用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于重组蛋白表达领域，具体设及一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的 培养基及其制备方法，该培养基可提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白成功率和产量。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌表达重组蛋白，是将异源目的蛋白的编码基因克隆插入pET系列等高表 达载体并转入大肠杆菌细胞内，使大肠杆菌经诱导后大量产生所需的目的蛋白。该技术广 泛应用于酶、抗体、疫苗的工业生产，W及科研院校制备科研用重组蛋白。大肠杆菌表达重 组蛋白主要有5种方式：
[0003] (1)胞内表达：目的蛋白翻译后停留于大肠杆菌细胞质内；
[0004] (2)膜定位表达：目的蛋白翻译后经合适的信号肤引导，停留于大肠杆菌内膜上；
[0005] (3)周质分泌表达：目的蛋白翻译后经pelB等信号肤引导，从大肠杆菌细胞质运输 到内外膜之间的周质空间；
[0006] (4)培养基分泌表达:经长时间诱导后，已进入周质空间的目的蛋白可进一步经由 非特异性分泌途径穿过大肠杆菌外膜，释放到周围的培养基液体中；
[0007] (5)包涵体表达：目的蛋白被不正确地折叠，在大肠杆菌细胞质或周质空间中聚集 成不可溶的紧致微粒(包涵体）。
[000引运5种蛋白表达方式中，膜定位表达因表达量较低且难W进行后续纯化，因此实用 价值较低。包涵体表达在大部分情况下导致蛋白质变性并失去其正常功能（失活），虽然在 部分情况下可W通过复性使蛋白质恢复正确构象并恢复部分活性，但复性工作量大且蛋白 活性无法100%恢复。胞内表达、周质空间表达和培养基分泌表达的实用性较高，但面临的 共同困难是目的蛋白可溶性不佳，易在细胞质内或周质空间中聚集，转化为包涵体。虽然可 通过共表达可溶性标签等手段提高目的蛋白的可溶性，但需要切除可溶性标签的额外步 骤。综上所述，在胞内表达、周质空间表达和培养基分泌表达中提高目的蛋白的可溶性是最 常采用的策略。
[0009] 基于上述应用背景，发明人欲提供一种新的培养基，促进大肠杆菌通过信号肤向 周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径进一步释放到 培养基液体中。
【发明内容】
[0010] 本发明所解决的技术问题是提供一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基， 该培养基可促进大肠杆菌通过信号肤向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋 白通过非特异性分泌途径进一步释放到培养基液体中，进而提高大肠杆菌分泌表达重组蛋 白的成功率和产量。
[ocm]本发明培养基中每1000毫升含有:膜蛋白腺12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨 醇60-100克、氯化钢8-16克、D-葡萄糖1-2克、Imol/L Tris-肥1缓冲液(pH7.2)20-100毫升、 加去离子水至1000毫升。
[0012] 优选的，本发明培养基中每1000毫升含有:膜蛋白腺16克、酵母提取物10克、D-山 梨醇100克、氯化钢12克、D-葡萄糖2克、Imol/L化is-HCl缓冲液(pH7.2)100毫升、加去离子 水至1000毫升。
[0013] 本发明培养基的制备方法如下：按照上述比例关系配制培养基，然后按照常规方 法灭菌即可。
[0014] 其中，本发明采用的灭菌方法为:采用高压蒸汽灭菌，即在115°C、0.07MPa压力下 灭菌30分钟。
[0015] 本发明培养基的关键改进在于:添加 D-山梨醇促进周质空间和培养基中重组蛋白 形成氨键，并与较高浓度的氯化钢一起提高溶液渗透压，促进蛋白分泌。添加葡萄糖防止大 肠杆菌利用乳糖导致重组蛋白在诱导开始前发生低水平泄露表达并形成凝聚核。添加 化is-HCl缓冲液，使培养基维持在中性略偏碱性的抑值，进一步提高蛋白表达量并防止包 涵体形成。通过上述关键组分和用量的控制，可W显著提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的 成功率和产量。
[0016] 名词解释：
[0017] 1、本发明所述酵母提取物：国际通用名化ast Ex化act。是根据中华药典之规定采 用W蛋白质含量丰富的酵母为原料，将酵母通过质壁分离后利用自身水解酶系完全自溶， 去除细胞壁和不溶性分子后浓缩干燥为浅黄色粉状纯天然制品。主要成分为多肤、氨基酸、 核巧酸、B族维生素及微量元素。是常用的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料。
[001引2、本发明所述膜蛋白腺：国际通用名Tryptone。又称膜酪蛋白腺（Casein hyptone)、膜酶消化酪蛋白腺(Pancreatic digest of casein),是一种优质蛋白腺，是W 新鲜牛肉和牛骨经膜酶消化，浓缩干燥而成的浅黄色粉末。具有色浅、易溶、透明、无沉淀等 物理性状。可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，W及无菌试验培 养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。
【具体实施方式】
[0019] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明，说明但不限制本发明。
[0020] 重组蛋白表达菌种制备:从LB固体培养基平板上挑取一个新鲜菌落，接入装有本 发明的培养基5-50ml的锥形瓶中，用已灭菌的棉塞、发泡硅胶塞或透气封口膜封口。置于恒 溫摇床中，溫度30-37°C，转速160-22化pm，培养12-1化(过夜）。表达菌种必须在重组蛋白表 达前新鲜准备，制备后立刻进入扩大培养和诱导蛋白表达过程。
[0021] 下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释，目的在于帮助读者更 好地理解本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0022] -、利用重组植酸酶化yM的表达筛选培养基组分
[0023] 1、将膜蛋白腺，酵母提取物，D-山梨醇，氯化钢，D-葡萄糖，Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)，按照表1添加组分，加去离子水至1000毫升。
[0024] 2、试验过程：
[0025] 1)所用重组蛋白表达菌株是已转入环境宏碁因组来源的重组植酸酶PhyM的大肠 杆菌化scherichia coli)BL21(DE3)菌株。发明人于2014年6月11日制备重组蛋白表达菌 种，6月12日开始诱导蛋白表达。
[00%] 2)无菌操作将新制备的过夜菌种按1:200的比例接入本发明的培养基1000ml，在 5000πι1Ξ角瓶中，在37°C、摇床转速18化pm的培养条件下培养约2小时，直到含菌培养基的 600nm光密度值达到0.6。
[0027] 3).重组蛋白诱导表达:加入过滤灭菌的异丙基硫代半乳糖巧（IPTG)至终浓度为 0.2mmo 1 /1，在20°C、摇床转速18化pm的培养条件下继续培养约18小时。
[002引 4)纯化目的蛋白：经过上述18小时的诱导表达过程后，将菌液在1000化pm、4°C的 条件下离屯、10分钟，取上清液。用GE AKTA-pure蛋白层析纯化系统与HisTrap Excel(5ml柱 床