二级结构。引物 应具有特异性，引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，以确保其与其它基因不具有互 补性。
[0029 ]最终正向引物由选自下列的核苷酸序列构成：
[0030] AAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTAC 〇
[0031] 反向引物由选自下列的核苷酸序列构成:TACAGCTTAAATGTCTGAATGTTCC。
[0032]正向引物和反向引物的设计主要考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度和扩增效 率的影响。通常按照碱基互补配对原则设计引物，引物与模板的序列要紧密互补。引物长度 为15-30bp，过短或过长可导致特异性差，过长亦会导致其延伸温度大于74°C而不利于PCR 反应。反向引物在其3'末端倒数第二位含有错配碱基C，以便在扩增产物中与多态C等位基 因形成CCGG结构，从而可以被MspI内切酶识别。扩增产物总长度为124bp.扩增产物如下： [0033] AAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTACCGCACCAGCCCTCCCCACCCCTGCTGCCTCACTTCTCCTTACCGAGTGTACC GCCTTGTTTTCTGAAGGAAACRGGAACATTCAGACATTTAAGCTGTA
[0034]下划线部分分别为正向引物和反向引物，第99位bp R代表C/T多态即SNP位点 rs920778。第101位bp为错配后的碱基G(原为碱基T)。该长为124bp的扩增产物经限制性内 切酶MspI酶切后可产生124bp，98bp(该片段上游序列相比下游序列由于MspI酶切产生的粘 性末端减少两个单链碱基），26bp(该片段上游序列相比下游序列由于MspI酶切产生的粘性 末端增加两个单链碱基)共三种片段类型。基因型判定结果:CC野生基因型，98bp及26bp两 条带;CT杂合基因型，长为124bp，98bp及26bp三条带;TT杂合基因型，长为124bp-条带。 [0035]凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种 线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却 凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的制备电 泳。聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式:一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰 胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。但综合考虑实用性、便 利性以及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中，引物扩增条件如 图1所示，目的扩增产物使用限制性核酸内切酶MspI5U水浴锅中酶切6-14h。酶切产物采用 3%的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型， 杂合基因型以及突变纯合基因型。
[0036]在本发明的具体实施方案中，本发明检测人HOTAIR基因多态rs9207785的具体步 骤如下：
[0037] (1)提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人 基因组模板。
[0038] (2 )PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序 列的PCR产物。
[0039] (3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶MspI进行酶切反应，得到酶切产物；
[0040] (4)酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带 判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
[0041 ]下面对上述各个主要步骤进行详细描述：（1)引物设计与合成
[0042] 碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定HOTAIR多 态位点碱基变异数据。
[0043] 含HOTAIR rs920778的部分基因序列如下：
[0044] GAAAAGGATCAAGGATCTCAGTTCGGGATCCTTCCTCCCTGAGCCTTCGAGCTGAGCCTGCCCACTGCCCACCGCCA AAGGCTGTCGCGGCGGATACGGGGCTCTTTCGGTCTCGCCGGGCCGGCTGCGGCGCTGCCTTACGCTCCCGGTCTCC CTGTCTCCCTCCATTCTTGCCTCACCCCTCCCCTAGACCAGCAAATATCCAATATATTTGTTTCTCCGCACGCCAGG CCTCAGCGCAGCCAGCTCAGCGCTCGGGGATCGCTGCCCCCGCACTGGGCCCTTATGCGCTTTGCTTCCAGTTCCAC CGACTGCAGCATCTTTCTTTGCTAGCTGCCCGGGTAAAACGCTTCTGTCGCACTTTCCTGCTTCTCCCCCTTTCTTT CCGCCTCTGGATCTGAGAAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTACCGCACCAGCCCTCCCCACCCCTGCTGCCTCACTTC TCCTTACCGAGTGTACCGCCTTGTTTTCTGAAGGAAACRGTAACATTCAGACATTTAAGCTGTAAATGAACTTTTCT TTATGACGTTTAATTTTCTCTCCAATTCTTAGGTCCTGCTCCGCTTCGCAGTGGAATGGAACGGATTTAGAAGCCTG CAGTAGGGGAGTGGGGAGTGGAGAGAGGGAGCCCAGAGTTACAGACGGCGGCGAGAGGTACAGAAGACTGGGAGATA GAGAAAAAGAGAGGCGGGGGAAGGGAGGGGGAGGAAGGAGGGAGGGAAGGGTCCCCAGCTGGCGGGGAGCGGAGCCA GAGAGAGAAAAAGAGAGAAAAGTTTCCCGGAGTCTTCATTAGTTGATTTCCCTGTCCGCCGCTTTCCCCGGCCGGCT CACCCCCGGTAAAGGAAGGAGGGGCGTCTTTATTTTTTTAAGGCCCCAAAGAGTCTGATGTTTACAAGACCAGAAAT GCCACGGCCGCGTCCTGGCAGAGAAAAGGCTGAAATGGAGGACCGGCGCCTTCCTTATAAGGTACGATGCTAACTTG
[0045] 基因序列的第501个碱基R代表了 C/T多态，即为rs920778的多态性位点。根据 rs920778的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计出的最有上下游 引物如下；
[0046] 正向引物序列：5' -AAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTAC-3'
[0047] 反向引物序列：5' -TACAGCTTAAATGTCTGAATGTTCC-3'。
[0048]其中反向引物序列中倒数第二位碱基为错配碱基C(该碱基在人HOTAIR基因序列 中的相应位置为T)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由CCGT或CTGT更改为CCGG或CTGG (其中第二个碱基C/T多态位点，第四个碱基G为错配碱基）。因此扩增产物中C等位基因片段 可被识别CCGG序列的限制性内切酶MspI识别（即C等位基因片段可被内切酶切开）。进而，可 以根据片段切开情况来判断多态基因型。
[0049] 按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本领域通用的 方法(如固相合成法），亦可委托生物公司合成并检测正向和反向引物。
[0050] (2)制备PCR扩增体系：2XTaq PCR Mix 7.5μ1，双蒸水5.9μ1，上游引物0.3μ1下游 引物0.3μ1以及模板DNA1. ΟμL，充分混匀后即得15. OylPCR扩增反应体系；按照第一阶段:94 。(:变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94 °C变性30s，57.6 °C退火45s，最后 72°C延伸45s，第三阶段:72°C延伸5min，最终4°C储存以备用，即得长为124bp的PCR扩增产 物。扩增后的产物序列为：
[0051] AAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTACCGCACCAGCCCTCCCCACCCCTGCTGCCTCACTTCTCCTTACCGAGTGTACC GCCTTGTTTTCTGAAGGAAACRGGAACATTCAGACATTTAAGCTGTA
[0052]下划线部分分别为正向引物和反向引物，第99位bp R代表C/T多态即SNP位点 rs920778。第101位bp为错配后的碱基G(原为碱基T)。
[0053] (3)酶切体系:PCR反应产物5μ1，限制性内切酶0.5μ1，Buf f er 1. ΟμL以及无核酸酶 纯水8.5μ1共计15μ1酶切体系，于水浴锅中37°C酶切6-14h，即得酶切产物。综合考虑经济实 用性以及简单操作性最终选择MspI进行酶切鉴定。
[0054] (4)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性:将酶切产物用3 %的琼脂糖凝胶在4-10V/ cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因 型，rs920778位点不同基因型展现出不同的条带（见图1)，CC野生基因型，98bp及26bp两条 带；CT杂合基因型，长为124bp，98bp及26bp三条带；TT杂合基因型，长为124bp-条带。各基 因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图2-4)显示与现有技术测得的结果完全相同。
[0055] 实施例1.人外周血全血标本测定人HOTAIR rs920778多态性
[0056] 1材料与方法
[0057] 1.1主要仪器与试剂
[0058] 仪