BRCA2基因g.32912799T＞C突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用
【专利说明】BRCA2基因g.32912799T>C突变及其在乳腺癌辅助诊断 中的应用 发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，设及BRCA2基因g. 32912799T乂突变及其 在乳腺癌辅助诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤。据世界卫生组织国际癌症研究中屯、统计， 2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性恶性肿瘤发病的25%。同时乳腺癌 是全球第五位常见的恶性肿瘤死亡原因，居女性恶性肿瘤死亡原因之首，全球共52万人因 乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14. 7%。
[0003] 中国的女性乳腺癌的发病率也日趋上升，对妇女的健康造成了很大的威胁。
[0004] 乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，5-10%的乳腺癌是因为携带高外显率的 乳腺癌易感基因突变所致。BRCA1，BRCA2,TP53,PALB2,PTEN，C肥K2,ATM，RAD50等被认定 为乳腺癌易感基因，携带该些基因胚系突变的乳腺癌被称为遗传性乳腺癌。
[0005] 突变位点的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，W及对于环境暴露、药物治 疗等因素的不同反应性，因此突变位点可能是导致个体对常见疾病发病易感性差异的重要 遗传基础。将疾病的突变位点谱用于疾病的辅助诊断，具有广阔的应用前景。近年来，利用 突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤、先天性疾 病和屯、脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。
[0006] 携带BRCA2功能性突变的个体极有可能发展为乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史 携带者。针对突变携带者采取一系列的预防措施，例如较早的进入乳腺癌筛查，并提高筛 查频率，W及预防性手术的实施将早期发现乳腺癌而取得较好的干预和治疗效果。中国的 BRCA2基因检测起步较晚，尽管有几项相关的研究，但是尚未发现足够量的突变"热点"，尤 其是中国人群特异的乳腺癌相关突变。并且由于种族差异，欧美国家的突变谱也不完全适 用于中国人群，若能筛选出乳腺癌发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊 断试剂盒，对我国乳腺癌筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种具有新的突变位点的BRCA2突变基因。
[000引本发明另一个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物。
[0009] 本发明第=个目的是提供上述BRCA2突变基因及特异性引物在制备乳腺癌辅助 诊断试剂盒中的应用。
[0010] 本发明第四个目的是提供一种乳腺癌辅助诊断试剂盒。
[001U发明人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DM中的 突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的乳腺癌辅 助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。
[0012] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0013] 一种用于乳腺癌辅助诊断的BRCA2突变基因，该突变基因与BRCA2正常基因序列 相比具有g. 32912799T乂位点突变。
[0014] 用于检测上述BRCA2基因的突变位点的特异性测序引物，其上游引物的序列如为 SEQIDNO. 3所示，下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示。
[0015] 用于检测上述BRCA2基因的检测方法，该方法采用Sanger测序方法，使用PCR扩 增引物，对BRCA2基因进行突变检测；其中PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示。
[0016] 上述的BRCA2突变基因在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0017] 上述的引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[001引一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测BRCA2基因是否具有g. 32912799TX：位点突变。
[0019] 所述的试剂盒，该试剂盒含有上述引物（上游引物的序列如为SEQIDNO. 3所示， 下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示），该试剂盒还可化含有PCR技术所需的常用试剂。
[0020] 具体地说
[0021] 采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中， 我们发现有1例患者存在BRCA2基因组第13号染色体的32912799位置发生T碱基到C碱 基的突变；随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳 腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照 人群中，未发现突变个体。因此，该突变对乳腺癌的阳性预测值为100%，人群家族性乳腺癌 患者中发生率为1. 43%，散发性乳腺癌中发生率为0. 27%。为进一步提高该突变致乳腺癌 的可靠性，我们在2004年建立的正常人群队列（排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患 者）中女性7120名（36岁-70岁）检测该突变，发现突变阳性1例（基线时为47岁），随 访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为本研究 首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入前瞻性 队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病 因素。
[0022] W上研究所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为 g. 32912799T〉C(NC_000013. 10)，该突变发生于第13号染色体的32912799位置 (NCBI参考序列GRCh37.pl3)，该基因在NCBI参考数据库GRCh37.pl3中的编号为 NC_000013. 10 (32889617-32973809)，该里列出在该数据库中本突变位点前后l(K)bp的碱 基序列供参考，如56910^:1所示，8贿42基因突变序列对应的序列如56910^:2所示， 其中突变位点为在SEQIDNO: 1序列的第101位由碱基T突变为C碱基。
[002引 沈QIDN0:1
[0024] ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGAT ACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATAITAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGA TCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC [002引 沈Q ID NO:2
[0026] ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGAT ACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATACTAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGA TCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC
[0027] 本发明解决问题的技术方案包括；（1)筛选出人群中BRCA2与乳腺癌发生相关的 新突变，提供位点的突变后碱基序列（2)建立统一标准的标本库和数据库；W标准操作程 序（SCP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。（3)突变筛选 和验证其作用：采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患 者中，我们发现有1例患者存在BRCA2基因的基因组序列中32912799位置T碱基突变为C; 随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族女性乳腺癌患者中，存在 8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的中国汉族正常女性对照人群中， 未发现突变个体。我们在2004年建立的中国汉族正常人群队列（排除任何肿瘤患者，排除 乳腺癌家族史患者）中女性7120名（36岁-70岁）检测该突变，发现突变阳性1例（基线 时为47岁），随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。（3) 对筛选出的突变位点，需要满足在正常人群中无频率。（4)乳腺癌辅助诊断试剂盒的研制： 根据乳腺癌病例所独有的突变位点开发突变位点辅助诊断试剂盒。
[002引本发明人W标准操作程序（SCP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并采用了Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区域进行扫描。
[0029] 具体来说研究的实验方法主要包括W下几个部分：
[0030] 1.研究样本的选择（均为中国汉族）
[0031] (1)经病理学明