一种TRβ基因突变检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测试剂盒及检测方法，特别是设及一种ΤΚβ基因突变检测试剂 盒及检测方法，属于生物技术及医学领域。
【背景技术】
[0002] 甲状腺激素抵抗综合征(RTH)是由于甲状腺激素受体(TR)基因突变，导致祀器官 对甲状腺激素(ΤΗ)的敏感性降低，使得ΤΗ对全身组织器官作用障碍的一种综合征。目前认 为该病是一种常染色体显性或隐性遗传性疾病，有家族发病倾向，也有散发病例。根据突变 受体亚型不同，分为TRa基因突变致RTH(RTHa)和ΤΚβ基因突变致RTH(RT邮）。1967年 Ref etoff首次报道RT册，目前全世界共报道3000多RT册病例，RT地是一类罕见的内分泌疾 病，其中80%由T祕基因突变所致，W家族性发病多见，呈常染色体显性或隐性遗传。T祕基 因突变是确诊RT地的金标准。
[0003] RT册临床表现呈高度异质性，主要由于ΤΚβ基因缺陷的严重程度及各祀器官对TH 的依赖性和反应性不同。依据抵抗程度的组织分布，可分为全身型RT册、垂体型RT册。临床 可表现为甲亢（甲状腺高代谢症状）或甲减（乏力、怕冷和记忆力减退等）或无明显甲功异 常，或同时合并甲亢和甲减症状。临床医师易误诊为甲亢，予W抗甲状腺激素药物、放射性 舰治疗或合用kT4治疗，导致疾病症状加重，因此正确诊断很重要。
[0004] 目前临床诊断RT册主要通过kT3抑制实验和TRH兴奋试验，但由于国内不生产k T3和T畑，从国外购买困难，导致该疾病长期W来无法诊断。
[0005] 金婷等W31岁女患为研究对象，该患者W甲状腺肿就诊，伴屯、慌、出汗和月经减 少等甲亢症状；同时有血脂异常等甲减症状。停赛治1个月后甲状腺功能显示FT3和FT4升 高，而T甜不适当升高。心了3抑制试验显示垂体组织和外周组织均存在不同程度的??抵抗。 基因测序发现患者T祕基因出现M442T突变。诊断为全身型RT地(T祕基因 M442T点突变的散 发病例）。2004年Bayer在国际上首次报道一个M442T突变家系，先证者表现为结节性甲状腺 肿和房颤(非屯、脏病因），FT3和FT4升高，TSH正常高限。目前国际上仅1例M442巧良道，国内尚 无该突变位点的报道。T祕的M442T突变导致其T3依赖性转录活性受损，同时突变的T祕干扰 正常T祕的功能，即显性负效作用，运是M442T导致RT地发病的分子机制。
[0006] 综上，建议临床遇到血清FT3和FT4升高，而T甜正常或升高患者，或确诊为甲亢后 抗甲药治疗甲状腺功能一直不能恢复正常的患者，要警惕T祕基因突变，因此临床迫切需要 一种检测效率高，方法简单，结果准确，成本低的T祕基因突变检测试剂盒及检测方法，用W 提高RT地的确诊率。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就在于解决现有技术存在的上述问题，提供一种检测效率高，方法 简单，结果准确，成本低的T祕基因突变检测试剂盒及检测方法，用W提高RT地的确诊率。 [000引本发明给出的技术方案是：一种ΤΚβ基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲 液，酶溶液，10对1-10号外显子特异性扩增引物。
[0009] 所述PCR缓冲液包括0.5mM的MgCl2，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP，dUTP， dGTP，dCTP。
[0010] 所述酶溶液为高保真化q酶和UNG酶。
[0011] 所述10对1-10号外显子特异性扩增引物编号为沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2、SEQ 10側：3和沈910側：4、56910側：5和沈910側：6、56910側：7和沈910側：8、56910 NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0012] 本发明还提供一种T祕基因突变检测方法，包括W下步骤。
[001引（1)制备本发明的T祕基因突变检ii试剂盒。
[0014] (2)提取待测样品，进行PCR反应。
[001引 （3 )PCR产物纯化测序，获得了祕基因突变检测结果。
[0016] 其特征在于，利用T祕基因1-10号外显子特异性扩增引物对待测样品进行点突变 检测，包括。
[0017] 利用所述扩增引物和待测样本建立PCR扩增反应体系和程序，获得PCR产物，纯化 后测序。
[001引所述PCR扩增反应体系如下。
[0019]
[0020] 所述PCR扩增反应程序如下。
[0021]
[0022] 所述PCR产物纯化处理所用试剂可W为市面上任何一款PCR产物纯化试剂。
[0023] 所述PCR产物纯化处理后测序，经过对测序图谱的分析来确定ΤΚβ基因的突变与 否。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果是。
[0025] 本发明Τ祕基因突变检测试剂盒引物通过专业设计和多次筛选，保证了引物特异 性，同时引入UNG酶防污染系统，能够更加准确，稳定地对样品进行监测。本发明的检测试剂 盒及检测方法具有检测效率高，方法简单，结果准确，成本低等特点，因此本发明具有实质 性的技术效果，便与推广。
【附图说明】
[0026] 图1:患者Τ祕基因第10外显子部分测序图。患者Τ祕基因第10外显子的第442位密 码子处存在点突变，密码子由ATG改变为ACG，编码的蛋白质由蛋氨酸变为苏氨酸(Μ442Τ)。 进一步分析其基因测序图，该突变为杂合子突变。患者父母的ΤΚβ基因未发现该突变。
[0027] 图2.对实施例2的患者Τ祕全长外显子1-10进行PCR扩增及测序，Α:患者，Β:患者父 亲，C:患者母亲，D:患者姐姐，测序结果显示，患者第10号外显子的第453位密码子存在点突 变，密码子从CCT突变为ACT,导致其所编码的蛋白质由脯氨酸变为苏氨酸。而患者父母和姐 姐均未发现该突变。
【具体实施方式】
[0028] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加 W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0029] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0030] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0031] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域的常规技术。
[0032] 本发明实施例提供一种ΤΚβ基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，酶溶 液，10对特异性扩增引物，其中10对特异性引物序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2、 569 10側：3和沈9 10顯：4、569 10側：5和沈9 10顯：6、沈9 10側：7和569 10顯：8、 沈Q ID Ν0:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID N0:20〇
[0033] 具体地，所述PCR缓冲液含有0.5mM的MgCb，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP， dUTP，dGTP，dCTP。
[0034] 具体地，所述10对特异性引物序列如表1所示。
[00巧]表1 10对特异性引物序列。
[0036]
[0037]
[003引优选地，本发明TR β基因突变检测特异性引物针对Τ祕基因1-10号外显子设计且 通过多次筛选，保证了引物特异性。
[0039] 优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有化q酶，其为PCR反应所必需，且该酶溶液 还含有UNG酶，在PCR反应中，使用UNG酶可防非特异性PCR扩增污染。
[0040] 本发明还提供一种TR β基因突变检测方法，包括W下步骤（1)制备TR β基因突变 检测试剂盒；（2)取10只PCR管，分别向其中加入步骤（1)中的PCR缓冲液、酶溶液；向所述10 只PCR管中分别加入步骤（1)中的10对特异性引物；（3)提取待测样品DNA，分别加入至所述 10只PCR管中，进行PCR反应。
[0041 ] 具体地，上述步骤(2)中的PCR缓冲液包括1.0-5. OmM的MgCb，1.0-5. OmM的dNTPs， 良P dATP，加 TP，dGTP，dCTP各1.0-5.OmM。
[0042] 优选地，Κ50μ1反应体系为例，向步骤(2)中加入待测样品后得到的混合物中各组 分终浓度及含量如下。
[0043]
[0044]
[0045] 上述体系仅为例证性，在实际应用中可按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中 各组分含量。
[0046] 具体地，在上述50μ1反应体系中，所述各对引物包括步骤（1)中的10对特异性引 物，所述样品为基因组DNA。
[0047] 具体地，在步骤(3)中的PCR反应条件为。
[004引
[0049] 在上述PCR反应后，对结果进行分析，所得结果可分为W下二种。
[0化0] (1)测序结果比对后与野生型一致，无突变。
[0051] (2)测序结果比对后出现突变，如图1所示。
[0化2] 实施例1。
[0053] 制备本发明的Τ祕基因突变检测试剂盒，包括W下步骤：
[0054] 1.引物合成:针对人类Τ地基因1-10号外显子序列设计并合成10对特异性引物，序 列分别为沈Q ID NO:巧Ρ沈Q ID N0:2、SEQ ID Ν0:3和沈Q ID N0:4、SEQ ID Ν0:5和沈Q ID NO:6、SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8、SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO:11和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO:18、沈Q ID NO:19和沈Q ID NO:20。
[0055] 将上述各对引物