确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌病例；
[0032] (2)经病理学明确诊断的散发型乳腺癌病例；
[0033] (3)与病例年龄匹配的健康女性对照；
[0034] (4)社区来源的全人群队列样本。
[00巧]本研究共采用13190例符合标准的样本进行研究。
[0036] 2.酪-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-5化g/y1 DM,纯度（紫外2600D与2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0037] 3.Sanger测序技术筛选突变位点
[00測 （1)取受试者全基因组DNA样本；
[0039] (2)采用Primer 3软件在线设计引物；
[0040] (3)采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描；
[0041] (4)检测并比较各基因型在乳腺癌病例与健康女性对照中的分别差异。
[0042] 4.单个突变位点采用Sanger测序平台进行基因分型
[00创 （1)取受试者DNA样本；
[0044] (2)采用Primer 3软件在线设计引物；
[0045] (3)采用Sanger测序对BRCA2基因突变的外显子编码区进行扫描；
[0046] (4)检测并比较乳腺癌病例与健康女性对照中不同基因型的分布差异。
[0047] 5.诊断试剂盒制备方法
[0048] 采用Sanger测序对BRCA2基因的外显子编码区进行扫描和单个突变位点检测后 确定乳腺癌病例与健康对照中基因型分布差异的突变位点，作为乳腺癌诊断的指标。最后 筛选出的与乳腺癌发病有关的突变位点组成辅助诊断试剂盒（g.32912799I>C)。诊断试剂 可W包括该突变位点的特异性引物W及Taq酶、dNTP等试剂。
[0049] 6.统计分析方法
[0化0] 运用卡方检验（用于分类变量）或者studentt检验（用于连续性变量）比较人 口学特征等在研究对象组间分布的差异。
[0化^ 统计学分析均通过专口的统计学分析软件完成（PLINK1. 07)。统计学显著性水平 P值设为0. 05,所有统计学检验均为双侧检验。
[0052] W下是本发明进一步的说明：
[0化3] 在上述70例有家族史的乳腺癌病例中我们采用Sanger测序对BRCA2基因的外显 子编码区进行扫描得相关结果。
[0化4] 根据Sanger测序检测结果，本发明人检测到在"乳腺癌病例"组中的1名患者存 在g. 32912799T〉C突变。
[0055]根据上述检测结果，我们将该个与乳腺癌发病相关的突变位点在中国汉族无家族 史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变； 在3000例中国汉族无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。 [0化6] 在3000例散发性中国汉族乳腺癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例中 国汉族正常人群中，未发现突变个体。进一步在队列人群中对该突变位点用于乳腺癌诊断 的效果进行评价，发现其能够进行乳腺癌的早期诊断，且在正常人群中无突变个体。
[0057]根据上述实验结果，本发明人发现了一个能用于乳腺癌辅助诊断的突变位点。
[0化引具体而言，该突变位点的碱基序列的改变有助于乳腺癌的辅助诊断，为临床医生 快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支 持。
[0059] 本发明有益效果：
[0060]本发明提供的突变位点序列改变作为乳腺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
[0061] (1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易 于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为乳腺癌 的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0062] (2)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用Sanger测序对BRCA2基因的 外显子编码区进行扫描W获取疾病相关的突变位点谱，并应用Sanger测序方法在大样本 散发型中国汉族乳腺癌患者中进行了验证；W上方法和策略的应用加速和保证了突变位点 生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策 略上的借鉴。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群 中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。通过纳入前瞻 性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致 病因素。
[0063]本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的 应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了乳 腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物；通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂 盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情， 为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物祀标提供帮 助。
【具体实施方式】
[0064]实施例1样品的收集和样品资料的整理
[00化]发明人于2004年开始至2013年从南京医科大学肿瘤中屯、及社区正常人群中收集 了大量的中国汉族女性乳腺癌患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人 从中选择了符合下列标准的样本Sanger测序扫描分型的实验样品：
[0066] 1、病理学明确诊断的具有乳腺癌家族史的乳腺癌患者70例；
[0067] 2、病理学明确诊断的无家族史散发型乳腺癌患者3000例；
[0068] 3、无肿瘤家族史，与病例年龄匹配的健康女性对照3000例；
[0069] 4、社区来源的全人群队列中的女性样本7120例。
[0070] 并系统采集了该些样本的人口学资料和临床资料等情况。
[007U实施例2外周血DM中突变位点的测序扫描
[0072] 在上述70例有家族史的乳腺癌患者和健康对照中，采用Sanger测序检测获得相 关结果，测序过程遵循Sanger测序的标准操作，人工设计Sanger测序引物，引物序列为F:5 N0:4)，引物序列由南京金斯瑞公司合成（详见表1)。
[0073] 具体步骤为；
[0074] 1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂（即裂解液，40份量配置方法如 下；庶糖219. 72g、氯化儀2. 02g和曲拉通X-100(amresco0694) 20mr混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），颠倒混匀后完全转入。
[0075] 2、去除红细胞；用溶血试剂将5ml离屯、管补至4ml，颠倒混匀，400化pm离屯、10分 钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，400化pm离屯、10分钟，弃 上清。
[0076] 3、抽提DNA;向沉淀中加1ml抽提液（每300ml中含有122. 5ml0. 2M氯化钢， 14.4ml0.5M己二胺四己酸，15ml10%十二烷基硫酸钢，148. 1ml双蒸水，下同）和8yl蛋 白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37°C水浴过夜。
[0077] 4、去除蛋白质；加1ml饱和酪充分混匀（手轻摇15分钟），40(K)巧m离屯、10分钟， 取上清转入新的5ml离屯、管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液（氯仿：异戊 醇=24 ;1，v/v，下同），充分混匀后（手摇15分钟），400化pm离屯、10分钟，取上清（分入 两个1. 5ml的离屯、管）。
[007引 5、DNA沉淀；在上清液中加入3M的醋酸钢60y1，再加入与上清液等体积的冰无 水己醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再W1200化pm离屯、lOmin。
[0079]6、DNA洗漆；在沉淀中加入冰无水己醇1ml, 1200化pm离屯、lOmin,弃上清后真空 抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
[0080] 7、测量浓度：通常能得到20-50ng/y1DNA，纯度（紫外2600D与2800D比值）在 1. 6-2. 0。
[00川 8、PCR反应体系30微化包括；模板50ng ;引物F ; 1微升和引物R ; 1微升；2 X MIX 15微升；&0补足至30微升。
[008引 9、PCR反应程序；95 °C 5min ; (95 °C 30s ;56 °C 30s ;72 °C 30s) X40个循环； 72°C6min ;4°C保存。
[008引 10、采用ABI3730平台进行Sanger测序；
[0084] 11、使用Chromas2软件进行序列比较和分析。
[0