一种百日咳杆菌的无动物源培养基及其培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种百日咳杆菌的无动物源培养基及其培养方法，培养基含有谷氨酸钠、植物蛋白胨、L-脯氨酸、NaCl、KH2PO4g、KCl、MgCl2·6H2O、Tris、L-胱氨酸、烟酸、维生素C、还原型谷胱甘肽、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、β环糊精、或/和琼脂；培养方法包括：菌种开启、传二代培养、传三代培养和发酵罐培养。本发明培养基为无动物源成分、完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应；利用此培养基培养百日咳杆菌的方法具有操作简单、生产方便、取材容易、成本低的优点。
【专利说明】一种百日咳杆菌的无动物源培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种百日咳杆菌的无动物源培养基及其培养 方法。
【背景技术】
[0002] 百日咳是引起全球婴幼儿死亡的一个重要原因。据WHO报道，2008年全球百日咳 发病约1600万例，其中95%发生在发展中国家，约19. 5万儿童因此死亡。在我国，从近几 年的全国法定传染病疫情通报中可看出每年都有2000人左右发病。
[0003] 百日咳是由百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis)通过飞沫从感染者传播给易 感个体引起的。数十年来，通过使用质量可靠的百日咳疫苗对婴幼儿开展免疫接种，在全球 范围内成功预防了婴幼儿中出现严重的百日咳病例。2008年，全球约82%的婴幼儿接种了 3针次百日咳疫苗。WHO报道，2008年全球通过接种百日咳疫苗，避免了约68. 7万例死亡。
[0004] 我国的国家免疫规划中已将无细胞百白破联合疫苗代替了全细胞的百白破疫苗。 传统的全细胞疫苗由于其较严重的副作用和无细胞百白破疫苗快速发展后展现出的巨大 优势而逐渐被停用。无细胞百日咳疫苗（APV)自身具有免疫效果好且副反应小的优点。WHO 推荐的无细胞疫苗包括PT、FHA (丝状血凝素）、PRN、FM2和FM3五种抗原，其中，百日咳 毒素（PT)为APV的主要成分。理想的百日咳疫苗应是由抗原成分明确、具有良好的免疫原 性及保护效果而无毒性作用的百日咳抗原组成。
[0005] 而百日咳疫苗生产厂家一般均采用将百日咳菌种开启到包姜氏培养基（含羊血 成分），再传活性炭培养基（含牛源的酸水解酪蛋白），最后接种SS培养基（或改良的SS 培养基），改良SS培养基可能会含有牛源的酸水解酪蛋白。这些在培养基中加入的动物血 液成分和动物来源的氮源成分均存在潜在的感染动物携带病毒的风险，而且成分复杂，给 疫苗带来不安全的风险。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种百日咳杆菌的无动物源培养 基，该培养基为无动物源成分、完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高 了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应；
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种利用此培养基培养百日咳杆菌的方法，该方法具 有操作简单、生产方便、取材容易、成本低的优点。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种百日咳杆菌的无动物源培养基，所 述培养基为固体培养基或液体培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂 用量为IOOOml的量，含有谷氨酸钠 ：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0? 0· 24g、NaCl :0· 75 ?2. 5g、KH2PO4 :0· 15 ?0· 5g、KCl :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ? 0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、L-胱氨酸：L 2 ?4. 0g、烟酸：0· 12 ?（λ 4g、维生素 C :0· 12 ? 40g、还原型谷胱甘肽：4· 5 ?15g、FeSO4 · 7H20 :0· 3 ?I. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 环糊精：〇?l〇〇g、琼脂：15?20g ;
[0009] 所述培养基为液体培养基，配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量， 含有谷氨酸钠：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0?0. 24g、NaCl :0. 75? 2. 5g、KH2PO4 :0· 15 ?0· 5g、KCl :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ? 6. lg、L-胱氨酸：1. 2?4. 0g、烟酸：0. 12?0. 4g、维生素 C :0. 12?40g、还原型谷胱甘肽： 4. 5 ?15g、FeSO4 · 7H20 :0· 3 ?I. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 环糊精：0 ?100g。
[0010] 进一步地，所述植物蛋白胨为大米蛋白胨、小麦蛋白胨、大豆蛋白胨的一种或多种 的组合。
[0011] 应用上述培养基培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
[0012] SI.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于固体培养基，35°C?37°C培养 48?96小时；
[0013] S2.传二代培养：将步骤Sl开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，起 始OD6c?值为0. 1?0. 4, 35°C?37°C培养20?26小时，为二代菌种菌液；
[0014] S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，起始0D_值为 0. 1?0. 4,35°C?37°C培养20?26小时，为三代菌种菌液；
[0015] S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，通气搅拌培养，培 养温度为35°C?37°C，培养时间为35?45小时，培养至发酵液pH值为7. 2?07. 4, OD6tltl 值为5. 0?10,将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原。
[0016] 进一步地，步骤S4中所述通气搅拌的通气量为10?20L/min，搅拌速度为150? 300rpm〇
[0017] 本发明具有以下优点：本发明的百日咳杆菌培养基作为无动物源成分、采用植物 氮源的培养基，能在菌种传代时进行良好的菌种复苏和扩增培养，产毒亦可达到行业标准， 因此本发明培养基完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安 全性，可以减少疫苗接种的副反应；本发明提供的利用此培养基培养百日咳杆菌的方法具 有操作简单、生产方便、取材容易、成本低的优点。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所 述。
[0019] 实施例1 : 一种百日咳杆菌的无动物源固体培养基，固体培养基的配方包括如 下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有谷氨酸钠：4. lg、大米蛋白胨：3. 0g、NaCl : 0· 75g、KH2PO4 :0· 15g、KCl :0· 06g、MgCl2 ·6Η20 :0· 03g、Tris :0· 45g、L-胱氨酸：1. 2g、烟酸： 0· 12g、维生素 C :0· 12g、还原型谷胱甘肽：4. 5g、FeSO4 · 7H20 :0· 3g、CaCl2 · 2H20 :0· 6g、琼 脂：15g。
[0020] 实施例2 :-种百日咳杆菌的无动物源固体培养基，固体培养基的配方包括如下 组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有谷氨酸钠：10g、小麦蛋白胨：10g、L-脯氨酸 ： 0· 24g、NaCl :2. 5g、KH2P04 :0· 5g、KCl :0· 2g、MgCl2 ·6Η20 :0· 2g、Tris :6. lg、L-胱氨酸：4. 0g、 烟酸：0. 4g、维生素 C :40g、还原型谷胱甘肽：15g、FeS04 · 7H20 :1. 0g、CaCl2 · 2H20 :2. 0g、β 环糊精：100g、琼脂：20g。
[0021] 实施例3 :-种百日咳杆菌的无动物源固体培养基，固体培养基的配方包括如下 组分：相对于溶剂用量为IOOOml的量，含有谷氨酸钠：6g、大豆蛋白胨：4. 2g、大米蛋白胨： 4g、L-脯氨酸：0· 15g、NaCl :1. 4g、KH2PO4 :0· 32g、KCl :0· 14g、MgCl2 · 6H20 :0· lg、Tris : 3. 82g、L-胱氨酸：2. 6g、烟酸：0. 27g、维生素 C :25g、还原型谷胱甘肽：8g、FeSO4 · 7H20 : 0· 6g、CaCl2 · 2H20 :01. 3g、β 环糊精：56g、琼脂：18g。
[0022] 实施例4 :一种百日咳杆菌的无动物源液体培养基，液体培养基的配方包括如下 组分：相对于溶剂用量为IOOOml的量，含有谷氨酸钠：4. lg、小麦蛋白胨：5g、大米蛋白胨： 5g、NaCl :2. 5g、KH2P04 :0· 15g、KCl :0· 2g、MgCl2 ·6Η20 :0· 03g、Tris :6. lg、L-胱氨酸：1. 2g、 烟酸：0. 4g、维生素 C :0. 12g、还原型谷胱甘肽：15g、FeSO4 · 7H20 :0. 3g、CaCl2 · 2H20 :2. 0g。
[0023] 实施例5 :-种百日咳杆菌的无动物源液体培养基，液体培养基的配方包括如下 组分：相对于溶剂用量为IOOOml的量，含有谷氨酸钠：10g、大米蛋白胨：3. 0g、L-脯氨酸： 0· 24g、NaCl :0· 75g、KH2PO4 :0· 5g、KCl :0· 06g、MgCl2 · 6H20 :0· 2g、Tris :0· 45g、L-胱氨酸： 4. 0g、烟酸：0· 12g、维生素 C :40g、还原型谷胱甘肽：4. 5g、FeSO4 · 7H20 :L 0g、CaCl2 · 2H20 : 0. 6g、β 环糊精：100g。
[0024] 实施例6 :-种百日咳杆菌的无动物源液体培养基，液体培养基的配方包括如下 组分：相对于溶剂用量为IOOOml的量，含有谷氨酸钠：8g、植物蛋白胨：6. 2g、L-脯氨酸： 0· 15g、NaCl :2g、KH2PO4 :0· 34g、KCl :0· 12g、MgCl2 · 6H20 :0· 08g、Tris :5. 2g、L-胱氨酸： 3. 6g、烟酸：0. 30g、维生素 C :34g、还原型谷胱甘肽：12g、FeSO4 · 7H20 :0. 7g、CaCl2 · 2H20 : 1. 3g、β 环糊精：80g。
[0025] 实施例7 :-种培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
[0026] SI.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于实施例1制备的固体培养基， 35°C°C培养48小时；
[0027] S2.传二代培养：将步骤Sl开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，液 体培养基为实施例4制备的，起始0D_值为0. 1，35°C培养20小时，为二代菌种菌液；
[0028] S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，液体培养基为 实施例4制备的，起始0D_值为0. 1，35°C培养20小时，为三代菌种菌液；
[0029] S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，液体培养基为实 施例4制备的，通气搅拌培养，培养温度为35°C，培养时间为35小时，培养至发酵液pH值为 7. 2,0D_值为5. 0,将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原，其中，所述通气搅拌的通 气量为l〇L/min，搅拌速度为150rpm。
[0030] 实施例8 :-种培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
[0031] SI.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于实施例2制备的固体培养基， 37°C培养96小时；
[0032] S2.传二代培养：将步骤Sl开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，液 体培养基为实施例5制备的，起始0D_值为0. 4, 37°C培养26小时，为二代菌种菌液；
[0033] S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，液体培养基为 实施例5制备的，起始0D_值为0. 4, 37°C培养26小时，为三代菌种菌液；
[0034] S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，液体培养基为实 施例5制备的，通气搅拌培养，培养温度为37°C，培养时间为45小时，培养至发酵液pH值为 7.4, OD6c?值为10,将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原，其中，所述通气搅拌的通 气量为20L/min，搅拌速度为300rpm。
[0035] 实施例9 :一种培养百日咳杆菌的方法，它包括以下步骤：
[0036] SI.菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于实施例3制备的固体培养基， 36°C培养72小时；
[0037] S2.传二代培养：将步骤Sl开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，液 体培养基为实施例6制备的，起始0D_值为0. 3, 36°C培养24小时，为二代菌种菌液；
[0038] S3.传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，液体培养基为 实施例6制备的，起始0D_值为0. 2, 36°C培养23小时，为三代菌种菌液；
[0039] S4.发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，液体培养基为实 施例6制备的，通气搅拌培养，培养温度为36°C，培养时间为42小时，培养至发酵液pH值为 7. 3,0D_值为8,将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原，其中，所述通气搅拌的通气 量为15L/min，搅拌速度为220rpm。
[0040] 以下通过实验说明本发明的有益效果：
[0041] 本发明培养基与传统培养基培养比较实验
[0042] 1.培养基：本发明固体或液体培养基，对照组为常规包姜氏培养基、活性炭培养 基、SS培养基；
[0043] 2.培养结果：如表1所不：
[0044] 表1 :本发明培养基与传统培养基培养比较结果
[0045]
【权利要求】
1. 一种百日咳杆菌的无动物源培养基，其特征在于，所述培养基为固体培养基或液体 培养基，其中，固体培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量为1000ml的量，含有谷氨 酸钠 ：4. 1 ?10g、植物蛋白胨：3· 0 ?10g、L-脯氨酸：0 ?0· 24g、NaCl :0· 75 ?2. 5g、KH2P04 : 0· 15 ?0· 5g、KC1 :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、L-胱氨 酸：1. 2?4. 0g、烟酸：0· 12?0· 4g、维生素 C :0· 12?40g、还原型谷胱甘肽：4. 5?15g、 FeS04 · 7H20 :0· 3 ?1. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 环糊精：0 ?100g、琼脂：15 ?20g ; 所述培养基为液体培养基，配方包括如下组分：相对于溶剂用量为l〇〇〇ml的量，含有 谷氨酸钠：4. 1?10g、植物蛋白胨：3. 0?10g、L-脯氨酸：0?0. 24g、NaCl :0. 75?2. 5g、 ΚΗ2Ρ04 :0· 15 ?0· 5g、KC1 :0· 06 ?0· 2g、MgCl2 · 6H20 :0· 03 ?0· 2g、Tris :0· 45 ?6. lg、 L_胱氨酸：1. 2?4. 0g、烟酸：0. 12?0. 4g、维生素 C :0. 12?40g、还原型谷胱甘肽：4. 5? 15g、FeS04 · 7H20 :0· 3 ?1. 0g、CaCl2 · 2H20 :0· 6 ?2. 0g、β 环糊精：0 ?100g。
2. 如权利要求1所述的一种百日咳杆菌的无动物源培养基，其特征在于，所述植物蛋 白胨为大米蛋白胨、小麦蛋白胨、大豆蛋白胨的一种或多种的组合。
3. 如权利要求1或2所述的培养基培养百日咳杆菌的方法，其特征在于，它包括以下步 骤：
51. 菌种开启：启开百日咳工作种子批菌种，接种于固体培养基，35°C?37°C培养 48?96小时；
52. 传二代培养：将步骤S1开启的百日咳菌种接种于二代摇瓶液体培养基中，起始 〇D6(?值为0. 1?0. 4, 35°C?37°C培养20?26小时，为二代菌种菌液；
53. 传三代培养：将二代菌种菌液接种于三代摇瓶液体培养基中，起始0D_值为 0. 1?0. 4,35°C?37°C培养20?26小时，为三代菌种菌液；
54. 发酵罐培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，通气搅拌培养，培养温 度为35°C?37°C，培养时间为35?45小时，培养至发酵液pH值为7. 2?7. 4, 0D6(KI值为 5. 0?10,将发酵液下罐，通过分离纯化制备百日咳抗原。
4. 如权利要求3所述的培养百日咳杆菌的方法，其特征在于，步骤S4中所述通气搅拌 的通气量为10?20L/min，搅拌速度为150?300rpm。
【文档编号】C12R1/01GK104263687SQ201410515654
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】陈道远, 朱冲, 陈元芬, 韩炼, 赵丹 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司