一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物技术领域，涉及一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的 方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括剪辑的置换/插入和缺失等形式。 SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析/ 关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆.较常见的单碱基多态性位点的检测 方法包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，三引物等位基因扩增 法(TP-PCR)和测序等方法。这些方法虽各有优点，但也各有其不足之处。
[0003] PCR-RFLP是一种快速，简便，准确的检测SNP基因型的经典方法.其原理是：限制性 内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的 特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的置换，插入和 缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切后产生片段的大小和数目。这些酶 切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶 位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。改方法的优点在于快速简单，终点判 断准确。但其主要缺点在于酶切位点的选择，要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。酶 的选择具有局限性，并不是所有的SNP位点都可以用这种方法来鉴别，且部分内切酶价格昂 贵，实验成本高。三引物等位基因扩增法(TP-PCR)-种不需要限制性内切酶和连接酶的重 组DNA方法。反应体系中有2种模板和3种引物，从而在同一个反应体系中产生一个重组DNA 分子。这种方法的主要优点是快速，不依赖连接片段的限制酶位点。但其缺点是扩增效率 低，扩增特异性差，无法保证PCR产物的特异性和稳定性，分型结果易造成误判。Taqman荧光 探针法是一种新型高效准确的基因分型方法，其优点是检测灵敏度高，分型准确。但该方法 需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高。
[0004] 人同源异型盒（Η0Χ)基因座的反义RNA(H0X antisense intergenic RNA，H0TAIR) 位于人类染色体12ql3.13，长约2.2kb.越来越多的证据表明HOTAIR与原发性乳腺癌的转 移和预后密切相关。HOTAIR可通过募集核心蛋白复合体(Polycomb repressive complex 2，PRC2)连接到同源异型盆位点(homebox D，hoxD)，引起组蛋白H3赖氨酸(27位）甲基化，导 致肿瘤转移相关连接黏附分子2( junctional adhesion molecule 2,JAM2)、人原|丐黏素1 (protocadherin 1，PCDH1)等多个肿瘤抑制基因沉默，促进肿瘤的转移3.
[0005] rs920778位于人HOTAIR的2号内含子上（美国国立卫生研究院国立医学图书馆生 物信息技术中心，http: //www.ncbi .nlm.nih. gov)。通常该多态在人群中存在三种HOTAIR 基因的基因型:CC型（人基因组rs920778多态位点的两个等位基因碱基均为C)，CT型（人基 因组rs920778多态位点的两个等位基因碱基分别为C和T)和TT型（人基因组rs920778多态 位点的两个等位基因碱基均为T)。
[0006] 目前人HOTAIR基因多态rs920778的鉴定长采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人HOTAIR 基因多态rs920778时常使用的限制性内切酶价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可参考 后面的表1)，实验成本高，难以在实验室中普及使用。
[0007] 因此，本领域存在对操作简单，成本低，使用范围广的新型检测SNP方法的需求。本 领域迫切需要在节约实验成本的前提下，通过PCR-RFLP技术的改进，来开发经济、快速的检 测人HOTAIR rs920778基因多态性的试剂盒。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态 性rs920778的方法，通过创造酶切位点法(Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)，应 用引物3'端错配技术，在PCR产物进行酶切电泳后进行基因型的鉴定，从而提供一种操作简 单、成本低、适用范围广泛的检测人HOTAIR多态性rs920778的方法及检测试剂盒。
[0009] 其技术方案如下：
[0010] 一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的方法，包括以下步骤：
[0011] (a)抽提样品的基因组DNA;
[0012] (b)提供扩增人HOTAIR基因多态性rs920778位点附近序列的正向引物和反向引 物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获取扩增产物；
[0013] (c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
[0014] (d)将酶切产物采用3 %的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定Η0 T AIR基因多态性 rs920778的各基因型。
[0015]优选地，所述反向引物其3'末端倒数第一位碱基与多态rs920778碱基相邻，倒数 第二位碱基为错配碱基C，以便在扩增产物中与多态C等位基因形成CCGG结构，第二个碱基C 为多态等位基因，第四个碱基G为错配碱基。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0017] 本发明针对使用CRS-PCR鉴定HOTAIR rs920778多态性，对传统PCR-RFLP法进行改 进，应用了引物3,端错配技术，克服了传统PCR-RFLP法内切酶选择余地小，价格昂贵，实验 成本高等缺点，本发明建立的HOTAIR rs920778多态性的检测方法，内切酶价格十分便宜， 同时PCR产物纯度较高，酶切结果易于分辨。该检测方法通过测序验证，其结果准确可靠。
【附图说明】
[0018] 图1是HOTAIR rs920778位点的电泳图谱；
[0019] 图2是HOTAIR rs920778位点CC基因型测序图谱；
[0020] 图3是HOTAIR rs920778位点CT基因型测序图谱；
[0021] 图4是HOTAIR rs920778位点TT基因型测序图谱。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0023]通过本发明的方法可以通过引物上的错配碱基将SNP附近的序列改变为可被预先 确定的限制性内切酶识别的序列。因此，可以克服传统的PCR-RFLP方法所存在的需要采用 昂贵内切酶的缺陷，进而大大降低了检测SNP的成本。具体而言，由于在该反向引物序列中 倒数第二位碱基为错配碱基C(该碱基在人HOTAIR基因序列中的相应位置为T)，因此错配后 PCR产物中多态附近序列由CCGT或CTGT更改为CCGG或CTGG(其中第二个碱基C/T多态位点， 第四个碱基G为错配碱基）。因此扩增产物中C等位基因片段可被识别CCGG序列的限制性内 切酶识别（即C等位基因片段可被内切酶切开）。进而，可以根据片段切开情况来判断多态基 因型。更具体地，经序列分析可知，基因原始序列中C/T多态可由表1中前三种内切酶识别。 如通过碱基错配PCR将多态性位点后面第二位碱基T改变为G，则该多态为C等位基因经PCR 扩增后包含CCGG序列可被识别CCGG序列的限制性内切酶识别(如MspI，HpaII)，而T等位基 因不能切开。
[0024]经序列分析发现，检测该C/T多态的方法可使用表一中的5种酶，其中表中前三种 酶价格昂贵，且酶切效果不理想。在采用创造酶切位点法（Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)对反向引物序列中倒数第二位碱基错配为C后，PCR产物中多态附近序列生成 CCGG序列，从而可被限制性内切酶MspI，HpaII识别。由于识别特定位点的限制性内切酶 MspI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。因此，综合考虑简单操作 性与经济实用性，限制性内切酶MspI是不二选择。
[0025] 表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制 性内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取(http: //watcut · uwater loo · ca/ template.php?act = snp_new)，以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。
[0026] 表1几种限制性内切酶识别序列及其价格
[0027]
[0028]在本发明的实施方案中，正向引物和反向引物的设计采用Primer6.0软件进行，设 计的原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度以及扩增效率的影响。按照碱基互不配 对的原则设计引物，引物长度一般在15~30碱基之间，过长或短均会造成特异性差，过长还 会导致其延伸温度大于74°C，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40 %~60 %之 间，Tm值最好接近72°C，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身 及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。引物5' 端和中间AG值应该相对较高，而3'端AG值较低。扩增产物的单链不能形成