一种检测cyp2c9*2基因多态性的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种检测CYP2C9*2基因多态性的引物 与方法。
【背景技术】
[0002]目前已发现的CYP2C9等位基因有30种，其中WCYP2C9*1 (野生型）、 CYP2C9*2k. 430OT，Argl44Cys，rsl799853)、CYP2C9*3 (C. 1075A〉C，Ile359Leu， rsl057910)最为常见。
[0003] CYP2C9*2和CYP2C9*3基因频率在不同人种和不同民族之间差异较大，在中国人 群中的等位基因频率远远低于白种人。研究表明，CYP2C9基因突变状态与华法林类药物临 床用药敏感性及毒性关系密切，携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明 显低于野生型，并且其出血的危险性增加2-3倍，CYP2C9*l/*3和CYP2C9*3/*3患者与野生 型患者相比，华法林用药分别要减少33. 7%和78. 1%。
[0004] 中国专利申请201310533548. 8公开了一种用于CYP2C9和VK0RC1基因巧片检测 的特异性引物对和探针，但基因巧片的设计成本高，检测费用昂贵。现有技术缺少一种特异 性好、灵敏度高、可实现CYP2C9基因多态性检测的引物及其方法。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测CYP2C9*2基因多态性 的引物与方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点。本发明检测的位点包括 CYP2C9*2 (430OT，Argl44切S，rsl799853)。
[0006] 本发明提供一种检测CYP2C9*2基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对CYP2C9*2的上游引物5' -CAGCAATGGAAAGAAATGG AAGG-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物 5'-CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG-3'（SEQID NO. 2);所述SNaPshotPCR引物包括；针对CYP2C9*2 的SNaPshotPCR引物 5'-TTTTTTTTTG GAAGAGGAGCATTGAGGAC-3'(SEQIDNO. 3)。
[0007] 采用上述技术方案，本发明提供的检测CYP2C9*2基因多态性的引物，可w实现 CYP2C9*2基因多态性的特异性检测，准确性好。
[0008] 相应地，本发明还提供一种检测CYP2C9*2基因多态性的方法，包括如下步骤；A) 提取DNA样品巧)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯 化；C)采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，对扩增产物 进行纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
[0009] 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[0010] 优选地，述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括；Step1: 98°Cfor3min;Step2: 98°Cfor10s;Step3: 58°Cfor30s;Step4: 72°Cforlmin;Step5:Gotostep2， 29times；Step6: 72°Cfor5min；Step7: 25°Cforever。
[0011] 优选地，所述步骤C)中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括；Step1: 96°C化r 10s;Step2: 55°Cfor日s;Step3: 60°Cfor30s;Step4:Gotostep1,25times; Step5: 4°Cforever。
[0012] 优选地，所述步骤D)中，采用GE肥MAP阳RIDV4. 1软件对检测结果进行分析。
[0013] 此外，本发明还提供检测CYP2C9*2基因多态性的引物在制备检测CYP2C9*2基因 多态性试剂中的用途。
[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测CYP2C9*2基因多 态性的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检 测CYP2C9*2基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshotPCR 引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W为华法林的临床用药提供指导。
【附图说明】
[0015] 图1本发明提供的CYP2C9*2基因引物的扩增片段。
[0016] 图2CYP2C9*2基因引物扩增产物的部分测序图。
[0017] 图3样品的CYP2C9*2基因多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[001引下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[001引实施例一引物 发明人针对CYP2C9*2的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化 和比较，筛选出了特异性好的引物。本发明提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物和 SNaPshotPCR引物，PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。针对CYP2C9*2,上游 引物为 5' -CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3'（SEQIDNO. 1)，下游引物为 5'-CAGTAAGGTCAGTG ATATGGAGTAG-3'（沈QIDNO. 2)，SNaPshotPCR引物为 5'-TTTTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGG AC-3'(SEQIDNO. 3)。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位 点。
[0020]
实施例二引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,结果如下；供2扩增片段位于C虹10:96701959-96702133间，长麼为17化p，结果如图1所示，所有引物的扩增片段均覆 盖了相应的检测位点〇736讲2,无其它同源基因。
[0021] 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，各引物扩增片段与CW义讲2基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对位置及测 序反应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
[0022] 实施例二CYP2C9*2基因多态性的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，将DM样品稀释至l(K)ng/yL，备用。
[002引 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2XMasterMix(购自肥B公司，货号M049化），反应 体系如表2所示，PCR扩增引物的浓度为5pmol/uL。PCR扩增反应条件包括；Step1: 98°C for3min;Step2: 98°Cfor10s;St巧 3: 58°Cfor30s;St巧 4: 72°CforImin; Step5:Gotostep2,29times;Step6: 72°Cfor5min;Step7: 25°Cforever。PCR 扩增结束后，取2. 0yLExoSAP-IT(购自Affymetrix，货号78205)和3. 0yLd地20,混匀，加 入PCR扩增产物2.0uL，混匀微离屯、；在PCR仪中进行酶切反应，程序；37°C，15min;80°C， 15min;4°C，保温。
[0024]
采用SNaPshot?MultiplexKit(购自ABI公司，货号4323151)进行扩增，反应体系如 表3所示，SNaPshotPCR引物的浓度为5pmol/uL。SNaPshotPCR反应条件包括；Step1: 96°Cfor10s;Step2: 55°Cfor日s;Step3: 60°Cfor30s;Step4:Gotostep1,25 times；Step5: 4°Cforever。
[00 巧]
在SNaPshotPCR产物中加入1. 0yLSAP酶，按照W下程序进行反应；37 °C， 60min;75°C，15min;4°C，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用 GE肥MAP阳RIDV4. 1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。
[0026] 实施例S检测CYP2C9*2基因多态性的方法的特异性 本检测方法的特异性定义为阴性符合率。CYP2C9*2 430C/C基因型占绝大部分，CYP2C9*2 430C/T基因型占很小部分，因此，本检测将CYP2C9*2 430C/C基因型的检出定 义为阴性结果。
[0027] 采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品进行检测，同时采用Sanger测序法进 行验证。SNaPshot测序法检测出无突变（阴性）的样品共17例，与Sanger测序法显示的 结果相符，如表4所示。本检测方法的特异性为100%。
[0028]
实施例四检测CYP2C9*2基因多态性的方法的灵敏度 本检测方法的灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot法对18例样品 进行检测，同时采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出突变（阳性）的样品 共1例，与Sanger测序法结果相符，如表5所示。本检测方法的灵敏度高。
[0029]
实施例五检测CYP2C9*2基因多态性的方法的准确度 本检测方法的准确度定义为不同方法检测结果的一致性。18例样品经SNaPshot法和Sanger测序法，不同方法检测结果一致，如表6所示。本检测方法的准确度为100%。
[0030]
实施例六检测CYP2C9*2基因多态性的方法的精密度 本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了 人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表7所示，所有结果均 显示一致，本检测精密度为100%。
[0031]
因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决 了CYP2C9*2进行准确分型鉴定问题，发挥PCR-SNaPshotPCR对所述基因位点基因分型结 果精确、高通量操作的特点，可W对华法林的个体化用药起到很大的指导作用，减少华法林 的不良反应。
[0032]W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于该些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种检测CYP2C9*2基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物 和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对CYP2C9*2的上游引物5' -CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3，和下游引物 5' -CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG-3' ；所述 SNaPshot PCR 引物包括：针对 CYP2C9*2 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TITITITITGGAAGAGGAGC ATTGAGGAC-3'。2. -种检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：A)提取DNA样 品；B)采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C)采用 权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D) 毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。3. 根据权利要求2所述的检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤A) 中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。4. 根据权利要求2所述的检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤B) 中的PCR扩增反应条件包括：阶段I :98°C 3min ;阶段2 :98°C IOs ;阶段3 :58°C 30s ;阶段 4:721：11^11;阶段5:返回到阶段2,29个循环；阶段6 :721：51^11;阶段7:251：保温。5. 根据权利要求2所述的检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤C) 中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段I :96°C IOs ;阶段2 :55°C 5s ;阶段3 :60°C 30s ;阶段4 :返回到阶段1，25个循环；阶段5 :4°C保温。6. 根据权利要求2所述的检测CYP2C9*2基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤D) 中，采用GENEMAPPERID V4. 1软件对检测结果进行分析。7. 根据权利要求1所述的检测CYP2C9*2基因多态性的引物在制备检测CYP2C9*2基因 多态性试剂中的用途。
【专利摘要】本发明提供一种检测CYP2C9*2基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现CYP2C9*2基因多态性的特异性检测，准确性好。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104988145
【申请号】CN201510384305
【发明人】赵薇薇, 胡昌明, 燕启江, 郭周萍
【申请人】广州金域医学检验中心有限公司, 广州医科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月30日