具有肠内腐败物质的减少作用的双歧杆菌的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 本申请是国际申请日为2011年7月5日、国际申请号为PCT/肝2011/065350、进入国 家阶段的申请号为201180033393.0、发明名称为"具有肠内腐败物质的减少作用的双歧杆 菌"的PCT申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本申请发明设及肠内细菌的状态的改善方法。更具体地，设及减少肠内细菌导致 的作为腐败气味原因的吗I噪系化合物的有用微生物的挑选和该挑选所得的微生物。
【背景技术】
[0003] 由于饮食生活的混乱、生活的不规则、压力等，具有反复便秘、腹泻，或腹涨、产气 等症状的人不断增多。运些症状被认为受肠内环境所影响，换言之，其原因在于肠内菌群 (群落）中腐败菌成为优势。并且，肠内菌群在厌氧条件下由色氨酸产生吗I噪或其衍生物等 腐败气味成分。对运种肠内菌群与腐败产物的产生的关系进行了大量研究(非专利文献1)。
[0004] 另外，认为吗I噪通过肠内腐败菌而由色氨酸产生、并由肠道吸收后，在肝脏中被代 谢为吗I噪酪，进而与硫酸结合，形成硫酸吗I噪酪。认为对健康人而言硫酸吗I噪酪排泄至尿 中，但对透析患者等而言则成为尿毒症等合并症的病因（非专利文献2)。
[0005] 对于作为肠内有害物质的吗I噪等的除去，例如，专利文献1中使用具有吗I噪减少能 力的嗜热双歧杆菌化'フW'パ夕テ人レ厶/哥一子フ^ク厶）。另外，专利文献2中记载了将 五层龙属植物的提取物或微粉碎物与乳酸菌和/或双歧杆菌并用来改善肠内环境。进而，专 利文献3中记载了利用含有丙酸菌的组合物来促进肠道内的双歧杆菌的生长，防止放出恶 臭气体。另外，还报道了菊糖、低聚糖有助于改善肠内菌群(非专利文献3)。
[0006] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2006-158216 专利文献2:日本特开2007-031345 专利文献3:日本特开2007-186529 非专利文献 非专利文献1:肠内细菌学杂志第19卷169-177页（2005) 非专利文献2:透析会志24卷3号312-316页（1991) 非专利文献3:The Journal of Nutrition 129 口Su卵 1): 1438S-1441S (1999)。
【发明内容】
[0007] 发明要解决的技术问题 已知人的活体内（肠内）生成的腐败物质会促进癌症发生、老化，认为只要可积极地减 少活体内的腐败物质，即可有助于人的健康。因此首先，本申请发明中的课题在于，有效利 用安全性高的有用微生物来有效地减少肠内腐败物质。
[0008] 上述腐败物质主要在大肠内生成时，作为大肠内的优势微生物(菌种）的一例，有 乳酸菌、双歧杆菌(双歧杆菌属）。该双歧杆菌自古W来作为在活体内发挥有用功能的微生 物而被用于食品，具有饮食经验的实际成绩。因此，本申请的第1课题在于，由在人的活体内 (肠内）占优势的双歧杆菌中挑选可W有效地减少腐败物质的微生物(菌株）。
[0009] 然而，W往主要是利用体外的体系来寻找减少活体内（肠内）生成的腐败物质的物 质或微生物。由于目前还不能在体外再现肠内菌群，因而对是否能反映实际肠内状况而进 行实验存有疑问。因此，本申请发明的第2课题在于，提供合适的体外和体内的体系来作为 减少在活体内（肠内）生成的腐败物质的物质或微生物的作用效果的验证或寻找体系。
[0010] 进而，本申请发明的第3课题在于，提供对透析患者等具有减少作为合并症病因的 硫酸吗I噪酪在血清中的浓度的效果的微生物。
[0011] 用于解决技术问题的手段 作为安全性高的有用的微生物，本申请发明人基于本申请发明的筛选方法，从乳酸菌 和双歧杆菌中分离有效减少肠内腐败物质的菌株，从而完成了本申请发明。
[0012] 作为减少在活体内（肠内）生成的腐败物质的物质或微生物的作用效果的验证体 系，本申请发明人研究了下述方法:在体外进行筛选之际使用缓冲液再现菌体难W增殖的 条件，评价腐败物质的减少效果(减少能力）。并且，本申请发明人确立了减少肠内细菌产生 的腐败物质的微生物(乳酸菌、双歧杆菌等）的体外挑选方法和/或评价方法，该方法的特征 在于，将反应溶液设定(设计)为乳酸菌、双歧杆菌基本不增殖的条件，并且为减少腐败物质 所需的最低限的能量的葡萄糖量。
[0013] 另外，作为减少在活体内（肠内）生成的腐败物质的物质或微生物的作用效果的验 证体系，本申请发明人研究了在体内进行筛选之际使用小鼠，由血清中测量硫酸吗I噪酪。并 且，本申请发明人确立了降低血清中的硫酸吗I噪酪的产生的微生物(乳酸菌、双歧杆菌等） 的体内挑选方法和/或评价方法，该方法的特征在于，将低聚果糖(F0S)和/或低聚半乳糖 (G0S似及色氨酸α-色氨酸)添加至饲料(粉饲料）中饲养小鼠，评价血清中的硫酸吗I噪酪 的浓度。
[0014] 进而，为了挑选可有效减少腐败物质的微生物(菌株），首先，本申请发明人着眼于 通常在人的活体内（肠内）占优势的双歧杆菌，对短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的 32菌株、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)的92菌株、青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescent。的72菌株的总计196菌株实施筛选，在体外进行评价，预 挑选出9株作为安全性高的有用微生物。接着，为了验证在活体内减少腐败物质的作用、效 果，对于上述挑选的9株实施动物实验，进行体内评价，挑选出吗I噪减少作用强并确认到血 清中的硫酸吗I噪酪的减少作用的短双歧杆菌0LB6129,从而完成了本申请发明。
[0015] 另外，本申请发明中，包含药物和食品，其中含有上述挑选的吗I噪减少作用强、显 示血清中的硫酸吗I噪酪的减少作用的双歧杆菌作为有效成分。
[0016] 本说明书包含作为本申请优选权基础的日本专利申请2010-152962号的说明书 和/或附图中记载的内容。
[0017]发明效果 本申请发明的短双歧杆菌(B. breve)是来源于人的菌株，在该菌株自身不增殖的体系 中，实现了显著减少吗I噪和血清中的硫酸吗I噪酪的优异效果。另外，长期被食用的B. breve 的安全性高，本发明的双歧杆菌0LB6129也可W在食品领域、药品领域广泛适用或应用。
【附图说明】
[0018] [图1]对小鼠给予短双歧杆菌(活菌）引起的对血清中的硫酸吗I噪酪的浓度的影响 [图2]对小鼠给予长双歧杆菌(活菌）引起的对血清中的硫酸吗I噪酪的浓度的影响
[图3]对小鼠口服给予B. breve化B6129(活菌）中的、B. breve化B6129(活菌）的浓 度引起的对血清中的硫酸吗I噪酪的浓度的影响
[图4]在T0S丙酸琼脂培养基中检测到的便中（Fecal)和盲肠内容物（cecal)中的B. breve 0LB6129的菌落数
[图5]对小鼠口服给予B. breve化B6129(活菌）中的、有无添加 F0巧脑的对血清中的 硫酸吗I噪酪的浓度的影响
[图6]在T0S丙酸琼脂培养基中检测到的便中(Fecal)中的B. breve 0LB6129的菌落数 与有无添加 F0S的关系。
【具体实施方式】
[0019] 1.首先 已知人的活体内（肠内）生成的腐败物质会促进癌症发生、老化，认为只要可积极地减 少活体内的腐败物质，即可有助于人的健康。作为主要在大肠内生成的腐败物质，可W列举 苯酪、对甲酪、吗I噪、粪臭素、氨等。运些腐败物质之中，特别是吗I噪、粪臭素等是恶臭成分， 另外还是有可能对健康带来不良影响的成分，因而期望减少吗I噪、粪臭素。
[0020] 作为大肠内的优势微生物(菌种)的一例，有乳酸杆菌、双歧杆菌(双歧杆菌属）。双 歧杆菌自古W来作为在活体内发挥有用功能的微生物而被用于食品。另外，双歧杆菌被认 为具有整肠作用，因而还被用于整肠剂等，也有助于肠内菌群的改善，认为通过改善肠内环 境，对抑制腹泻、防止皮肤粗糖、改善花粉病、免疫力的道教等也有效。
[0021] 2.用于验证、寻找减少肠内腐败物质的微生物的作用效果的评价体系 2-1.减少肠内腐败物质的微生物的体外筛选或预筛选 为了使用微生物，在肠内环境下减少肠内腐败物质(在肠内生成并产生恶臭成分等的 物质），重要的是该特定的微生物在肠内是优先存在的。即，作为运种微生物应具备的性质， 要求对于适应肠内环境的条件的耐性。
[0022] 因此，理想的是适用符合肠内环境中存在的微生物(菌体)的状态(实际情况)的筛 选方法、评价方法。因此，在体外筛选减少肠内腐败物质的物质或微生物时，本申请发明人 首先使用缓冲液来再现微生物难W增殖的条件，研究了肠内腐败物质的减少效果(减少能 力）的评价方法。通过采用上述条件，可W挑选即使微生物不增殖，也能够除去腐败物质的、 在更接近肠内环境的条件下优异的微生物。例如，可设定对象微生物基本不增殖的条 件、并且减少腐败物质所需的最低限的能量那样的条件，来决定反应溶液的成分、浓度。
[0023] 更具体地，对于作为能量源的培养基成分的配合量，例如，使葡萄糖、乳糖、果糖等 的浓度比对象微生物的通常的培养条件低，并且作为可W除去肠内腐败物质的程度，可适 用 0.3 ~0.7(w/v)〇/〇。
[0024] 应予说明，筛选(评价·挑选)方法(体外试验）中，例示了对葡萄糖之类的碳源的反 应溶液的浓度进行研究的结果，但即使是其它成分，也可w同样决定反应溶液的组成、浓 度。
[0025] 2-2.减少肠内腐败物质的微生物的体内筛选 W前，未能实施动物实验由体内充分确认血清中的硫酸吗I噪酪的减少效果。血清中的 硫酸吗I噪酪的减少效果，虽然期待在肠内发挥，但即使将微生物(菌