基于AllGlo探针的CYP2C9*3检测分型试剂盒及其分型方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及单核巧酸多态性(SNP)，尤其是设及一种基于AllGlo探针的CYP2C9*3 检测分型试剂盒及其分型方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性（single nucleotide polymor曲ism,SNP),主要是指在基因组水 平上由单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。作为第Ξ代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感 性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试W及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
[0003] 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的祀点定位于某个基因，甚 至是单个核巧酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可W通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基 因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据运一特点选择治疗 效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
[0004] SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、化gman巧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨烙解曲线分析法化RM)等。其 中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪W及电泳仪器即 可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman巧光探针法准确 度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位 点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难W实 现高通量、自动化;高分辨烙解曲线分析法化IM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不 足，仪器选择少。
[0006] AllGlo探针作为新一代的巧光探针，在具备化qMan-MGB探针优点的基础上，大大 提高信噪比，减少背景巧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测瘤疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突变巧611邑，2.1.￥11,乂.￥.1^11,2.]\1.66]1邑，0.￥.211日]1邑，1^.化6]1,5.]\1?日口1(1 detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta,2011,412( 11-12) :1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病(Wu，D.S. aienJ.Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 华法林是临床广泛应用的一种抗凝药物，可有效用于人工瓣膜置换术及屯、房颤动 病人的血栓预防。由于其较窄的治疗窗和广泛存在的个体治疗剂量差异，因此维持一个安 全有效的华法林治疗剂量是临床成功治疗的关键。CYP2C9是一种能灭活华法林的酶，研究 发现CYP2C9*3可导致CYP2C9降低80%的酶活性，由此可导致不同个体间的华法林有效治疗 齐。量差异（Takanashi K, Tainaka H,Kobayashi Κ , Yasumori Τ ,Hosakawa Μ,Chiba Κ.CYP2C9Ile359and Leu359variants:enzyme kinetic study with seven substrates . Pharmacogenetics . 2000 ;10(2):95-104)。许多研究已经明确证明，携带 CYP2C9*3等位基因突变位点的病人只需低剂量的华法林就可W维持稳定的治疗效果，因此 在用药前对患者进行CYP2C9*3的检测分型，能够为患者提供合适的治疗剂量，避免给药剂 量不足或过度用药，为临床治疗用药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展 的背景下，CYP2C9*3与华法林个体剂量差异的紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的 SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方法来满足精准医学的发展。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探针的CYP2C9*3检测分型试剂盒。
[0009] 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的CYP2C9*3的检测分型方法。
[0010] 所述基于AllGlo探针CYP2C9*3检测分型试剂盒，包括实时巧光定量PCR试剂、阳性 对照及阴性对照；
[0011] 所述CYP2C9*3为美国国家生物技术信息中屯、(NCBI)所提供人10号染色体CYP2C9 基因中的SNP位点。
[001 ^ 所述实时巧光定量PCR试剂包括W下组份：10 X Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、加 /μ L的Taq Hotstad DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLOW ROXaOOmL无核酶水、10μ mol/L CYP2C9*3的特异正向引物、10ymol/L CYP2C9*3的特异反向引物和AllGlo探针;所述 lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013] 所述CYP2C9*3的特异正向引物的核巧酸序列为：
[0014] SEQ ID NO.1:5'-AGCCACATGCCCTACACAGAT-3';
[0015] 所述CYP2C9*3的特异反向引物的核巧酸序列为：
[0016] 沈Q ID N0.2:5>-GAGAAACAAACTTACCTTGGGAATG-3'。
[0017] 所述A1 IGlo探针为CYP2C9*3的特异探针，其核巧酸序列为：
[001 引 沈Q ID N0.3:CYP2C9*3-A:MAR-CCAGAGATACATTGAC-MAR;
[0019] 沈Q ID N0.4:CYP2C9*3-C:JUP-CCAGAGATACCTTGAC-JUP。
[0020] 所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品；所述 阳性纯合对照品1为CYP2C9*3分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为CYP2C9*3分型 为CC的DNA样品，所述阳性杂合对照品为CYP2C9*3分型为AC的DNA样品。
[0021] 所述阴性对照为ImL的无核酶水。
[0022] 所述基于AllGlo探针CYP2C9*3检测分型方法，其步骤如下：
[0023] 1)采用常规方法提取邸TA抗凝全血样本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探针的CYP2C9*3检测分型试剂盒提供的实时巧光定量PCR 试剂将DM进行实时巧光定量PCR扩增；
[0025] 3)根据检测到的巧光信号对人CYP2C9基因 CYP2C9*3位点进行分型。
[00%] 所述AllGlo探针可采用美国AlleLogic Biosciences Co巧oration公司的巧光定 量探针，它拥有普通化qman，化qman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克 服了目前运几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端泽灭基团的限 审ij，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制巧 光染料，标记在寡核巧酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可W提高Tm 值(退火溫度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团，提高巧光增量。
[0027] 所述AllGlo探针具有W下优势：①提高Tm值(可达10°CW上），探针更短可W达到 15~16个碱基，可W适用A，T含量比较高的序列设计探针;②加大了多重巧光定量的选择， 因为每种染料即是报告基团又是泽灭基团，打破传统化qman探针因波长原因标记选择困 难，不受泽灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的泽灭效 果;④成本较低，价格仅相当于化qman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0028] 本发明采用了 AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分 别标记巧巾特殊巧光基团(MAR、JUP)，并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探 针SNP检测分型方法，应用前景广阔。
[0029] 本发明的有益效果如下：
[0030] 本发明提供了一种基于AllGlo探针的SNP检测分型试剂盒和检测方法，其特异性 和敏感性高，可快速准确进行SNP分型，与现有的常见技术相比具有W下优势：