大肠杆菌培养基及其培养方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种培养大肠杆菌的培养基及其利用该培养基培养大肠杆菌的方法；该培养基由下列物质组成：葡萄糖0.1g、蛋白胨0.5g、KH2PO4·3H2O0.1g、MgSO4·7H2O0.05g、孟加拉红溶液0.33ml、琼脂1.5～2g、蒸馏水100ml、自然pH2％去氧胆酸钠溶液2ml、链霉素溶液0.33ml。本发明提供一种大肠杆菌的培养基，通过本培养基，能快速对大肠杆菌进行培养，同时优化了微生物发酵培养菌条件，培养工艺简单，获得理想的高活菌浓度。
【专利说明】大肠杆菌培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说是一种培养大肠杆菌的培养基及其利用该培养基培养大肠杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的实验材料。在婴儿刚出生的几小时内，大肠杆菌就经过吞咽在肠道内定居了。正常情况下，大多数大肠杆菌是非常安分守己的，他们不但不会给我们的身体健康带来任何危害，反而还能竞争性抵御致病菌的进攻，同时还能帮助合成维生素K2，与人体是互利共生的关系。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，这些平日里的良民才会兴风作浪，移居到肠道以外的地方，例如胆囊、尿道、膀胱、阑尾等地，造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大肠杆菌通常被看作机会致病菌。
[0003]各种动物大肠杆菌灭活疫苗的制备中，首要环节就是大肠杆菌的培养。为了获得理想的活菌浓度，业界对大肠杆菌培养工艺进行了大量研究。影响大肠杆菌培养菌浓度的因素有很多，如培养基组成、培养时间、菌种接种量以及细菌生长环境等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种培养大肠杆菌的培养基及其利用该培养基培养大肠杆菌的方法。
[0005]为实现上述目的，本 发明采用的技术方案是:一种大肠杆菌培养基，由下列物质组成:葡萄糖 0.lg、蛋白胨 0.5g、ΚΗ2Ρ04.3H20 0.lg、MgS04.7H20 0.05g、孟加拉红溶液0.33ml、琼脂1.5~2g、蒸馏水100ml、自然pH 2 %去氧胆酸钠溶液2ml、链霉素溶液
0.33ml ο
[0006]进一步的:所述链霉素溶液浓度为10000u/ml。
[0007]进一步的:所述培养基pH为7.2~7.6。
[0008]本发明的另一目的是提供一种大肠杆菌的培养方法，包括如下步骤:
(1)一级种子的制备，大肠杆菌菌种分别接种于含0.1%微量盐溶液的培养基中，37°C条件下培养24小时，划线接种琼脂平板上培养，再接种马丁琼脂斜面，37°C条件下培养20~24小时，作为一级种子；
(2)二级种子的制备，将大肠杆菌菌株的一级种子液接种到培养基中，37°C条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3~7°C条件下保存；
(3)将大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1%微量盐溶液的培养基，二级种子液接种量为培养基体积总量的2~3%,菌株种子在37°C条件下于微生物摇床内培养9~11小时。[0009]进一步的，所述摇床转速为120~160转/分钟。
[0010]进一步的，所述摇床转速为150转/分钟。
[0011]本发明的有益技术效果是:本发明提供一种大肠杆菌的培养基，通过本培养基，能快速对大肠杆菌进行培养，同时优化了微生物发酵培养菌条件，培养工艺简单，获得理想的高活菌浓度。
【具体实施方式】
[0012]下面将结合本发明实施，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013]实 施例1
1、准备犬大肠杆菌菌种:犬大肠杆菌EC24菌株；菌株向农业部下属中国兽医药品监察所建立的中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)购买。
[0014]菌种标准:
①形态和生化特性:培养物涂片为革兰氏阴性杆菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。
[0015]②培养特征:接种麦康凯式培养基平板上，37°C培养24小时，肉眼观察呈粉红色，菌落隆起，表面光滑；低倍显微镜下45度折光观察，边缘整齐，呈鲜艳的金光。
[0016]③血清学特性:EC24为078。
[0017]④毒力:犬大肠杆菌EC24毒力测定。取1月龄犬3只，胸部肌肉注射大肠杆菌EC24菌株的普通肉汤菌液0.5ml (含活菌2~5X108CFU)，观察10日，应全部发病。
[0018]⑤免疫原性:各菌株按本发明分别制备单价蜂胶灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取1月龄犬3只，经颈部皮下注射0.5ml，21日后连同条件相同的对照犬3只，分别经胸部肌肉注射一个最小感染剂量(1MID)的对应制苗用强毒菌液0.5ml (含活菌3~4X 108CFU)，观察7日。
[0019]纯粹:按照《中国兽药典》检验，应纯粹。
[0020]2、制备犬大肠杆菌菌株的一级种子液:将犬大肠杆菌菌种分别接种于含0.1%微量盐溶液的培养基(葡萄糖0.lg、蛋白胨0.5g、ΚΗ2Ρ04.3H20 0.lg、MgS04.7H20 0.05g、孟加拉红溶液0.33ml、琼脂1.5g、蒸馏水100ml、自然pH 2 %去氧胆酸钠溶液2ml、浓度为10000u/ml链霉素溶液0.33ml，培养基pH为7.2)中，37°C条件下培养24小时，划线接种麦康凯氏琼脂平板上培养，各菌株选取符合上述“培养特征”标准的典型菌落8个，再分别接种马丁琼脂斜面若干支，37°C条件下培养20小时，作为一级种子；置2°C条件下保存备用(20内用完)。
[0021]3、制备犬大肠杆菌菌株的二级种子液:将犬大肠杆菌菌株的一级种子液接种到上述培养基中，37°C条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置8°C条件下保存(3日内用完)。
[0022]4、将犬大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1%微量盐溶液的上述培养基，其pH值范围为7.2 ;二级种子液接种量为培养基体积总量的2%，菌株种子在37°C条件下于微生物发酵罐内通入新鲜氧气，通气量为3升/分钟，搅拌速度控制为120转/分钟，培养12小时。所得菌液活菌数较高，活菌浓度为4.6X 109 CFU/ml。
[0023]实施例2
1、准备犬大肠杆菌菌种:犬大肠杆菌EC45菌株；菌株向农业部下属中国兽医药品监察所建立的中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)购买。
[0024]菌种标准:
①形态和生化特性:培养物涂片为革兰氏阴性杆菌。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。
[0025]②培养特征:接种麦康凯式培养基平板上，37°C培养24小时，肉眼观察呈粉红色，菌落隆起，表面光滑。低倍显微镜下45度折光观察，边缘整齐，呈鲜艳的金光。
[0026]③血清学特性:EC45为02。
[0027]④毒力:犬大肠杆菌EC45毒力测定。取2月龄犬3只，胸部肌肉注射大肠杆菌EC24菌株的普通肉汤菌液0.5ml (含活菌2~5X108CFU)，观察10日，应全部发病。
[0028]⑤免疫原性:各菌株按本发明分别制备单价蜂胶灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取2月龄犬3只，经颈部皮下注射0.5ml，21日后连同条件相同的对照犬3只，分别经胸部肌肉注射一个最小感染剂量(1 MID)的对应制苗用强毒菌液0.5ml (含活菌3~4X 108CFU)，观察7日。
[0029]纯粹:按照《中国兽药典》检验，应纯粹。
[0030]2、制备犬大肠杆菌菌株的一级种子液:将犬大肠杆菌菌种分别接种于含0.1%微量盐溶液的培养基(葡萄糖0.lg、蛋白胨0.5g、KH2P04.3Η20 0.lg、MgS04.7Η20 0.05g、孟加拉红溶液0.33ml、琼脂2g、蒸馏水100ml、自然pH 2%去氧胆酸钠溶液2ml、浓度为10000u/ml链霉素溶液0.33ml，培养基pH为7.6)中，37°C条件下培养24小时，划线接种麦康凯氏琼脂平板上培养，各菌株选取符合上述“培养特征”标准的典型菌落8个，再分别接种马丁琼脂斜面若干支，37°C条件下培养20小时，作为一级种子，置8°C条件下保存备用(20内用完)。
[0031]3、制备犬大肠杆菌菌株的二级种子液:将犬大肠杆菌菌株的一级种子液接种到上述培养基中，37°C条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置8°C条件下保存(3日内用完)。
[0032]4、将犬大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1%微量盐溶液的上述培养基，其pH值范围为7.6 ;二级种子液接种量为培养基体积总量的2%，菌株种子在37°C条件下于微生物发酵罐内通入新鲜氧气，通气量为3升/分钟，搅拌速度控制为160转/分钟，培养12小时。所得菌液活菌数较高，活菌浓度为4.8X 109 CFU/ml。
[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.大肠杆菌培养基，其特征在于，由下列物质组成:葡萄糖0.lg、蛋白胨0.5g、ΚΗ2Ρ04.3Η20 0.lg、MgS04.7Η20 0.05g、孟加拉红溶液 0.33ml、琼脂 1.5 ~2g、蒸馏水 100ml、自然pH 2%去氧胆酸钠溶液2ml、链霉素溶液0.33ml。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于:所述链霉素溶液浓度为10000u/ml。
3.根据权利要求1所述大肠杆菌培养基，其特征在于:所述培养基pH为7.2~7.6。
4.大肠杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)一级种子的制备，大肠杆菌菌种分别接种于含0.1%微量盐溶液的培养基中，37°C条件下培养24小时，划线接种琼脂平板上培养，再接种马丁琼脂斜面，37°C条件下培养20~24小时，作为一级种子；(2)二级种子的制备，将大肠杆菌菌株的一级种子液接种到培养基中，37°C条件下培养24小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置3~7°C条件下保存；(3)将大肠杆菌菌株的二级种子液接种到含0.1%微量盐溶液的培养基，二级种子液接种量为培养基体积总量的2~3%,菌株种子在37°C条件下于微生物摇床内培养9~11小时。
5.根据权利要求4所述大肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇床转速为120~160转/分钟。
6.根据权利要求4所述大肠杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇床转速为150转/分钟。
【文档编号】C12N1/20GK103667137SQ201310662816
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】段升华 申请人:中山奈德生物科技有限公司