/或克隆；(4)=在主培养板的微滴孔中分离和增殖转化子或克隆；(5)=将克隆转移至检测培养板中，对释放的生物化合物进行荧光偏振分析。
图2作图描述了表2的内容。
图3是与实施例3相关的结果，显示了相对于不含淀粉酶的样品(三角形)而言，用淀粉酶(方块)水解经荧光素标记的淀粉的过程中荧光偏振的降低。
图4是与实施例4相关的结果，显示了相对于不含木聚糖酶的样品(A)而言，用木聚糖酶(B)水解经罗丹明标记的木聚糖的过程中荧光偏振的降低。
图5是与实施例5相关的结果，显示了相对于不含转谷氨酰胺酶的样品(2)而言，用转谷氨酰胺酶(1)将经罗丹明标记的尸胺转移至酪蛋白的过程中荧光偏振的增加。
图6是与实施例7相关的结果，显示了用果胶甲酯酶(PME)使经荧光素标记的果胶脱甲基化，随后在(1)加入PME和2mMCaCl2，(2)加入PME但不加入CaCl2，(3)加入2mMCaCl2，但不加入PME和(4)不加入PME和CaCl2的情况下进行交联的过程中荧光偏振的增加。
图7是与实施例9相关的结果，显示了相对于不表达果胶酶活性的宿主细胞样品(三角形)而言，用转化子宿主细胞表达的果胶酶(方块)水解经荧光素标记的果胶的过程中荧光偏振的降低。发明详述定义
如上文所述，本文所用术语荧光偏振被简称为FP。
根据FP的原理，如果荧光物质被一束平面偏振光激发，它反过来也会发射平面偏振光。偏振的程度或发射光平面的角度与荧光分子在激发和发射时间之间移动(如旋转)多少成反比。将分子旋转约68.5度角所花的时间定义为分子的旋转弛豫时间。小分子的旋转弛豫时间相对较小(约1纳秒)，大分子的旋转弛豫时间相对较大(约100纳秒)。分子的旋转弛豫时间主要取决于其体积，以致于溶液中该分子发出的荧光的偏振与分子大小直接相关。
在本发明的上下文中，术语“核苷酸来源”应被理解为任何DNA,RNA或cDNA物质或含有DNA,RNA或cDNA的物质。
在本发明的上下文中，术语表达系统应被理解为能转录核苷酸序列并翻译合成相应的生物化合物的系统。表达系统可以是细胞或体外系统。
在本发明的上下文中，术语基因文库应被理解为得自核苷酸来源的DNA或cDNA片断。
在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”应被理解为细胞，该细胞可收留和表达得自基因文库的插入DNA或cDNA片断。
在本发明的上下文中，术语“转化子”或“转化的宿主细胞”应被理解为其中已插入得自基因文库的DNA或cDNA片断的宿主细胞。
在本发明的上下文中，术语“克隆”应被理解为细胞或转化的宿主细胞的拷贝。核苷酸来源
在本发明优选的实施方案中，核苷酸来源是细胞，如原核细胞，古生物细胞(archaeal cell)或真核细胞。可通过基因工程方法进一步修饰细胞。优选的细菌细胞是芽孢杆菌属的细胞，如地衣芽孢杆菌，而优选的真核细胞是哺乳动物细胞，如人细胞，植物细胞如拟南芥，或真菌如Meribipilus gigantus。
在另一个优选的实施方案中，核苷酸来源是混合细胞群体。如下文所述，可直接从任何生物或非生物样品，如土壤样品，水样品或瘤胃样品中进一步提取细胞的DNA或RNA。其它优选的核苷酸来源是嗜极端环境的原核细菌，如嗜热菌。
核苷酸来源也可以是经常规诱变的细胞，所述诱变如通过UV照射细胞或如Gerhardt等(1994)所述用化学诱变剂处理细胞。
其它核苷酸来源可以是按WO97/07205所述通过体内基因改组进行基因修饰的细胞群体。
在另一个优选的实施方案中，核苷酸来源是在体外制备的DNA、RNA、cDNA或人工基因序列制品，所述人工基因序列可通过下列方式得到，如基因改组(如Stemmer(1994)或WO95/17413所述)，随机诱变(如Eisenstadt E等(1994)所述)或使用PCR技术构建(如Poulsen等(1991)所述)。表达系统
如上文所定义，表达系统是能转录核苷酸序列并翻译合成相应的生物化合物的系统。表达系统可以是细胞或体外系统。有关体外偶联的转录和翻译的描述可参见Ohuchi等(1998)或Ellman等(1991)，它能表达核苷酸序列，如得自核苷酸来源的基因文库。对细胞表达系统而言，细胞可以是核苷酸来源自身，如野生型细胞，或者是得自转化的宿主细胞群体或其克隆的细胞，所述细胞含有根据本领域已知方法(如下文所述)制备自核苷酸来源的基因文库。宿主细胞
根据定义的宿主细胞可以是能收留和表达得自基因文库的核苷酸片断的任何细胞。
优选的宿主细胞自身不含有或表达编码会干扰FP筛选法的生物化合物的核苷酸序列(即未经转化的宿主细胞不能显著表达生物化合物)。该细胞特征可以是细胞的天然特征，或者通过如Christiansen等(1997)或Stoss等(1997)所述缺失所述核苷酸序列来获得。
在本发明另一个优选的实施方案中，宿主细胞是细菌细胞或真核细胞。另外，优选的细菌细胞是ElectroMAX DH1OB(GibcoBRL/Lifetechnologies,UK)细胞或大肠杆菌种的细胞，如Diderichsen等(1990)所述的SJ2大肠杆菌。其它优选的宿主细胞可以是芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌或芽孢杆菌的种。优选的真核细胞是酵母，如酿酒酵母。制备基因文库
可使用已知方法制备基因文库。
从细胞核苷酸来源提取DNA并制备基因文库的方法描述于例如Pitcher等(1989),Dretzen,G等(1981),WO94/19454,3969,Diderichsen等(1990)。
由体外制备的合成核苷酸来源制备基因文库的方法描述于Stemmer(1994)或WO 95/17413。将基因文库插入宿主细胞
通过插入含有得自基因文库的DNA或cDNA片断的质粒来转化宿主细胞的方法是本领域众所周知的，例见Sambrook等，1989,Ausubel等，1995和Harwood和Cutting,1990。
在本发明优选的实施方案中，被插入宿主细胞的质粒还含有能使转化子对抗细菌或抗真菌剂，如抗生素具有抗性的核苷酸序列(被称为抗生素标记)。优选的抗性针对的是氯霉素，四环素，卡那霉素，氨苄青霉素，红霉素或zeocin。
在本发明的另一个优选实施方案中，可使用WO94/19454,3969和Diderichsen等(1990)所述的赋予氯霉素抗性的pSJ1678质粒DNA转化SJ2大肠杆菌宿主细胞。或者，也可使用质粒pZEro-2(Invitrogen,CA,USA)。筛选方法
如上文所述，本发明提供了筛选编码生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括a)在表达系统中表达核苷酸序列以产生生物化合物，b)使生物化合物与能与该生物化合物反应的荧光物质接触以发生反应，c)测定荧光物质的荧光偏振，和d)选择荧光偏振发生变化的细胞或表达系统。
当本发明的具体实施方案为体外表达系统(如上文所述)时，筛选方法优选包括a)由核苷酸来源制备基因文库，b)将文库的基因片断分开放在不同的容器中。c)扩增分离的基因片断，d)体外偶联转录/翻译扩增的基因片断以表达生物化合物。e)将各个独立容器中的生物化合物或其次生样品与荧光物质接触，f)将生物化合物与荧光物质一起保温，g)通过与生物化合物反应以检测荧光物质的FP变化。
使用商购的标准装置，如移液管或自动化的移液装置，烧瓶，微滴板，摇床，恒温培养箱等可适当地进行可由图1表示的步骤a-g((1)+(2)+(3)=制备基因文库；(4)=分离，扩增和转录/翻译；(5)=与荧光物质一起保温并检测FP)。
通过与生物化合物反应而发生的荧光物质大小的变化使FP也发生了变化，通过商购的FP装置可检测这种变化。因此，只有在含有并表达编码可与荧光物质反应的生物化合物的基因片断或核苷酸序列的容器中才会发生FP变化(此处和下文中将称之为“阳性命中”)。
优选通过将文库稀释至能取出含有基因片断的等分试样的程度，优选平均为每份样品中含有一个基因片断，然后将样品转移至不同的容器，如微滴板的孔中，即可分离文库中的基因片断。通过常规的PCR技术以及体外偶联转录/翻译扩增的基因片断即可扩增分离的基因片断(例见Ohuchi等(1998)p4340或Ellman等(1991)，列入本文作为参考)。进行步骤e),f)和g)的其它优选条件在下文细胞表达系统的名下描述。
当本发明的具体实施方案为细胞表达系统(如上文所述)时，筛选方法优选包括a)预增殖和稀释含有核苷酸序列的细胞，b)将细胞分开放在不同的容器中，c)增殖分离的细胞以增加各个独立的容器中每个细胞的克隆数目，d)将各个独立容器中的细胞与荧光物质接触，e)将细胞与荧光物质一起保温，f)通过与细胞释放的生物化合物反应以检测荧光物质的FP变化。
使用商购的标准装置，如移液管或自动化的移液装置，烧瓶，微滴板，摇床，恒温培养箱等可适当地进行可由图1表示的步骤a-f((1)+(2)+(3)=预增殖和稀释；(4)=分离；(5)=与荧光物质一起保温并检测FP)。
在本发明的一个实施方案中，细胞的预增殖和稀释被设计成每个体积的细胞浓度适于取出含有最佳数目的分离细胞的等分试样。每份等分试样中的适当的细胞平均数目为0.3-10，优选为0.3-5，如0.3-1。
在优选的含水培养基中进行的细胞预增殖(图1中的第一幅图)使细胞克隆的数目增加了2至5倍。适当的保温温度范围为10-60℃，优选为30-50℃，如37℃，而pH维持在4-10之间，优选为6-8。保温时间应能调节以满足所需转化子和克隆浓度的需求，优选保温时间为15-60分钟，如40分钟。
当表达系统为宿主细胞培养物，其中的转化子含有得自核苷酸来源的基因文库时，也可进行预增殖以确保可能包含在转化宿主细胞的插入质粒中的抗生素标记的表达，使宿主细胞对培养基中的抗生素具有抗性。因此，通过在有利于表达选定类型的抗生素标记以及确保转化子的生存能力的条件下进行保温即可预增殖宿主培养物。
通过加入培养基可进行稀释(图1中的第二幅图)以确保所有细胞及其克隆都存在于稀释的溶液中。
通过将预定的特定体积的等分试样转移至不同的容器，如商购微滴板的孔中即可分离细胞(图1中的第三幅图)。
或者，分离还包括通过按WO98/58085(列入本文作为参考)所述使用FACS仪进行预筛选，因此，步骤b)包括下列步骤1)将荧光物质插入细胞，所述细胞的特征在于通过与细胞内部的生物化合物反应而改变发射光强度，2)利用FACS仪筛选，选择和分离发射光强度发生变化的细胞。
增殖分离的细胞以增加各个容器中的克隆数目，优选增加至107-108个克隆/ml。如果使用的是微滴板，可将这些板称为“主平板”。为了筛选细菌基因文库，一般需要使用50-100块各有96孔的主平板。使用主平板的一个优点是可以提供活的细胞样品供筛选，使得即使随后的筛选条件导致筛选细胞死亡，也可以回过头来找到与筛选结果相对应的筛选细胞的活样品。
在另一个优选的实施方案中，适当的保温温度范围为10-60℃，优选为30-50℃，如37℃，而pH维持在4-10之间，优选为6-8。保温培养基应满足细胞和克隆的营养需求以确保充足的生长。
当表达系统为宿主细胞培养物，其中的转化子含有得自核苷酸来源的基因文库和抗生素标记时，可适当选择能杀死或抑制未被转化的宿主细胞的培养基。
保温时间应能调节以确保生长产生足够数目的细胞/克隆，以适于取出含有适当数目供筛选的克隆的等分试样，同时在主平板中保留大量活的克隆。优选的增殖时间为40-90小时，如48小时，具体时间取决于微生物宿主细胞的类型和增殖的条件。
当表达系统为含有基因文库的宿主细胞培养物，其中转化的宿主细胞中包含抗生素标记时，在本发明的优选实施方案中，应在能选择性杀死或抑制未被转化的宿主细胞生长的培养基中进行预增殖，稀释和/或增殖。优选通过在培养基中加入对未被转化的宿主细胞而言为有效量的而转化子或其克隆却能抵抗的抗生素来达到上述目的。
通过例如移液管将细胞的等分试样转移至适于测定FP的微滴检测板(图1中的第四幅图)中，如Bibby Sterilin有限公司，UK或DynexTechnologies,VA,USA的黑色微滴板。通过例如在每个孔中加入物质混合物而使细胞/克隆与一种或多种具有FP特性的荧光物质接触。荧光物质应适于与所需类型的生物化合物反应(如适于与细胞释放的果胶酶反应的经荧光标记的果胶)。生物化合物与荧光物质之间的接触通常发生在细胞外培养基中，所需条件是为了得到充足的FP反应。当生物化合物被限制在细胞内部时，可裂解细胞或要不然破坏其完整性以将生物化合物释放至培养基中。
将细胞、培养基和荧光物质的混合物保温以使生物化合物与荧光物质反应。
通过与生物化合物反应而发生的荧光物质大小的变化使FP也发生了变化，通过商购的FP装置可检测这种变化。因此，只有在含有并表达编码可与荧光物质反应的生物化合物的核苷酸序列的细胞中才会发生FP变化(此处和下文中将称之为“阳性命中”)。
可在有利于生物化合物和荧光物质之间发生反应的条件下进行保温。在优选的实施方案中，从pH和温度着手使荧光物质和生物化合物之间的反应最优化。保温也可在导致细胞死亡的极端条件下进行(如很低的温度(如30℃以下或20℃以下)或高温(如60℃以上或70℃以上)，低pH(如5以下或4以下)或高pH(如9以上或10以上)，低或高离子强度，有害化合物如去污剂的存在)，这取决于需检测何种生物化合物。例如，如果想寻找的生物化合物是热稳定性的化合物，即可在高温下进行保温，需满足的前提条件是只有在高温下保持活性的生物化合物才能与荧光物质反应。
优选将阳性命中鉴定为产生FP变化的细胞/克隆或体外表达系统，基于选定条件下选定荧光物质FP背景值方差，上述阳性命中的标准偏差大于3.5。尽管存在正在克隆的宿主细胞，但由于微滴板每个孔中的内容物非常均一，因此孔与孔之间的差异非常小(见实施例27和28)。当使用可溶性的荧光标记底物(如可溶性淀粉)时，每个96孔板的标准偏差一般为2至3％。然而，一些不溶于孔中的底物(如荧光标记的直链淀粉和PASC)却产生了较高的差异，一般为5至7％标准偏差。由于使用荧光偏振可以高度准确地筛选基因文库，此检测法变得非常灵敏，即使在所用的检测条件下表达水平低或比活性低，也可检测到酶活性。
因此，可筛选细胞核苷酸来源的DNA或得自核苷酸来源并在体外表达系统中表达或通过转化至宿主细胞表达系统中表达的基因文库，从中得到编码与选定范围的荧光物质反应的生物化合物的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，通过将检测板置于FP装置中并测定保温过程中FP的变化即可实时检测荧光物质与生物化合物之间的反应。
在本发明另一个优选的实施方案中，通过测定与荧光物质自身的背景值相比，保温预定的一段时间之后FP的变化来检测荧光物质与生物化合物之间的反应(终点测定)。
商购的装置中附有FP检测技术和有关新式装置的描述，例如Jolley Consulting and Research公司，IL,USA。其它参考文献例见Checovich等(1995)。
当鉴定出阳性命中时，通过利用常规的筛选技术或重复本发明的方法可以证实发现的生物化合物来自单个细胞的克隆。通过在适当的琼脂平板上对克隆进行重新划线接种并检测所得单菌落中的所述生物化合物即可达到上述目的。生物化合物
本发明上下文中的生物化合物可以是能在表达系统中表达并具有工业实用性的任何化合物。
在本发明优选的实施方案中，生物化合物可以是蛋白质，多肽或肽。
优选的生物化合物是酶，根据国际生物化学和分子生物学联合学会命名委员会的推荐(1992),Academic出版社公司，1992，可将酶分为下列几类，如氧化还原酶(EC 1.-.-.-)，转移酶(EC 2.-.-.)，水解酶(EC 3.-.-.-)，裂合酶(EC 4.-.-.-)，异构酶(EC 5.-.-.-)，连接酶(EC 6.-.-.-)。
所述水解酶可以是内切-，外切-，羧基-或氨基肽酶，内切-或外切葡聚糖酶，内切-或外切淀粉酶，脂肪酶或酯酶。
另外，生物化合物对人或动物体还具有医疗效果，如激素或其它蛋白质，多肽或肽，它们对人或动物的受体起作用。
其它优选的生物化合物是细胞外的化合物，如胞外酶，即由细胞分泌或要不然输出至细胞周围介质的化合物。在某些情况下，生物化合物必须是细胞外的化合物，因为当化合物被限制在细胞内时即不具有活性。例如，如某些蛋白酶的一些酶以无活性的前体形式被合成，例如只要位于细胞内，即与信号肽或前肽结合使酶没有活性。通过从细胞中输出，进入周围的细胞外介质时，信号肽被裂解下来，使酶变得有活性(Simonen和Palva(1993))。一些支链淀粉酶和脂肪酶在胞质中也缺乏活性或活性降低，分泌后可被激活(Gotz等(1998)和Pugsley等(1990))。荧光物质
本发明上下文中的荧光物质可以是自身具有荧光特性或被荧光标记物标记的任何有机或生物化合物。在本发明的上下文中，本领域技术人员可从多种可能的荧光物质中进行选择，因为该方法基于测定恒定荧光强度之样品的FP，即恒定强度的发射光的偏振变化。相对于基于测定荧光物质强度变化的方法而言，该方法具有几个优点ⅰ)生物化合物和荧光物质的产荧光部分(荧光团)之间不必反应，因为无需改变荧光团的特性来改变发射光的强度，因此，在本发明的上下文中，有用的荧光物质不限于经设计后可通过与生物化合物反应而改变强度的物质(这种荧光物质经常含有荧光团和淬灭组分，它们在空间上必须相隔一定的距离)。ⅱ)通过例如标记技术依次可设计适当的荧光物质并制备荧光物质，所述荧光物质与在想达到的真正的工业应用中可与生物化合物反应的物质非常类似。因此，对荧光物质被设计成例如在筛选过程中穿透细胞和留在细胞内部没有限制。ⅲ)荧光物质与在想达到的真正的工业应用中可与生物化合物反应的物质之间的高度相似性使得筛选方法具有特异性和多用性，即适用于多种类型的不同生物化合物。ⅳ)相对于基于测定发射光强度的方法而言，FP原理是提供较好的信号与噪声比的比例测定，即干扰检测的背景噪声较少。ⅴ)FP检测法是真正的均匀检测法，也就是说无需洗涤或分离例如未反应的荧光物质。
在优选的实施方案中，荧光物质是被荧光标记物(荧光团)标记的有机分子。有机分子可以是多聚体、寡聚体或单体，并可进一步被一个以上的荧光标记物标记。有机分子上的标记物可以结合至有机分子上0.01-10％可供结合的位点(标记程度)。优选范围为0.5-5％，如2％。荧光标记物可通过共价键、离子键或氢键与有机分子结合。
有机分子优选为蛋白质，肽，糖蛋白，脂蛋白，单糖，多糖或寡糖，甘油三酯或核苷酸。有机分子还可用作由从细胞或基因文库中欲筛选的核苷酸序列编码的生物化合物的底物或抑制剂，人或动物受体，单或多克隆抗体。优选有机分子可溶于或可分散在含水介质中。
优选的蛋白质是酪蛋白，酪蛋白的衍生物，明胶，白蛋白，大豆蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人受体或动物受体，如国家专利DK/97/0879或WO99/03498所述的组织因子。优选的肽是尸胺。
优选的多糖可以是葡聚糖，如淀粉葡聚糖(如直链淀粉和/或支链淀粉)，糊精(如极限糊精)，果胶/多聚半乳糖醛酸，纤维素(如Schulein(1997)所述的用磷酸溶胀的纤维素)或其衍生物或半纤维素。优选的半纤维素是木葡聚糖，木聚糖，阿拉伯葡聚糖或阿拉伯聚糖。甘露聚糖(如半乳甘露聚糖)和聚半乳糖醛酸(如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖)也是有用的。
其它有用的有机分子是酚类分子，如可通过用氧化还原酶氧化而被聚合化的酚类多糖。
有机分子可被化学合成或酶促合成。或者可得自动物，人，植物或微生物来源，还可随后被化学或酶促修饰和/或纯化。
标记物在350-700nm的范围内，如400-600nm处具有激发最大值比较合适，而发射最大值的适当范围为450-800nm，如500-700nm。
优选标记物与有机分子缀合或结合以使标记物与有机分子和其它荧光标记物之间的距离保持为20-50埃，不易使标记物淬灭。标记物和有机分子之间的键优选为刚性键，该键限制标记物自身围绕键轴转动，而不受有机分子的移动影响，从而使标记物的移动主要或实质上受有机分子转动(围绕有机分子的旋转轴)的控制。
标记物的荧光弛豫时间为1-7纳秒，优选为3-5纳秒。
优选的标记物是BODIPY衍生物，荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰及其衍生物(如丹磺酰尸胺)，德克萨斯红(皆可得自Molecular Probes,OR,USA)以及花菁染料(可得自Amersham,Buckinghamshire,UK)。
荧光物质(有机分子和荧光标记物的联合)应具有的偏振值范围为50-500mP(毫偏振单位)，优选为100-300mP，如200mP。
本发明还包括对上述筛选方法特别有用的新的荧光物质。一种优选的荧光物质是荧光团标记的纤维素，例如用磷酸溶胀的纤维素(PASC)或羧甲基纤维素(CMC)可被如6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)的荧光团标记。产生荧光纤维素的方法包括ⅰ)将纤维素或其衍生物悬浮或溶解于含水碱性反应介质中；ⅱ)使悬浮或溶解的纤维素或其衍生物与荧光团保温/反应；ⅲ)从碱性反应介质中分离经标记的纤维素或其衍生物并洗涤经标记的纤维素和ⅳ)中和经标记的纤维素或其衍生物。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的聚半乳糖醛酸。例如，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖可被如6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)的荧光团标记。产生荧光鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的方法包括ⅰ)将鼠李糖半乳糖醛酸聚糖悬浮和/或溶解于碱性含水介质中；ⅱ)使悬浮或溶解的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖与荧光团保温/反应；ⅲ)中和碱性反应介质；ⅳ)从中和的反应介质中分离经标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖并洗涤经标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的甘露聚糖。例如，半乳甘露聚糖可被如6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)的荧光团标记。产生荧光半乳甘露聚糖的方法包括ⅰ)将半乳甘露聚糖悬浮和/或溶解于碱性含水介质中；ⅱ)使悬浮或溶解的半乳甘露聚糖与荧光团保温/反应；ⅲ)从碱性反应介质中分离经标记的半乳甘露聚糖并洗涤经标记的半乳甘露聚糖。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的木聚糖。例如，木聚糖可被如丽丝胺罗丹明磺酰氯的荧光团标记。产生荧光木聚糖的方法包括ⅰ)将木聚糖悬浮和/或溶解于碱性含水介质中；ⅱ)使木聚糖酰胺化；ⅲ)使酰胺化的木聚糖与荧光团保温/反应；ⅳ)分离并洗涤/纯化经标记的木聚糖。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的木葡聚糖。例如，木葡聚糖可被如荧光素-5-氨基硫脲的荧光团标记。产生荧光木葡聚糖的方法包括ⅰ)将木葡聚糖悬浮和/或溶解于含有氧化剂的水介质中；ⅱ)分离/纯化所需的部分氧化的木葡聚糖组分；ⅲ)使氧化的木葡聚糖与荧光团保温/反应；ⅳ)分离并洗涤/纯化经标记的木葡聚糖。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的阿拉伯聚糖。例如，阿拉伯聚糖可被如荧光素-5-氨基硫脲的荧光团标记。产生荧光阿拉伯聚糖的方法包括ⅰ)将阿拉伯聚糖悬浮和/或溶解于含有氧化剂的水性介质中；ⅱ)分离/纯化所需的部分氧化的阿拉伯聚糖组分；ⅲ)使氧化的阿拉伯聚糖与荧光团保温/反应；ⅳ)分离并洗涤/纯化经标记的阿拉伯聚糖。
另一个优选的荧光物质是用荧光团标记的果胶/多聚半乳糖醛酸。例如，可使用如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的中介剂，用如荧光素-5-氨基硫脲的荧光团标记果胶的羧酸基团。产生荧光果胶的方法包括ⅰ)将果胶悬浮和/或溶解于含水介质中；ⅱ)使果胶与荧光团和中介剂保温/反应；ⅳ)分离并洗涤/纯化经标记的果胶。其它用途
上文所述的FP法还可用于本发明范围内的生物化合物之工业化生产中的质量或发酵控制。材料和方法保藏的微生物
根据有关国际公认的用于专利方法的微生物保藏的布达佩斯条约，申请人将下列微生物保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH
1999-02-03；芽孢杆菌RCS 242B；DSM保藏号为12663，
1999-02-03；芽孢杆菌RCS 245B；DSM保藏号为12664，
1999-02-15；枯草芽孢杆菌MB208；DSM保藏号为12682，
1999-02-26；芽孢杆菌的种；DSM保藏号为12708，
1999-02-26；芽孢杆菌的种；DSM保藏号为12709。构建基因文库
在液体LB培养基中增殖从中提取DNA用于构建文库的细菌菌株。收集细胞，通过Pitcher等，1989所述的方法分离基因组DNA。
在实施例25和26中，用限制性酶Sau3A部分消化基因组DNA，通过在0.7％琼脂糖凝胶上电泳进行大小分级分离。通过在DEAE-纤维素纸上电泳(Dretzen,G等，1981)分离大小为2至7kb的片断。
将分离的DNA片断连接至经BamHI消化的pSJl678(见WO94/19454,3969)质粒DNA，使用连接混合物转化大肠杆菌菌株SJ2(Diderichsen等(1990))。
制备大肠杆菌SJ2细胞，按厂商所述的方法，使用购自BIO-RAD的Gene PulserTM电穿孔仪通过电穿孔进行转化。按Sambrook等，1989,Ausubel等，1995和Harwood和Cutting,1990所述进行所有的分子生物学工作。
在实施例27-29中，按下述在pZEr0-2(Invitrogen,CA,USA)中制备文库用限制性酶Sau3A部分消化染色体DNA，随后通过凝胶电泳进行大小分级分离。纯化2至8kb的片断并连接至用BamHI消化的pZEr0-2中。通过按销售商所述的方法进行电穿孔，用连接混合物转化ElectroMAX DH10B(GibcoBRL/Life technologies,UK)。在不含抗生素的LB培养基中将转化的细胞培养60分钟，加入甘油至浓度为15％，将等分试样冻干。通过涂布于含有10μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上来测定每份等分试样中的转化子数目。操纵微滴板并在微滴板中增殖大肠杆菌SJ2
为了操纵主平板，使用装配有S20移液枪(stacker)的TitertekMicrodrop装置(Life Technologies,MD,USA)自动地将转化的文库充入孔中。为了将主平板中的细胞转移至检测板中，使用了Platemate自动移液器(Matrix Technologies,MA,USA)装置。
在LB肉汤培养基(5g/l NaCl,5g/l酵母提取物(Difco,MI,USA)，10g/l胰蛋白胨(Difco,MI,USA))中增殖大肠杆菌SJ2转化子及其克隆。于37℃，在Nunclon MicroWell 96F平板(NUNC，丹麦)上增殖大肠杆菌转化子及其克隆，并以200rpm的速度振荡3天，然后进行筛选。进行FP检测之前，通过使50μl转化子或其克隆与150μl含有荧光物质的溶液混合而使转化子或其克隆与荧光物质混合。测定荧光偏振
为了检测样品池中的荧光偏振，使用了为快速偏振而装配的LS50B(Perkin Elmer,CT,USA)，为了检测微滴板中的荧光偏振，使用了FPM-2(Jolley Consulting and Research公司，IL,USA)。对相同孔和几个孔中的相同样品进行重复检测的差异表明标准差为2％至4％。使用了两种类型的黑微滴板Sterilin平底孔板(Bibby Sterilin有限公司，UK)和Microfluor U-底板(Dynex Technologies,VA,USA)。
为了检测微滴板中的荧光素，插入激发滤光器，使485nm的光可以通过，带通为22nm。插入发射滤光器，使520nm的光可以通过，带通为30nm。
为了检测微滴板中的罗丹明，插入激发滤光器，使546nm的光可以通过，带通为12nm。再插入发射滤光器，使590nm的光可以通过，带通为35nm。
根据仪器操作手册计算光栅系数。
高物料流通量的荧光偏振检测所用的仪器是基于流动池的仪器，如经改良的LS50B(Perkin-Elmer公司，CT,USA)，基于微滴板的读数仪，如Polarstar(BMG，德国)或装配用于荧光偏振的FACS(流式激活细胞分选仪)(Arndt D.J等(1976)和Lindmo,T和H.B.Steen,1977)。试验中所用的酶和底物
经丹磺酰，四甲基罗丹明，BODIPY_-TR和德克萨斯红标记的尸胺得自Molecular Probes,OR,USA。由牛奶而来的去磷酸化的α-酪蛋白和经荧光素标记的土豆淀粉得自Sigma,MO,USA。酯化程度较低(3％)的柑桔果胶得自Copenhagen Pectin,Lille Skensved，丹麦。酯化程度为77.4％的苹果果胶得自Herbstreith KG，德国。木聚糖酶实验所用的桦木木聚糖得自Sigma,MO,USA。得自糖甜菜的阿拉伯聚糖和得自tamaring种子的木葡聚糖(淀粉样)都购自Megazyme(悉尼，澳大利亚)。得自土豆的直链淀粉(Ⅲ型)和得自玉米的支链淀粉都可购自Sigma,MO,USA。得自Locus豆胶的半乳甘露聚糖可购自Sigma,MO,USA。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖可得自Copenhagen Pectin,LilleSkensved，丹麦。可按Schulein(1997)所述制备用磷酸溶胀的纤维素。通过按Tada等(1989)所述，用得自米曲霉的淀粉酶水解玉米淀粉可得到极限糊精。
还使用了下列酶，它们是WO9414952中所述的聚半乳糖醛酸酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；如WO94/21786所述可得自棘孢曲霉的果胶裂合酶；如国家专利申请号DK/97/1344所述可得自地衣芽孢杆菌的果胶酸裂合酶；如WO94/20611所述可得自棘孢曲霉的阿拉伯聚糖酶；如WO94/14953所述可得自棘孢曲霉的木葡聚糖酶(内切葡聚糖酶Ⅱ)；可得自NovoNordisk A/S，丹麦的淀粉酶(Termamyl_)；如Christgau等，1996所述可得自棘孢曲霉的果胶甲酯酶；如WO96/23366所述可得自恶疫霉(Phytophthora cactorum)的转谷氨酰胺酶；如Fry等，1992所述可纯化自土豆的部分纯化的土豆木葡聚糖内切转糖基酶；可得自NovoNordisk A/S，丹麦的木聚糖酶(BioFeed_Wheat)；如WO94/25576所述可得自棘孢曲霉的甘露聚糖酶；得自Novo Nordisk A/S的淀粉酶Novamyl；按Shen等(1988)所述可得到的C.thermosulfurogenes β-淀粉酶；如WO94/20612所述可得自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶；如WO96/29397所述可得自Humicola insolens的Cel45纤维素酶。BP-X培养基
按下述制备BP-X培养基将100g土豆粉，50g大麦片和800mg BAN淀粉酶(可得自Novo Nordisk A/S，丹麦)混合于800ml水中，加热溶液至约70℃，保温30分钟。在冷却的过程中加入10g酪蛋白酸钠(MD-Food，丹麦)。冷却至室温时加入20g豆粉，9g磷酸氢二钠(MERCK)，0.1g pluronic PE 6100(BASF)以及1000ml水。TY培养基
按Ausubel等(1995)所述制备TY培养基。实施例
通过下列非限制性的实施例来阐明本发明实施例1标记寡木葡聚糖
按Fry等(1997)所述用磺基罗丹明末端标记寡木葡聚糖。实施例2通过部分化学氧化标记木葡聚糖
搅拌7小时，将木葡聚糖(0.50g)溶解于60℃的水(60ml)中。使溶液冷却至室温，加入含有偏高碘酸钠(15mg)(Merck，德国)的水溶液(10ml)。将混合物在黑暗中放置过夜，然后对脱矿质水透析(截留分子量为12,000-14,000)并频繁更换接受溶液。将25mg荧光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)溶解于1ml DMF(Sigma,MO,USA)中，将此橙色溶液加入经透析的聚合物中(约60ml溶液)。黑暗中搅拌该溶液18小时，通过加入96％的乙醇(20ml)来沉淀聚合物，在Miracloth(Calbiochem，德国)上过滤以收集湿的聚合物，用水和乙醇的混合物(1∶1)洗涤直至得到无色的滤过液。最后，用无水乙醇洗涤经标记的黄色的木葡聚糖并风干。据估计，标记程度为0.6％(由492nm处的吸收值来计算)。实施例3通过部分化学氧化标记阿拉伯聚糖
将阿拉伯聚糖(0.50g)溶解于水(10ml)中，加入含有偏高碘酸钠(15mg)的水溶液(5ml)。将混合物在黑暗中放置过夜，然后用水(15ml)稀释，将溶液对水透析(截留分子量为12,000-14,000)并频繁更换接受溶液。将25mg荧光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)溶解于1ml DMF中，将此橙色溶液加入经透析的聚合物中。黑暗中搅拌该溶液36小时，然后将溶液分成两份，将其中的一份浓缩为较小的体积，通过加入90％的乙醇来沉淀聚合物，据估计，标记程度为0.7％(由492nm处的吸收值来计算)。实施例4标记多聚半乳糖醛酸
标记策略包括使用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(FLUKA，瑞士)为中介剂，使肼或胺激活的探针(如荧光素-5-氨基硫脲)与羧酸偶联以标记果胶/多聚半乳糖醛酸的羧酸基团。
将酯化程度为3％,35％或77％的多聚半乳糖醛酸(1g)溶解于25ml脱矿质水中(溶解酯化程度为35％和77％的果胶时还需要加热和加水)，随后边搅拌边加入20mg荧光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)，用1M NaOH将pH调节至5.9，在1小时内边搅拌边加入(1g)1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，将溶液在黑暗中保温过夜，在溶液中加入10％醋酸(v/v)，接着加入甲醇至终浓度为75％(v/v)甲醇。将溶液在黑暗中放置1小时，在2层Miracloth(Calbiochem，德国)上过滤以收集沉淀的果胶，用醋酸∶乙醇(1∶19v/v)，乙醇(96％)和丙酮洗涤。将经标记的果胶置于黑暗中干燥，标记程度为0.3至0.7％。实施例5标记木聚糖
将2.0g木聚糖悬浮于50ml 90℃的水中，随后冷却至30℃。溶解17.5g固体乙二胺二盐酸盐(FLUKA，瑞士)，于25℃加入10M NaOH将pH调节至5.9。缓慢加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(5g)，25℃下搅拌混合物过夜。用125ml水稀释溶液，随后加入12.5ml醋酸和375ml甲醇。在12cm漏斗中的2层Miracloth(Calbiochem，德国)上过滤以收集木聚糖沉淀物。将潮湿的木聚糖重新溶解于吡啶/醋酸/水(体积比为1∶1∶18)至终体积为125ml。在混合物中加入375ml甲醇并保温1小时。按上述在Miracloth上收集木聚糖沉淀物。用1升甲醇/吡啶/醋酸/水(体积比为60∶1∶1∶18)冲洗木聚糖，接着再用1升乙醇洗涤，最后用0.5升丙酮洗涤。收集并干燥酰胺化多糖。将1.40g酰胺化木聚糖溶解于35ml热的200mM焦磷酸钠溶液中。当酰胺化的木聚糖溶解之后，将溶液冷却至室温，pH调节至9.5。在3小时内，在木聚糖中缓慢加入溶于无水二甲基甲酰胺中的1％(w/v)丽丝胺罗丹明磺酰氯(Molecular Probes,OR,USA)。将溶液对3×1升含有0.5％1,1,1-三氯-2-甲基丙二醇的脱矿质水进行透析(截留分子量为10,000-12,000)。回收内容物，加入2ml醋酸和2ml吡啶，接着加入150ml甲醇以沉淀木聚糖。将沉淀的木聚糖重新溶解于50ml吡啶/醋酸/水(体积比为1∶1∶18)，并通过加入150ml甲醇重新沉淀木聚糖。重复洗涤步骤直至上清液不含任何染料。用200ml丙酮将沉淀的木聚糖洗涤2次并干燥。实施例6标记经磷酸溶胀的纤维素(phosphoric acid swollencellulose,PASC)
用0.5M NaOH将250ml 10％的PASC水溶液(约含2.5g纤维素)的pH调节至10.5，在黑暗中与6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)保温过夜。离心反应混合物，除去上清液。使用100ml 0.1M NaOH溶液将经标记的聚合物洗涤5次。每次洗涤后需离心并除去上清液。用2×250ml水中和洗涤的经标记的聚合物并重新悬浮于250ml水中。实施例7标记直链淀粉
于100℃，在水(30ml)中将直链淀粉(250mg)回流10分钟，用NaOH将pH调节至11。将浑浊的溶液冷却至室温，并用11mg 6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)进行处理。用EtOH/MeOH/AcOH(15∶2∶1,20ml)的混合物沉淀经标记的聚合物，在Miracloth上收集所述聚合物并用EtOH(96％,30ml)和丙酮(140ml)洗涤，最后将聚合物溶解于水中并冻干。实施例8标记支链淀粉
于100℃，在水(30ml)中将支链淀粉(250mg)回流10分钟，用NaOH将pH调节至11。将浑浊的溶液冷却至室温，并用11mg 6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)进行处理。用EtOH/MeOH/AcOH(15∶2∶1,15ml)的混合物沉淀经标记的聚合物并用EtOH(96％，30ml)洗涤，在Miracloth上收集所述聚合物并用EtOH(96％,70ml)洗涤，最后将聚合物溶解于水中并冻干。实施例9标记极限糊精
在pH4.5，50℃下，用得自米曲霉的淀粉酶(Tada等(1989))将玉米淀粉水解120小时。在Bio-gel P-2柱上纯化极限糊精。收集含有DP 15-33的级分并冻干。将508mg糊精重新溶解于20ml水中，加入溶于1ml DMF中的75mg 5-氨基荧光素，黑暗中搅拌2小时。使用76.2mgNaCNBH3还原所得亚胺键。在SEC柱上纯化经标记的糊精。实施例10标记鼠李糖半乳糖醛酸聚糖
在pH值被1M NaOH调节至11的1.5％鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(Copenhagen Pectin,Lille Skensved，丹麦)水溶液(约225mg/15ml)中加入12mg 6-DTAF(6-荧光素二氯三嗪)，黑暗中将溶液搅拌过夜，用0.5M HCl中和，加入EtOH(30ml)，在Miracloth上收集聚合物并先用EtOH/水(2∶1,150ml)，然后用EtOH(400ml)洗涤，将聚合物溶解于水(25ml)中并冻干。实施例11标记半乳甘露聚糖
将2.695g半乳甘露聚糖溶解于250ml水中并用0.5M NaOH调节pH至10，加入0.127g DTAF(6-荧光素二氯三嗪)，在黑暗中将溶液搅拌24小时。用500ml EtOH沉淀产物，随后用250ml EtOH将产物洗涤3次，用250ml丙酮将产物洗涤1次。蒸发除去溶剂，将经标记的聚合物重新溶解于400ml水中。实施例12通过荧光偏振检测淀粉酶活性
检测淀粉酶活性的方法包括使淀粉酶(Termamyl_)与实施例7中经荧光素标记的土豆淀粉一起保温，并测定荧光偏振的变化。如表1所示，观察到荧光淀粉经淀粉酶水解后荧光偏振有所降低。表1
室温下，在体积为200μl的pH6.8 BR-缓冲液(23mM H3PO4,23mMCH3COOH,23mM H3BO3)中，将Termamyl_与每孔中的33μg经荧光素标记的土豆淀粉一起保温180分钟进行水解反应。180分钟的反应时间过后，荧光偏振大约降低了20％。
图3显示了整个过程中的FP变化，阐明了淀粉酶水解淀粉的速率。方块和三角形分别表示加或不加Termamyl_时荧光淀粉的FP检测结果。
通过荧光偏振也可检测由克隆的大肠杆菌SJ2转化子表达的淀粉酶。从37℃振荡过夜培养的主平板中取出约50μl等分试样，将等分试样混合于含有150μl pH6.8的检测缓冲液(23mM H3PO4,23mM CH3COOH,23mM H3BO3)的微滴板孔中，所述缓冲液中还含有33μg用荧光素痕量标记的淀粉。室温下保温3小时之后，FP有所降低，结果示于表2。表2实施例13通过荧光偏振检测木聚糖酶活性
检测木聚糖酶活性的方法包括使BioFeed_Wheat木聚糖酶与经罗丹明标记的木聚糖一起保温，并测定荧光偏振的变化。观察到荧光底物经木聚糖酶水解后荧光偏振有所降低。图4的B柱表示相对于不含木聚糖酶的A柱而言，由于经标记的木聚糖被木聚糖酶水解而使荧光偏振有所降低。通过在40℃，pH6.0的磷酸钠缓冲液(100mM磷酸盐)中将木聚糖酶与0.001％(w/v)经罗丹明标记的桦木木聚糖保温30分钟而进行水解反应。实施例14通过荧光偏振测定转谷氨酰胺酶活性
检测转谷氨酰胺酶活性的方法包括将得自恶疫霉的转谷氨酰胺酶与经荧光标记的尸胺(供体)和(去磷酸化的)酪蛋白(受体)一起保温并测定荧光偏振的变化。检测了多个荧光标记物，它们是荧光素，丹磺酰，罗丹明和BODIPY-TR。表3
表3的结果显示出由于转谷氨酰胺酶将经不同标记物标记的尸胺转移至更大的酪蛋白分子上，荧光偏振有所增加。
在42℃，pH7.6的Tris缓冲液(10mM Tris,20mM CaCl2,100mMNaCl和4.5mM二硫苏糖醇)中，将转谷氨酰胺酶与16μM经标记的尸胺和20.8μM酪蛋白一起保温3小时进行转移反应。然而，FP检测在室温下进行。对经丹磺酰标记的尸胺而言，激发和发射波长分别为385nm和520nm。对经荧光素标记的尸胺而言，激发和发射波长分别为485nm和525nm。对经罗丹明标记的尸胺而言，激发和发射波长分别为545nm和578nm。对经BODIPY_-TR标记的尸胺而言，激发和发射波长分别为588nm和615nm。可使用经装配可快速偏振的Perkin Elmer LS50B进行检测，整合时间为1秒。
也可通过监测整个过程中荧光偏振的增加来测定转谷氨酰胺酶活性。图5显示出相对于不存在转谷氨酰胺酶的反应(曲线2)而言，得自恶疫霉的转谷氨酰胺酶在0-300分钟的时间内将经罗丹明标记的尸胺(16μM)转移至酪蛋白(20.8μM)的情况(曲线1)。反应在室温下，pH7.6的Tris缓冲液(10mM Tris,20mM CaCl2,100mM NaCl和4.5mM二硫苏糖醇)中进行。实施例15通过荧光偏振测定木葡聚糖内切转糖基酶活性
检测木葡聚糖内切转糖基酶(XET)活性的方法包括将木葡聚糖内切转糖基酶与经磺基罗丹明标记的寡木葡聚糖(供体)和木葡聚糖(受体)保温并测定荧光偏振的变化。表4
表4的结果显示出相对于不存在XET的反应而言，由于XET酶将经标记的寡木葡聚糖转移至更大的木葡聚糖分子上，荧光偏振有所增加。
在室温下，pH5.5的琥珀酸盐缓冲液(133mM琥珀酸钠，3.8mMCaCl2,1.9mML-半胱氨酸)中，将XET与2.25μM经磺基罗丹明标记的寡木葡聚糖和2g/l木葡聚糖保温过夜，即可进行转移反应。
通过将寡木葡聚糖的浓度降低至0.45μM，在2-3小时内即可得到阳性反应(未显示)。实施例16通过荧光偏振检测果胶甲酯酶活性
检测果胶甲酯酶(Pectin Methyl Esterase,PME)活性的方法包括将PME与经荧光素标记的果胶(羧酸基团的甲基酯化程度为77％)一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到PME所致的去甲基化和随后进行的去甲基化果胶的交联作用使得荧光偏振有所增加。表5
表5的结果显示出相对于不存在PME的反应而言，由于PME导致去甲基化之后经标记果胶的交联作用使得荧光偏振增加。在室温下，200μl的pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和2mM CaCl2)中将纯化的PME与70μg经标记的果胶保温180分钟即可进行去甲基化反应。
Ca2+对反应动力学影响的实验结果示于图6。当加入Ca2+时，在30分钟内即可检测到荧光偏振的变化(曲线1)。然而，如果不加Ca2+，反应动力学就有所不同，需保温2.5小时方可观察到显著变化(曲线2)。为了进行比较，重复不加PME的实验，图6的曲线3显示了加Ca2+的结果，而曲线4显示了不加Ca2+的结果。所有反应都在室温下，200μl含或不含2mM CaCl2的pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠)中进行，所述缓冲液中含有70μg DE=77％的果胶。实施例17通过荧光偏振检测阿拉伯聚糖酶活性
检测阿拉伯聚糖酶活性的方法包括将得自棘孢曲霉的阿拉伯聚糖酶与经荧光素标记的得自糖甜菜的(0.7％)非脱支阿拉伯聚糖一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因阿拉伯聚糖酶所致的水解或解聚而使经标记的阿拉伯聚糖的荧光偏振降低。表6
表6的结果显示出相对于未加阿拉伯聚糖酶的反应而言，由于经标记的阿拉伯聚糖分别被添加的0.5μl和5μl阿拉伯聚糖酶水解而使荧光偏振降低。在50℃下，pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和7mM NaCl)中将阿拉伯聚糖酶与170μg/ml经标记的阿拉伯聚糖保温16小时即可进行水解反应。反应体积为200μl。FP检测在室温下进行。实施例18通过荧光偏振检测果胶酶活性
检测果胶酶(多聚半乳糖醛酸酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，得自棘孢曲霉的果胶裂合酶和得自地衣芽孢杆菌的果胶酸裂合酶)活性的方法包括将各种果胶酶与两种经荧光素标记的甲基化或酯化(％DE)程度不同的果胶一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因果胶酶所致的水解使得经标记的果胶的荧光偏振降低。
表7显示出相对于不含果胶酶的对照样品而言，不同组合的果胶和果胶酶之间的反应结果。
结果证实多聚半乳糖醛酸酶，果胶裂合酶和果胶酸裂合酶都显示出预期的反应模式。多聚半乳糖醛酸酶和果胶酸裂合酶仅与3％DE果胶反应，而果胶裂合酶仅与77％DE果胶反应。
在室温下，pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和2mMCaCl2)中将多聚半乳糖醛酸酶分别与70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE经标记的果胶保温75分钟即可进行多聚半乳糖醛酸酶水解反应。
在室温下，pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和2mMCaCl2)中将果胶裂合酶分别与70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE经标记的果胶保温180分钟即可进行果胶裂合酶水解反应。
在室温下，pH10.0甘氨酸缓冲液(50mM甘氨酸，100mMNaCl和2mM CaCl2)中将果胶酸裂合酶分别与70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE经标记的果胶保温75分钟即可进行果胶酸裂合酶水解反应。
通过荧光偏振也可检测由克隆的大肠杆菌SJ2转化子表达的果胶酶。从37℃振荡过夜培养的主平板中取出约50μl等分试样，将等分试样混合于含有150μlpH10.0的甘氨酸缓冲液(4mM CaCl2和100mM甘氨酸)的微滴板孔中，所述缓冲液中还含有6.8μg用荧光素标记的3％DE果胶。室温下检测15分钟内因果胶解聚所致的荧光偏振变化，结果示于图7，其中显示了含有表达未被鉴定的果胶酶(方块)的转化大肠杆菌SJ2和未被转化的大肠杆菌SJ2(三角形)的样品的FP检测结果。从图7中还可以看出大肠杆菌SJ2固有的背景值非常低，不会干扰检测。
检测由微滴板孔中存在的大肠杆菌SJ2释放的果胶酶活性的方法适于高物料流通量的基因文库筛选法。表7实施例19通过荧光偏振检测甘露聚糖酶活性
检测甘露聚糖酶活性的方法包括将得自棘孢曲霉的甘露聚糖酶与经荧光素标记的得自Locus豆胶的半乳甘露聚糖(0.8％)一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因甘露聚糖酶活性所致的解聚作用而使经标记的半乳甘露聚糖荧光偏振降低。表8
表8所示的结果阐明相对于未加入甘露聚糖酶的反应而言，加入1μl甘露聚糖酶可使经标记的半乳甘露聚糖解聚，从而使荧光偏振降低。于40℃，在pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和1mMCaCl2)中将甘露聚糖酶与35μg/ml经标记的半乳甘露聚糖一起保温2小时即可进行解聚反应。反应体积为250μl，FP检测在室温下进行。实施例20通过荧光偏振检测鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性
检测鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的方法包括将得自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶与经荧光素标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(0.1％)一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性所致的解聚作用而使经标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖荧光偏振降低。表9
表9所示的结果阐明相对于未加入鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶的反应而言，加入1μl鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶可使经标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖解聚，从而使荧光偏振降低。于40℃，在pH5.0柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸钠和1mMCaCl2)中将鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶与50μg/ml经标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖一起保温2小时即可进行解聚反应。反应体积为250μl，FP检测在室温下进行。实施例21利用经荧光素标记的直链淀粉为底物通过荧光偏振检测淀粉酶活性
利用荧光标记的直链淀粉检测淀粉酶活性的方法包括将C.thermosulfurogenes β-淀粉酶或Novamyl淀粉酶与经荧光素标记的直链淀粉(0.7％)一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使经标记的直链淀粉荧光偏振降低。表10
表10所示的结果阐明相对于未加入淀粉酶的反应而言，加入1μlβ-淀粉酶或1μl Novamyl可使经标记的直链淀粉解聚，从而使荧光偏振降低。于42℃，在pH6缓冲液(50mM MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)和1mM CaCl2)中将淀粉酶与约10μg/ml经标记的直链淀粉一起保温2小时即可进行解聚反应。反应体积为250μl，FP检测在42℃下进行。实施例22利用经荧光素标记的支链淀粉为底物通过荧光偏振检测淀粉酶活性
利用荧光标记的支链淀粉检测淀粉酶活性的方法包括将C.thermosulfurogenes β-淀粉酶或Novamyl淀粉酶与经荧光素标记的支链淀粉(0.4％)一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使经标记的支链淀粉荧光偏振降低。表11
表11所示的结果阐明相对于未加入淀粉酶的反应而言，加入1μlβ-淀粉酶或1μl Novamyl可使经标记的支链淀粉解聚，从而使荧光偏振降低。于42℃，在pH6的MES缓冲液(50mM MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)和1mM CaCl2)中将淀粉酶与约10μg/ml经标记的支链淀粉一起保温2小时即可进行解聚反应。反应体积为250μl，FP检测在42℃下进行。实施例23利用经荧光素标记的极限糊精为底物通过荧光偏振检测淀粉酶活性
利用荧光标记的极限糊精(DP15-33)检测淀粉酶活性的方法包括将Termamyl淀粉酶与经荧光素标记的极限糊精一起保温并测定荧光偏振的变化。观察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使经标记的极限糊精荧光偏振降低。表12
表12所示的结果阐明相对于未加入淀粉酶的反应而言，加入1μl Termamyl可使经标记的极限糊精解聚，从而使荧光偏振降低。于50℃，在pH6.5的MES缓冲液(50mM MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)和1mMCaCl2)中将淀粉酶与1mg/ml经标记的极限糊精一起保温24小时即可进行解聚反应。FP检测在室温下进行。实施例24通过荧光偏振检测纤维素酶活性
纤维素酶活性的检测方法包括于40℃，400rpm的振荡速度下，在微滴板中将20μl多种稀释度的Humicola insolens Cel45纤维素酶与200μl底物一起保温1小时，并测定所得荧光偏振的变化。底物是2mg/ml已被荧光素共价标记的经磷酸溶胀的纤维素(PASC)。如表13所示(两次检测)，随着酶浓度的增加，荧光偏振值稳步降低。与纤维素酶保温之后，经荧光素标记的用磷酸溶胀的纤维素的FP值如下所述。使用荧光素为已知标准(35mP)校准仪器。表13实施例25从得自以前被称为迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌菌株(等同于地衣芽孢杆菌CA63,DSM 9552)和芽孢杆菌菌株(等同于B.clausiiNCIMB 10309,DSM 8716)的基因组文库中以高物料流通量筛选编码果胶酶的核苷酸序列
图1图示说明了筛选方法。将小管中的内容物，即被文库转化的大肠杆菌SJ2宿主细胞接种至10mlLB培养基中，37℃保温40分钟。随后，用含有氯霉素(10μg/ml)的冷LB培养基稀释10ml细胞至细胞终浓度为0.5-1个细胞/300μl培养基。
将稀释的转化子及其克隆置于冰上，同时，使用Micro液滴器将300μl/孔的等分试样转移至NUNC微滴板中。筛选一个细菌文库一般需要40-50个微滴板就足够了。将微滴板置于密闭的盒中以防止培养基从孔中蒸发，将密闭的盒放在摇床上，37℃振荡(约175rpm)约70小时。黑色的微滴板中已加入含于支持所需pH值的缓冲液中的150μl34μg/ml经荧光素-5-氨基硫脲标记的甲基化程度不同的果胶溶液和4mM CaCl2(见表14)。随后，使用自动化的移液装置将主平板中吸出50μl转化子/克隆悬浮液等分试样并转移至黑色的检测板中。将检测板置于室温下(黑暗中)放置约150分钟，通过荧光偏振读数仪(FPM-2,Jolley Consulting,IL)进行读数。将荧光偏振值的降低记为阳性命中。根据果胶的来源和甲基化的程度，未反应的果胶的mP值为70-200，而被果胶酶降解的果胶的mP值为60-130。
在不同条件下，在分离步骤中(图1中的第四幅图)用不同数目的转化子或克隆/孔筛选两个不同核苷酸来源的文库。表14显示出筛选果胶酶所用文库的核苷酸来源，所用底物，所得阳性命中的数目。根据Poisson-分布的统计学标准公式将术语克隆/孔计算为-loge(空孔的频率)，而(空孔的频率)=(空孔数)/(孔的总数)。表14还显示出所有果胶底物都表现有阳性命中，随后的序列分析揭示出发现了编码至少两种果胶酸裂合酶(地衣芽孢杆菌和B.clausii)和一种果胶裂合酶(B.clausii)的核苷酸序列。该方法还阐明与B.clausii文库相同，通过将文库移液至具有各种底物的不同微滴板中即可同时筛选多个编码酶的核苷酸序列。表14实施例26命中数作为不同的转化宿主细胞数目/微滴板孔的函数
为了研究命中数作为被接种至每个孔的pSJ1678质粒转化的不同转化子或克隆(图1中的第四幅图)数目的函数，稀释转化子和克隆(图1中的第三幅图)至一定浓度，使转移的300μl等分试样中含有0.5个转化子或克隆/等分试样至8个以上转化子和/或克隆/孔。表15和图2显示出每孔中的转化子和/或克隆数目是果胶酶的重要参数。在表15中，显示了每1000个转化子中阳性命中的数目以及每孔中转化子或克隆的数目。图2以图的形式显示了相同的信息。图2中的菱形表示每1000个筛选的转化子中的命中数。根据孔中的转化子或克隆的分布遵循Poisson分布的假说，转化子/孔表示每孔中转化子或克隆的平均数。因此，可根据标准的统计学公式计算平均数平均数=-loge(空孔数)/(孔的总数)。
在实施例1给定的条件下，用经荧光素标记的3％DE果胶得到地衣芽孢杆菌的结果。该结果对B.clausii和其它％DE果胶同样有效。
不必受理论的限制，现在推测在分离步骤中限制每孔中不同转化宿主细胞的数目之所以重要的原因是不表达能与选定荧光物质反应的生物化合物的克隆对对“阳性命中”克隆可能有生长抑制作用。表15实施例27通过使用经荧光素标记的淀粉从芽孢杆菌种的菌株(DSM12708)的基因组文库中以高物料流通量筛选编码淀粉酶的核苷酸序列
将小管中的内容物，即被克隆至pZEr0-2载体的文库转化的大肠杆菌DH10B宿主细胞接种至2.9升添加有卡那霉素(10μg/ml)的LB培养基中，将接种有文库的LB培养基置于冰上，同时，使用Micro液滴器将300μl/孔的等分试样转移至总共100个NUNC 96孔微滴板中。每孔中平均分布1.5个克隆，总共有约14400个克隆。将微滴板置于密闭的盒中以防止培养基从孔中蒸发，将密闭的盒放在摇床上，37℃振荡(约200rpm)约48小时。
使用自动化的移液装置自主平板吸取50μl转化子/克隆悬浮液等分试样移液至黑色的96孔检测板中。随后，使用Micro液滴器在每孔中加入220μl含有30μg/ml经荧光素标记的淀粉(Sigma)，50mMMES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)pH6,3mMCaCl2和1mMNaCl的溶液，用封口箔(NUNC，丹麦)密封微滴板，将微滴板置于60℃的温箱中放置120分钟。将微滴板冷却至室温约60分钟之后除去封口箔。室温下，通过荧光偏振读数仪(Polarstar,BMG，德国)对微滴板进行读数，将荧光偏振值的降低记为阳性命中。阳性命中被定义为比各个微滴板的平均偏振值减去各个微滴板96个检测结果的标准差的3.5倍这一值还低的偏振值。平均标准差约为2.2mP单位。总共鉴定出10个经证实的阳性命中(表达淀粉酶的克隆)，相当于在1440个被筛选的克隆中有1个命中。对克隆进行DNA测序，结果表明已克隆出至少2个不同的淀粉酶编码基因。实施例28通过使用经荧光素标记的直链淀粉从芽孢杆菌种的菌株(DSM 12709)的基因组文库中以高物料流通量筛选编码淀粉酶的核苷酸序列
将小管中的内容物，即被克隆至pZErO-2载体的文库转化的大肠杆菌DH10B宿主细胞接种至2.9升添加有卡那霉素(10μg/ml)的LB培养基中，将接种有文库的LB培养基置于冰上，同时，使用Micro液滴器将300μl/孔的等分试样转移至总共100个NUNC 96孔微滴板中。每孔中平均分布0.4个克隆，总共有约3840个克隆。将微滴板置于密闭的盒中以防止培养基从孔中蒸发，将密闭的盒放在摇床上，37℃振荡(约200rpm)约48小时。
使用自动化的移液装置将主平板吸取50μl转化子/克隆悬浮液等分试样移液至黑色的96孔检测板中。随后，使用Micro液滴器在每孔中加入220μl含有10μg/ml经荧光素标记的直链淀粉，50mMMES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)pH6和1mMCaCl2的溶液，用封口箔(NUNC，丹麦)密封微滴板，将微滴板置于60℃的温箱中放置120分钟。将微滴板冷却至室温约60分钟之后除去封口箔。室温下，通过荧光偏振读数仪(Polarstar，BMG，德国)对微滴板进行读数，将荧光偏振值的降低记为阳性命中。阳性命中被定义为比各个微滴板的平均偏振值减去各个微滴板96个检测结果的标准差的3.5倍这一值还低的偏振值。平均标准差约为5.6mP单位。总共鉴定出3个经证实的阳性命中(表达淀粉酶的克隆)，相当于在1280个被筛选的克隆中有1个命中。实施例29通过使用经荧光素标记的PASC从芽孢杆菌种的菌株(DSM12682)的基因组文库中以高物料流通量筛选编码纤维素酶的核苷酸序列
实施例24的检测方法也可用于检测枯草芽孢杆菌克隆DSM12682的纤维素酶活性。DSM 12682是缺失了apr，npr，amyE和celA基因，并被pUB110载体转化的枯草芽孢杆菌168，其中所述载体中含有与地衣芽孢杆菌之amyL信号肽融合的B.agaradhaerens Ce15a基因(GenBank AF067428)和amyL启动子。于37℃，在TY培养基中以250rpm的振荡速度将DSM12682保温过夜。在实施例24所述的条件下，将20μlDSM12682上清液与200μl底物保温。记录到荧光偏振值为129mP，而无质粒的对照菌株的荧光偏振值为214mP。该实验表明检测混合物中细胞的存在不会妨碍检测的质量。实施例30通过荧光偏振筛选野生型分离物的酶活性
在90℃，pH9的条件下检测两个野生型分离物芽孢杆菌种(DSM12663)和芽孢杆菌种(DSM 12664)的果胶酶活性。于30℃在BP-X培养基(pH9.7)中将分离物培养5天。当培养物充分生长之后，将50μl培养物与250μl预热的检测缓冲液(35μg/ml经荧光素标记的果胶DE3％，50mM Bicine pH9(N,N-双[2-羟基乙基]甘氨酸)和3mM CaCl2)混合。在保温至90℃的Eppendorf管中进行检测达2小时。随后冷却检测混合物，将其转移至黑色的微滴板中，通过荧光偏振读数仪(Polarstar,BMG，德国)对微滴板进行读数。2个野生型分离物的荧光偏振分析结果示于表16。表16
从表16可以看出，芽孢杆菌(DSM12663)分离物的荧光偏振值比芽孢杆菌(DSM12664)分离物和不含细胞的生长培养基的荧光偏振值低。由于构建了系统发生相关种(很可能是相同的种)的染色体文库并从中筛选出了编码果胶酶活性的核苷酸序列的存在，因此，芽孢杆菌(DSM12663)很可能就编码果胶酶。分离了编码果胶酶的核苷酸序列，显示出以后可克隆到通过荧光偏振在野生型分离物中检测到的酶活性。参考文献Ausubel,F.M.等.(编)分子生物学最新方法，John Wiley和Sons,1995.Christgau,S.,Kofoed,L.V.,Halkier,T.,Andersen,L.N.,Hockauf,M.,Dorreich,K.,Dalboge,H.,和Kauppinen,S.,得自棘孢曲霉的果胶甲酯酶在酵母中进行表达克隆并鉴定重组酶，生物化学杂志，319,pp 705-712,1996.Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Redegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjoholm,C.,″克隆编码α-乙酰乳酸脱羧酶(短芽孢杆菌的胞外酶)的aldB″,细菌学杂志，172,pp 4315-4321,1990.Dretzen,G.,Bellard,M.,Sassone-Corsi,F.,Chambon,P.,″从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶中回收DNA片断的可靠方法″，分析生物化学，112,pp 295-298,1981.Fry,S.,Smith,R.C.,Renwick,K.F.,Martin,D.J.,Hodge,S.K.,和Matthews,K.J.,″得自植物的木葡聚糖内切转糖基酶，一种新的壁-松解酶活性″，生物化学杂志，282,pp 821-828,1992.Fry,S.,″糖基转移酶和糖基水解酶的新型点-印迹检测法木葡聚糖内切转糖基酶(XET)活性的最优化″，植物杂志，11,pp 1141-1150,1997.Harwood,C.R.,和Cutting,S.M.(编)，“芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Wiley和Sons,1990.Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.,″用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA″，应用微生物学通讯，8,pp 151-156,1989.Sambrook等.，″分子克隆实验室手册″，冷泉港实验室，冷泉港，纽约.(1989)Poulsen L.K.,Refn A.,Molin S和Andersson P.,大肠杆菌毒性Gef蛋白的拓扑分析，分子微生物学，5(7),pp.1627-1637,1991.Eisenstadt E.,Carlton B.C.和Brown B.J.，基因突变，普通和分子细菌学方法，pp.297-316，编辑Gerhardt P.,MurrayR.G.E.,Wood W.A.和Kneg N.R.,ASM,1994.Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,pp.10747-10751,1994.Stemmer，自然，370,pp.389-391,1994.Christiansen L.C.,Schou S.,Nygaard P和Saxild H.H.，枯草芽孢杆菌的黄嘌呤代谢鉴定xpt-pbuX操纵子，参与黄嘌呤补救和分解代谢的基因的受嘌呤和氮控制的表达的证据，细菌学杂志，179(8),pp 2540-2550,1997.Stoss 0.,Mogk A.和Schumann W.，构建单拷贝的枯草芽孢杆菌调节区与编码热稳定的β-半乳糖苷酶的bgaB报道基因之间的翻译融合子所用的整合载体FEMS微生物学通讯，150(1),pp 49-54,1997.Checovich W.,Bolger R.＆Burke T.，荧光偏振-新的细胞和分子生物学工具，自然，375,254-256,1995.Ohuchi,S.等.；使用PCR扩增单个DNA分子和偶联的转录/翻译体外产生蛋白质文库的方法，核酸研究，1998,vol.26.No.19,pp.4339-4346.Simonen M.,Palva I.；芽孢杆菌种的蛋白质分泌；微生物学评论；1993；vol.57；pp.109-137.Gotz F.等；葡萄球菌脂酶，分子鉴定，分泌和加工；1998；vol.93；pp15-25Pugsley A.P.等.；Analysis of the subcellular location ofpullulanase produced by Escherichia coli carrying the pulA genefrom Klebsiella pneumoniae strain UNF5023；分子微生物学；1990；vol.4；pp.59-72.Gerhardt P.等.；普通和分子生物学方法，American Society forMicrobiology；1994；编Gerhardt P.,Murray R.G.E.,Wood W.A.,Krieg N.R.Ellman J.,Mendel D.,Anthony-Cahill S.J.,Noren C.J.和Schultz P.G.，酶学方法，1991；vol.202；pp.301-337.Schulein M.；细菌学杂志；1997；vol.57,pp.71-81.Shen et al.；从Clostridium thermosulphurogenes中纯化和鉴定新的热稳定性β-淀粉酶；生物化学杂志；1988；vol. 254；pp.835-840.Tada S.,Iimura Y.,Gomi K.,Takahashi K.,Hara S.,YoshizawaK.；米曲霉基因组Taka-淀粉酶基因的克隆和核苷酸序列；农业生物化学；1989；vol.53；pp.593-599.Arndt D.J.et al.；通过自动化细胞分离研究细胞分化两个模型系统友好病毒-转化细胞和Hydra attenuata；组织化学和细胞化学杂志；1976；vol.24；no.1；pp.332-347Lindmo T.和Steen H.B.；哺乳动物细胞细胞内荧光的荧光偏振流式细胞计数测定法；生物物理学杂志；1977；vol.18；pp.173-187.
权利要求
1．筛选编码生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括
a)在表达系统中表达该核苷酸序列以产生生物化合物，
b)使生物化合物与能与该生物化合物反应的荧光物质接触以发生反应，
c)测定荧光物质的荧光偏振，和
d)选择荧光偏振发生变化的表达系统。
2．权利要求1的方法，其中表达系统是体外偶联的翻译/转录系统，核苷酸序列是得自核苷酸来源的基因文库。
3．权利要求1的方法，其中表达系统是细胞表达系统。
4．权利要求3的方法，其中细胞是野生型细胞。
5．权利要求3的方法，其中细胞是宿主细胞培养物，其中转化子含有得自核苷酸来源的基因文库。
6．权利要求2或5的方法，其中核苷酸来源是选自细菌细胞，古生物细胞和真核细胞的细胞。
7．权利要求6的方法，其中细菌细胞是芽孢杆菌的种。
8．权利要求6的方法，其中真核细胞选自真菌细胞，人细胞和植物细胞。
9．权利要求5的方法，其中核苷酸来源是通过体内基因改组而修饰的细胞。
10．权利要求5的方法，其中核苷酸来源是选自DNA,RNA,cDNA和人工基因的核苷酸序列体外制品。
11．权利要求10的方法，其中体外制备的核苷酸序列是通过选自基因改组，随机诱变和PCR的技术而制备的。
12．权利要求5的方法，其中宿主细胞选自细菌，古生物和真菌。
13．权利要求12的方法，其中未被转化的宿主细胞不能显著表达所述生物化合物。
14．权利要求13的方法，其中使未被转化的宿主细胞显著表达该生物化合物的核苷酸序列被缺失。
15．权利要求12的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌种的细菌。
16．权利要求15的方法，其中大肠杆菌是大肠杆菌SJ2。
17．权利要求12的方法，其中宿主细胞是ElectroMAX DH10B细胞。
18．权利要求12的方法，其中宿主细胞是芽孢杆菌属内种的细菌。
19．权利要求12的方法，其中真菌是酿酒酵母。
20．权利要求12-19的方法，其中宿主细胞被质粒转化了。
21．权利要求20的方法，其中质粒是pSJ1678或pZEr0-2。
22．权利要求20的方法，其中质粒含有能赋予转化的宿主细胞抗生素抗性的核苷酸序列。
23．权利要求22的方法，其中转化的宿主细胞对选自下列的抗生素具有抗性氯霉素，四环素，卡那霉素，氨苄青霉素，红霉素和zeocin。
24．上述任一权利要求的方法，其中所述生物化合物选自蛋白质，多肽和肽。
25．权利要求24的方法，其中生物化合物是酶。
26．权利要求25的方法，其中酶选自氧化还原酶(EC 1.-.-.-)，转移酶(EC 2.-.-.-)，水解酶(EC 3.-.-.-)，裂合酶(EC 4.-.-.-)，异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
27．权利要求26的方法，其中水解酶选自内肽酶，外肽酶，羧肽酶，氨肽酶，内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，脂肪酶和酯酶。
28．权利要求24的方法，其中生物化合物对人或动物体具有医疗作用。
29．权利要求28的方法，其中生物化合物作用于人或动物体中包含的受体。
30．权利要求29的方法，其中生物化合物是激素。
31．上述任一权利要求的方法，其中荧光物质是被荧光标记物标记的有机分子。
32．权利要求31的方法，其中有机分子是多聚体，寡聚体或单体。
33．权利要求31的方法，其中荧光标记物标记了有机分子上0.01-10％可供结合的位点。
34．权利要求31的方法，其中荧光标记物通过共价键、离子键或氢键与有机分子结合。
35．权利要求32的方法，其中有机分子选自蛋白质，肽，糖蛋白，脂蛋白，多糖，寡糖，甘油三酯或核苷酸。
36．权利要求35的方法，其中蛋白质选自酪蛋白，酪蛋白的衍生物，明胶，白蛋白，大豆蛋白，多克隆抗体，单克隆抗体，人受体蛋白或动物受体蛋白。
37．权利要求35的方法，其中肽是尸胺。
38．权利要求35的方法，其中多糖选自淀粉葡聚糖，果胶/多聚半乳糖醛酸，纤维素和半纤维素。
39．权利要求38的方法，其中多糖选自木葡聚糖，木聚糖，阿拉伯葡聚糖和阿拉伯聚糖，PASC，聚半乳糖醛酸，甘露聚糖，直链淀粉，支链淀粉，极限糊精。
40．权利要求31的方法，其中有机分子可得自动物，人，植物或微生物来源。
41．权利要求40的方法，其中有机分子被化学或酶促修饰或纯化。
42．权利要求31的方法，其中有机分子是化学或酶促合成的。
43．权利要求31的方法，其中荧光标记物是芳香族化合物。
44．权利要求31的方法，其中荧光标记物在350-700nm范围内有最大激发。
45．权利要求44的方法，其中荧光标记物在400-600nm范围内有最大激发。
46．权利要求31的方法，其中荧光标记物在400-800nm范围内有最大发射。
47．权利要求46的方法，其中荧光标记物在450-700nm范围内有最大发射。
48．权利要求31的方法，其中荧光标记物与有机分子和其它荧光标记物之间的空间距离为20-50埃。
49．权利要求31的方法，其中荧光标记物的荧光弛豫时间为1-7纳秒。
50．权利要求31的方法，其中荧光物质的偏振值范围为50-500mP。
51．权利要求31的方法，其中荧光标记物选自BODIPY衍生物，荧光素，罗丹明，丹磺酰，德克萨斯红以及花菁染料。
52．权利要求2的方法，包括步骤
a)制备基因文库，
b)将文库的基因片断分开放在不同的容器中，
c)扩增分离的基因片断，
d)体外偶联转录/翻译扩增的基因片断以表达生物化合物，
e)将各个独立容器中的生物化合物或其次生样品与荧光物质接触，
f)将生物化合物与荧光物质一起保温，
g)通过与生物化合物反应以检测荧光物质的FP变化。
53．权利要求3的方法，包括步骤
a)预增殖和稀释含有该核苷酸序列的细胞，
b)将细胞分开放在不同的容器中，
c)增殖分离的细胞以增加各个独立的容器中每个细胞的克隆数目，
d)将各个独立容器中的细胞与荧光物质接触，
e)将细胞与荧光物质一起保温，
f)通过与细胞释放的生物化合物反应以检测荧光物质的FP变化。
54．权利要求53的方法，其中步骤a)将培养物的克隆总数增加了1-5倍。
55．权利要求53的方法，其中步骤b)通过稀释培养物并将每份等分试样含有0.5-10个转化子/克隆的等分试样转移至不同的容器中来进行。
56．权利要求55的方法，其中步骤b)通过稀释培养物并将每份等分试样含有0.5-5个转化子/克隆的等分试样转移至不同的容器中来进行。
57．权利要求56的方法，其中步骤b)通过稀释培养物并将每份等分试样含有0.5-1个转化子/克隆的等分试样转移至不同的容器中来进行。
58．权利要求53的方法，其中步骤b)包括步骤
a)将荧光物质插入细胞，其特征在于通过与细胞内部的生物化合物反应而改变发射光强度，
b)利用FACS仪筛选、选择和分离发射光强度发生变化的细胞。
59．权利要求53的方法，其中步骤c)将各个容器中的克隆数目增加至107-108个克隆/ml。
60．权利要求53的方法，其中通过将细胞与含有荧光物质的溶液混合而使细胞与荧光物质接触。
61．权利要求53的方法，其中细胞是宿主细胞培养物，并且转化子含有得自核苷酸来源的基因文库，步骤a)或c)在能选择性杀死或抑制未被转化的宿主细胞生长的培养基中进行。
62．权利要求61的方法，其中通过使用含有对非克隆宿主细胞而言为有效量的抗生素的培养基来杀死或抑制生长。
63．权利要求53的方法，其中步骤d)包括将细胞与两种或多种荧光物质接触。
64．工业化生产新的生物化合物的方法，所述方法包括
a)根据上述任一权利要求鉴定所述生物化合物和编码该生物化合物的核苷酸序列，
b)培养含有经鉴定的核苷酸序列的微生物，
c)回收生物化合物和任选地配制生物化合物。
65．测定木聚糖酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的木聚糖被木聚糖酶水解之后荧光偏振的变化。
66．测定果胶甲酯酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的甲基化果胶被果胶甲酯酶去甲基化之后荧光偏振的变化。
67．测定阿拉伯聚糖酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的阿拉伯聚糖被阿拉伯聚糖酶水解之后荧光偏振的变化。
68．测定转移酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的物质被转移酶转移至第二化合物之后荧光偏振的变化。
69．权利要求68的方法，其中所述转移酶是转谷氨酰胺酶，所述物质是经荧光标记的肽，所述第二化合物是蛋白质。
70．权利要求68的方法，其中所述转移酶是木葡聚糖内切转糖基酶，所述物质是经荧光标记的寡木葡聚糖，所述第二化合物是木葡聚糖。
71．测定甘露聚糖酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的半乳甘露聚糖被甘露聚糖酶水解之后荧光偏振的变化。
72．测定鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖被鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶水解之后荧光偏振的变化。
73．测定纤维素酶活性的方法，所述方法包括测定经荧光标记的纤维素或纤维素衍生物被纤维素酶水解之后荧光偏振的变化。
74．权利要求65-73的方法，其中在发酵液中测定酶活性。
75．权利要求65-73的方法，其中在经纯化或配制的酶产物中测定酶活性。
76．被荧光团标记的多糖，其含有6-DTAF和选自鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、PASC和半乳甘露聚糖的多糖。
77．被荧光团标记的多糖，其含有荧光素-5-氨基硫脲和选自木葡聚糖、阿拉伯聚糖和果胶的多糖。
78．被荧光团标记的多糖，其含有丽丝胺罗丹明磺酰氯和木聚糖。
全文摘要
筛选编码生物化合物的核苷酸序列的方法,所述方法包括测定与生物化合物反应的荧光物质的荧光偏振,所述生物化合物是由含有该核苷酸序列的表达系统表达的。
文档编号C12P19/04GK1297487SQ9980515
公开日2001年5月30日 申请日期1999年3月5日 优先权日1998年3月6日
发明者L·康斯巴克, K·S·乔根森, J·瓦尔伯乔恩, C·T·乔根森, T·L·胡萨姆, S·厄恩斯特, S·莫勒 申请人:诺沃挪第克公司