一种基于AllGlo探针的VKORC1基因多态性检测分型试剂盒及其分型方法【
技术领域：
】[0001]本发明设及单核巧酸多态性(SNP)，尤其是设及一种基于AllGlo探针的VK0RC1基因多态性检测分型试剂盒及其分型方法。【
背景技术：
】[0002]单核巧酸多态性（singlenucleotidepolymor曲ism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。作为第Ξ代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、药物的设计和测试W及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。[0003]个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的祀点定位于某个基因，甚至是单个核巧酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可W通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据运一特点选择治疗效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。[0004]SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。[0005]目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术(RFLP)、化gman巧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨烙解曲线分析法化RM)等。其中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪W及电泳仪器即可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman巧光探针法准确度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难W实现高通量、自动化;高分辨烙解曲线分析法化IM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不足，仪器选择少。[0006]AllGlo探针作为新一代的巧光探针，在具备化qMan-MGB探针优点的基础上，大大提高信噪比，减少背景巧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测瘤疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变巧611邑，2.1.￥11,乂.￥.1^11,2.]\1.66]1邑，0.￥.211日]1邑，1^.化6]1,5.]\1?日口1(1detectionofthehepatitisBvirusYMDDmutantusingAllGlo?probes[J].ClinChimActa,2011,412(11-12):1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wu，D.S.aienJ.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.TheestablishmentandevaluationofdiagnosticaccuracyofAllGlo(TM)probe-basedtechniquesforinvasiveaspergillosis[J].ZhonghuaNeiKeZaZhi,2010,49(2):142-145)〇[0007]华法林是一类抗维生素K类口服抗凝药，临床上被广泛用于深静脉血栓形成、肺栓塞、房颤等抗凝治疗，其作用机制是通过抑制维生素K氧化还原酶复合体1(VK0RC1)起作用。临床用药过程中发现，不同个体间华法林的有效治疗剂量存在很大的差异，尤其是中国人的常用剂量明显低于西方人。VK0RC1(-1639A/G)是位于VK0RC1基因启动子区的一个多态性位点，能改变VK0RC1的转录因子结合位点，导致更低的蛋白表达水平(RiederMJ，ReinerAP,GageBF,化ckersonDA,E；byCS,etal.(2005化ffectofVKORClhaplotypesontranscriptionalregulationandwarfarindose.NEnglJMed352:2285-2293)。许多研究发现该SNP位点是华法林有效剂量差异的重要遗传因素，能够解释25%-30%的个体间药物剂量差异（TakeuchiF,McGinnisR,BourgeoisS,BarnesC,ErikssonN,etal.(2009)Agenome-wideassociationstudyconfirmsVKORCl,CYP2C9,andCYP4F2asprincipalgeneticdeterminantsofwarfarindose.PLoSGenet5:e1000433；CooperGM,JohnsonJA,LangaeeTY,FengH,StanawayIB,etal.(2008)Agenome-widescanforcommongeneticvariantswithalargeinfluenceonwarfarinmaintenancedose.Blood112:1022-1027)。在2007年及2010年，美国食品药物管理委员会和美国药物评价研究中屯、曾建议使用华法林治疗前要进行VK0RCU-1639A/G)的检测分型（FinkelmanBS,GageBF,JohnsonJA,BrensingerCM,KimmelSE(2011)Geneticwarfarindosing:tablesversusalgorithms.JAmCollCardiol575:612-8)。用药前对患者进行VKORCl(-1639A/G)的检测分型，能够为患者提供合适的治疗剂量，避免给药剂量不足或过度用药，为临床治疗用药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，VK0RCU-1639A/G)与华法林个体剂量差异的紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方法来满足精准医学的发展。【
发明内容】[0008]本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷及VKORCl基因的单核巧酸多态性位点VK0RCU-1639A/G)，提供基于AllGlo探针的VKORCl基因多态性检测分型试剂盒。[0009]本发明的目的之二在于针对VKORCl基因的单核巧酸多态性位点VKORCl(-1639A/G)提供基于AllGlo探针的VKORCl基因多态性分型方法。[0010]所述基于AllGlo探针的VKORCl基因多态性检测分型试剂盒，包括实时巧光定量PC时式剂、阳性对照及阴性对照；[ocm]所述VK0RCU-1639A/G)为美国国家生物技术信息中屯、(NCBI)所提供人16号染色体VKORCl基因中的SNP位点。[001^所述实时巧光定量PCR试剂包括W下组份：10XTaq缓冲液、10mmol的MgCl2、加/μL的TaqHotstadDNA聚合酶、10mmoldNTPs混合液、50XLOWROXaOOmL无核酶水、10μmol/LVK0RCU-1639A/G)的特异正向引物、10皿ol/LVK0RCU-1639A/G)的特异反向引物和AllGlo探针；lOXTaq缓冲液包括100mmolTris-HCl和500mmolKC1。[OOU]所述VKORCl(-1639A/G)的特异正向引物的核巧酸序列为：[0014]沈QIDNO.1:5'-AAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAG-3';[001引所述VKORCl(-1639A/G)的特异反向引物的核巧酸序列为：[0016]沈QIDN0.2:5'-CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGTA-3'。[0017]所述A1IGlo探针为VKORCl(-1639A/G)的特异探针，其核巧酸序列为：[001引SEQIDN0.3：VK0RC1(-1639A/G)-T:MAR-CGCACCTGGCC-MAR；[0019]SEQIDN0.4：VK0RCl(-1639A/G)-C:JUP-CGCACCCGGCC-JUP〇[0020]所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述阳性纯合对照品1为VK0RC1(-1639A/G)分型为TT的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为VK0RCU-1639A/G)分型为CC的DNA样品，所述阳性杂合对照品为VK0RCU-1639A/G)分型为CT的DNA样品。[0021]所述阴性对照为ImL的无核酶水。[0022]所述基于AllGlo探针的VK0RC1基因多态性分型方法，其步骤如下：[0023]1)采用常规方法提取邸TA抗凝全血样本中的DNA;[0024]2)采用所述基于AllGlo探针的VK0RC1基因多态性检测分型试剂盒提供的实时巧光定量PCR试剂将DNA进行实时巧光定量PCR扩增；[0025]3)根据检测到的巧光信号对人VK0RC1基因单核巧酸多态性位点VK0RCU-1639A/G)进行分型。[00%]所述AllGlo探针可采用美国AlleLogicBiosciencesCo巧oration公司的巧光定量探针，它拥有普通化qman，化qman-MGB及分子信标(molecularbeacon)探针所有优点，克服了目前运几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端泽灭基团的限审ij，利用了美国AlleLogicBiosciencesCorporation公司研制的几种常见波长的特制巧光染料，标记在寡核巧酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可W提高Tm值(退火溫度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高巧光增量。[0027]所述AllGlo探针具有W下优势：①提高Tm值(可达10°CW上），探针更短可W达到15~16个碱基，可W适用A，T含量比较高的序列设计探针;②加大了多重巧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是泽灭基团，打破传统化qman探针因波长原因标记选择困难，不受泽灭基团波长限制；③大大提当前第1页1 2