应用于胃肠疾病的两歧双歧杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，其显示每mm2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附，或具有至少1.5的粘附指数，以及一种两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，其为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体，其作为益生菌用于食品中和／或用作药物。进一步提供一种包含任何上述菌株、突变体或变异体的益生菌制剂，所述益生菌制剂、菌株、突变体和变异体的用途，及所述益生菌制剂的生产方法。
【专利说明】应用于胃肠疾病的两歧双歧杆菌菌株
[0001]说明书
[0002]迄今为止，与胃肠道功能紊乱相关和/或与不希望的胃肠炎性活性相关的疾病是广泛流行的常见疾病。两组疾病的特征在于腹痛、不适、腹胀、气胀、腹泻、便秘、消化障碍、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合，从而导致患病者的整体健康显著下降。特别是，对于肠易激综合征(IBS)，仍然缺乏有效的治疗(Brenner和Chey，2009)。几种用于IBS的药物由于对健康的不利影响已被撤回或受到限制。此外，目前的疗法主要是针对单一症状而不是在整体上缓解IBS和改善生活质量(QoL)。
[0003]普遍认为，与胃肠道功能紊乱相关的疾病，如IBS或炎性肠病，伴随有(i)肠道菌群失衡(Kassinen等人,2007)和/或(ii)胃肠道的肠屏障功能障碍(Marshall等,2004)。据认为这导致胃肠道中益生菌如双歧杆菌(Bifidobacteria)的减少。另外，据信功能障碍的肠屏障导致不希望的兼性病原性细菌进入粘膜，这随后可导致胃肠炎性活性。最近的研究提出，这种炎症引发典型的IBS症状，如肠的疼痛、运动及功能紊乱。
[0004]肠道菌群失衡的特征主要在于人类来源的非致病微生物如双歧杆菌的数目减少，而兼性致病微生物如肠杆菌(Enterobacteria)的数目增加(Jian-Min等人,2004)。据认为这种失衡导致受影响者的气态化合物和短链脂肪酸的产生增加、运动性障碍、胃肠胀气及疼痛。因此，为使肠道菌群恢复平衡，益生菌成为焦点。据推测，益生菌借助于竞争性抑制对免疫功能具有有益的影响，并且可能通过改善肠微生物平衡而有利地影响宿主。包含非致病性人类来源的益生菌的“益生菌剂”已被定义为在以一定的数目摄取时发挥超出固有的基本营养的健康效应的活微生物食品和药物。各种微生物的混合物，特别是乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)的种，在传统上用于发酵的乳制品或药物以促进健康。
[0005]已经对该问题进行了许多研究，但是，由于肠道菌群失衡只是事情的一个方面，大多数只是致力于向胃肠道递送益生菌剂的疗法未成功地用于缓解患有胃肠道功能障碍的患者的所有症状是毫不奇怪的。例如，IBS根据Rome III标准进行诊断，该标准基本上是:在具有至少开始于6个月前的症状的最后三个月期间，每个月至少3天腹痛或不适，并结合至少两个以下标准:(a)通过排便缓解，(b)开始时伴有大便频率改变，或(c)大便稠度改变，并常伴有气胀或腹胀及排便困难，即便秘和/或腹泻。伴随着这些症状，患者可能遭受社会功能和个人功能的损害和生活质量下降。然而，即使诸如疼痛/不适、腹胀/气胀、急迫等症状大部分消除，患者与整体健康相关的生活质量(QoL)的改善也是非常希望的。迄今为止，所提供的治疗，包括益生菌剂等等，均不能同时改善疼痛/不适、腹胀/气胀和消化失调等症状以及改善生活质量。
[0006]在这方面，必须考虑胃肠道功能紊乱发展的第二个重要方面，这涉及到胃肠道的肠屏障功能障碍，其特征在于其通透性的增加。在这方面的一个非常流行的理论是，肠和全身免疫系统两者的扰动使得致病微生物-在肠道菌群失衡的情况下其可能占主导地位-通过屏障并穿透粘膜，从而引起炎症反应。基于这一假设，已经进行了几项研究，它们集中于治疗和减轻炎症反应及其对胃肠道的影响。例如，EP1141235描述了应用于营养补充剂和药物中的婴儿长双歧杆菌(B.1nfantis)菌株UCC35624，其通过降低IL-8水平(Whorwell等人，2006)和使IL-1O / IL-12比率标准化(O' Mahony等人，2005)而显示出在宿主中刺激抗炎性反应的强烈能力。据称这种能力可能是婴儿长双歧杆菌菌株UCC35624具有对IBS和炎性肠病的症状的效果的主要原因。然而，不同的来源对婴儿长双歧杆菌的效果是否能归因于直接的抗炎性质提出了质疑。此外，虽然唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)在体外和在小鼠模型中也显示出强抗炎效应-与婴儿长双歧杆菌相当，但是它并没有在减轻IBS及其症状方面显示出显著的效果。
[0007]最重要的是，益生菌剂的功效是强菌株特异性的，且只有特定的菌株才可能会改善IBS及其症状。迄今为止，几项研究已经检验了益生菌剂对与胃肠道功能紊乱相关的疾病如 IBS 的症状的效果(O' Mahony 等人，2005，Kajander 等人，2005, Williams 等人，2008，Guyonnet等人，2007)。然而，只有少数可以显示出显著的益处。此外，没有益生菌菌株显示出对肠易激综合征的症状具有显著减轻的效果且同时改善生活质量。这些发现可归因于以下事实:益生菌剂的功效是强菌株特异性的。广泛接受的是，一种益生菌菌株的性质不能被转移到另一个菌株(Brenner和Chey, 2009)。因此,重要的是认识到单一益生菌菌株的功效和效应是无法预测的，这强调了测试和证实单一菌株的功效的重要性。为此目的，在实验部分描述了其方法。
[0008]以前从未有益生菌研究对于诸如IBS的疾病显示出上述症状(疼痛/腹胀/气胀/急迫/消化障碍)的减轻及患者生活质量的同时改善。因此，非常需要能改善患有胃肠道功能紊乱的患者的疼痛/不适、腹胀/气胀、急迫和消化障碍等症状及总体生活质量的疗法，其考虑到使肠道菌群恢复平衡，并且肠壁的功能性也得到恢复。
[0009]因此，本发明提供了一种作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌(B.bifidum)菌株或其突变体或变异体，其显示至少每mm2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附，或具有至少1.5的粘附指数，以及作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌(B.bifidum)菌株或其突变体或变异体，其为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75或其突变体或变异体，其不仅显示对胃肠疾病，特别是IBS，的腹痛/不适、腹胀/气胀、急迫和/或消化障碍等症状的显著改善，而且同时导致患者生活质量的显著提高。进一步提供了益生菌制剂及该菌株和益生菌制剂的用途。采用本发明的菌株，如显示至少每mm2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，或作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，所导致的总体IBS的减轻以及疼痛/不适、腹胀/气胀、急迫和/或消化障碍等单一症状的改善，及同时的QoL改善，是意料之外的结果，因为现有技术中已知并公认的是益生菌的有效性是高度菌株特异性的，并且甚至一种双歧杆菌菌株物种的密切相关的成员通常不具有相当的性质，或者甚至对于胃肠疾病是无效的(Brenner和Chey, 2009)。不打算被一种理论所束缚,本发明人认为，本发明的两歧双歧杆菌菌株、特别是两歧双歧杆菌MMBb75的优异及意料之外的效果是由于其阻止致病菌通过胃肠道的肠屏障及穿透粘膜的能力而获得的。假设肠屏障的功能障碍是由于致病微生物可通过其进入粘膜的肠壁中的“洞”或削弱的部分，则本发明人认为，非致病性细胞对肠壁的粘附减少了屏障的通透性，从而以“堵洞”的作用模式改善肠壁。这样，本发明的菌株和益生菌制剂对胃肠道菌群和健康具有双重的积极效果，因为不仅粘膜的炎症反应得到阻止，而且肠道菌群也恢复平衡。另外，非常重要的是，症状或疾病本身的减轻在清除期(washout phase)也得到保持，即治疗结束后的阶段，其中，例如不对受试者或患者施用进一步的本发明菌株、其突变体或变异体或包含本发明菌株、其突变体或变异体的益生菌制剂。在本发明的菌株、其突变体或变异体的情况下，如在下文所详细解释的，以及也在实施例和附图部分所描述的，本发明的菌株、其突变体或变异体对于总体IBS症状、腹痛/不适、腹胀/气胀和消化障碍的积极效果在清除期得到保持。
[0010]因此，本发明提供了一种作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，该菌株或其突变体或变异体显示至少每_2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附，或者具有至少1.5的粘附指数。优选地，所述菌株是在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75，或其突变体或变异体。此外，也提供了作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，该菌株是在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75，或其突变体或变异体。所述菌株、突变体或变异体尤其作/为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，和/或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化障碍、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感、总体IBS症状和/或其组合的受试者,或用于改善患者的生活质量。该菌株、突变体或变异体作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化障碍、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感、总体IBS症状和/或其组合的受试者的可用性可以使用7点利克特量表来评估，该量表常用于临床研究中，并将在下文进一步描述。患者的生活质量(QoL)可以使用标准SF-12调查问卷来评估，该调查问卷也是本领域技术人员在临床研究中常用的，并且是公认的测量QoL的标准。而且，对于总体IBS症状、腹痛/不适、腹胀/气胀，如在下文所详细解释的，以及也在实施例和附图部分所描述的，本发明的菌株、突变体或变异体的积极效果在清除期得到保持。
[0011]在一个实施方案中，疾病是选自下组的成员:肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由于不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌(Clostridium difficile)相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，及其组合，优选地，该疾病是肠易激运动。
[0012]在一个实施方案中，本发明的菌株、突变体或变异体是遗传修饰的突变体，或者该菌株、突变体或变异体是天然存在的变异体。在替代实施方案中，该菌株、突变体或变异体的细胞是存活的或非存活的。非存活细胞产品的制备较简单，可以很容易地将细胞引入到药品中，且存储要求的限制比存活细胞的情况要少得多。可以通过热或通过暴露于改变的PH值或经受压力而杀死细胞。然而，存活细胞能够栖息于患有如本文所述的疾病或症状的受试者的胃肠系统，因此在缓解、预防和/或治疗患有这样的疾病或症状的受试者方面具有较好的功效。
[0013]本发明还提供一种益生菌制剂，其包含作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，该菌株或其突变体或变异体显示至少每_2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附，或者具有至少1.5的粘附指数，如在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75，或其突变体或变异体。优选地，该益生菌制剂作为益生菌用于食品中和/或用作药物。
[0014]在一个优选的实施方案中，益生菌制剂进一步包含至少一种益生素(prebiotic)。优选地，该益生素是菊粉或果糖寡糖。
[0015]在任何上述实施方案中，益生菌制剂进一步包含至少一种药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素；任选地，所述至少一种药学上可接受的化合物是选自一种或多种维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如钙或镁、一种或多种碳水化合物如乳糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成员。优选地，可摄取的载体是胶囊、片剂、粉末或食物产品；任选地，该食物产品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、酸奶产品如发酵酸奶饮料、饮用酸奶、乳酪、发酵奶油、乳基甜品发酵乳或人化乳(humanized milk)、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调料、饮料等等。
[0016]在一个实施方案中，益生菌制剂进一步包含蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素。
[0017]在任何上述实施方案中，所述菌株、突变体或变异体可以以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO1Cfu,任选地每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品不少于
102、103、IO4UO5或IO6菌落形成单位(Cfu)存在于益生菌制剂中，优选地，该菌株、其突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO7Cfu存在，更优选地，该菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO8Cfu存在，甚至更优选地，该菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO9Cfu或超过IOltlCfu存在。一“单位粉末”是指一定量的粉末，其包含超过IO1Cfu,任选地不少于102、
103、IO4>IO5或IO6菌落形成单位(Cfu),优选超过IO7Cfu,更优选超过108cfu,甚至更优选超过IO9Cfu或超过10lclcfu。因此,一单位粉末表示包含患者的标准日剂量的量,然而，由于几个原因，并且以下面描述的几种方式，日剂量可以增加或减少。一单位粉末的典型量(按重量)应当是容易摄取和消化的，范围从毫克到数克，例如，5g、10g、15g或更多。一单位粉末也可以与此处提及的任何食物产品混合，并且也可与本领域技术人员认为合适的另一食物产品混合。因此，每一粉末量(按重量)的cfu量可以比被认为容易摄取和消化的粉末量的标准日剂量高得多。在此，粉末将必须用如上所述的益生菌制剂中允许的其它组分来稀释。一“单位食物产品”或“食物产品”通常表示典型的量(按重量或体积)(其被视为用作可摄取载体的特定食物产品的标准或典型量)，作为待食用或饮用的消费部分而提出的典型量，包装单位或相当的量。因此一“单位可摄取载体”表示片剂、胶囊、栓剂或相当的，或一单位粉末或单位食物产品，其表示典型的量(按重量或体积)(其被视为用作可摄取载体的特定食物产品的标准或典型量)，作为待食用或饮用的消费部分而提出的典型量，包装单位或相当的。
[0018]在任何上述实施方案中，在益生菌制剂中向患者施用的菌株、突变体或变异体的每日量不小于每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品IO1Cfu,任选地不小于102、103、
104、IO5或106cfu,优选不小于107cfu,更优选不小于108cfu,甚至更优选不小于IO9Cfu或不小于 IO10CfUo[0019]根据任何上述实施方案的益生菌制剂是有用的，并提供作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，和/或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感、总体IBS症状和/或其组合的受试者的用途。任选地，该疾病是选自下组的成员:肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由于不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，及其组合。优选地，该疾病是肠易激运动。
[0020]本发明还提供本发明的菌株、突变体或变异体和本发明的益生菌制剂作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎症活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，和/或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合的受试者的用途。任选地，该疾病是选自下组的成员:肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由于不希望的炎性活性引起的自身免疫病、由于不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，及其组合。
[0021]还提供了一种生产本发明的益生菌制剂的方法，其至少包括以下步骤:
[0022]a)在富含蛋白质的液体生长培养基中发酵和/或生长本发明的菌株或突变体或变异体，优选地显示至少每mm2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的菌株或其突变体或变异体，或在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75菌株，或其突变体或变异体，
[0023]b)通过细胞的离心、稳定化、冷冻干燥、研磨和过筛来收获细胞，
[0024]c)任选地混合/掺混细胞与益生素、药学上可接受的化合物、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物、蛋白质和/或肽中的一个或多个成员，和
[0025]d)将步骤b)的细胞或步骤c)的混合物引入可摄取的载体中。
[0026]作为益生菌用于食品中和/或用作药物的、显示至少每mm2上皮细胞单层约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，如在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体，以及作为益生菌用于食品中和/或用作药物的、作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体(这两种菌株被称为本发明的“菌株”或“细胞”)，属于双歧杆菌属，它们是革兰氏阳性的、非运动性的、通常分枝的厌氧细菌，一般存在于胃肠道和阴道中。它们通常从健康婴儿和成人的粪便中分离。如果提到菌株，也指该菌株的细胞。双歧杆菌已被描述为帮助消化，与较低的变态反应发生率相关，并且也可在防止某些形式的肿瘤生长中起作用。双歧杆菌属于放线菌纲(Actinobacteria)的双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。两歧双歧杆菌MIMBb75可获自Industrial Microbiology Culture Collection， DiSTAM， University of Milan， Milan，Italy,且两歧双歧杆菌 MIMBb75 于 2011 年 I 月 26 日保藏于 DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany),保藏号为 DSM24514。本发明的两歧双歧杆菌的菌株、突变体或变异体对广泛的革兰氏阳性和革兰阴性细菌具有抑制活性。本发明的两歧双歧杆菌菌株或其变异体或突变体表现出对抗包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、大肠菌类(Coliform)及芽孢杆菌属(Bacillus)的种在内的细菌的广谱活性。本发明的菌株的“突变体”表示已被修饰的，即通过本领域技术人员已知的标准分子生物学技术突变的两歧双歧杆菌菌株。本发明的菌株的“变异体”是天然存在的变异体，即在健康婴儿和成人的胃肠道和阴道中存在的、与两歧双歧杆菌菌株密切相关的变异体。本发明菌株的突变体和变异体两者，对于患有本文所述的任何疾病或症状的患者，类似地具有与本发明的两歧双歧杆菌菌株，特别是与两歧双歧杆菌菌株MMBb75相同的有益性质。变异体和突变体两者也被视为该菌株的DNA同源物。在本发明的范围中，术语“同源物”用于指在染色体DNA水平上共有一定程度的“同源性”，即“同一性”或“相似性”的菌株。存在许多算法来确定这种同源性或相似性程度。优选地，可以使用 CLUSTAL 法(Higgins 等人，1989，Comput.Appl.Biosc1.，5 (2)，151)，借助于 DNAstar Inc.,Madison, Wisconsin (USA)公司的Lasergene软件来确定同源性。在染色体DNA水平上“同源”(=基本相似)的生物体在染色体DNA水平上具有至少55%或60%，优选至少65 %或70 %，更优选至少75 %或80 %，甚至更优选至少85 %或90 %，最优选至少92 %、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同源性。
[0027]对于本发明来说，“疾病”是受试者(也称为患者或人)的任何病症，与被认为健康的受试者的状况相比其发生改变。通常，本发明的疾病与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少、胃肠道的肠屏障功能障碍和/或其组合相关。该菌株、突变体、变异体、益生菌制剂及其用途所针对的典型疾病是胃肠道或消化系统的所有疾病，如肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻等等，及其组合。对于本发明来说，“症状”或“单个症状”是受试者的疾病得到表现的方式，如腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感、总体IBS症状和/或其组合，以及总体下降的生活质量。“总体IBS症状”包括对关于IBS的上述所有单个症状的全面评价。“患者”(=个人或人类或动物)是健康或不健康的受试者，在未患有本文提到的任何疾病或任何症状的情况下，其摄取显示每mm2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的本发明益生菌制剂或两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，或采用作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体进行的治疗用于预防目的，或者在患者、人、人类或动物患有本文提到的任何疾病或任何症状时，其摄取本发明益生菌制剂或显示每_2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，或采用作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体进行的治疗用于治疗目的，该疾病如与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎症活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，该症状如腹痛、不适、腹胀、气胀、消化障碍、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或生活质量下降。因此，患者(=个人)需要新的疗法，如采用显示每mm2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的本发明两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体进行的治疗，或采用作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体进行的治疗。患者、人或受试者也可以是没有任何上述疾病或症状的人。
[0028]对于本发明而言，“粘附性菌株”是一种两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，其对人结肠的细胞具有粘附性质，因而能够结合于人或还有动物肠壁的细胞，从而降低胃肠屏障的通透性并以“堵洞”作用模式改善肠壁。一种测试两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体的这种性质的直接方法在实施例部分给出。在这方面，显示每_2上皮细胞单层至少约10个、优选约20个、更优选约30个、甚至更优选约40个、最优选约50或55个细菌细胞的粘附或具有1.5、优选至少2、更优选至少2.5、甚至更优选至少3的粘附指数的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体被视为粘附性菌株或其突变体或变异体。
[0029]本发明的益生菌制剂作为益生菌用于食品中和/或用作药物，并且包含两歧双歧杆菌的菌株或粘附性菌株或其突变体或变异体，其显示每mm2上皮细胞单层至少约10个的粘附、优选约20个、更优选约30个、甚至更优选约40个、最优选约50或55个细菌细胞，或具有1.5、优选至少2、更优选至少2.5、甚至更优选至少3的粘附指数，或者本发明的益生菌制剂作为益生菌用于食品中和/或用作药物，并且包含两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，其为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体。本发明的益生菌制剂也可被视为药物制剂。“食品”原则上是指可被人、优选地也被动物摄取和消化的任何形式的物质或材料。一般来说，这包括可被食用或饮用以提供身体营养支持和/或愉悦的物质或材料。对于人来说，这些物质可以是植物、微生物或动物来源的。在本发明的情况下，具体而言，食品的意思是，它包含微生物有机体，特别是至少本发明的菌株，以及任选地包含在益生菌制剂中的、本文提及的其他物质，如至少一种药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素；任选地，所述至少一种药学上可接受的化合物是选自一种或多种维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如钙或镁、一种或多种碳水化合物如乳糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成员。“药物”通常不被理解为食品，因为药物一般只给予特定状况下的人或患者，该状况不被视为健康的状况，而是视为疾病。尽管如此，药物也可以提供身体的营养支持和/或愉悦，例如在患抑郁症患者的情况下。药物和治疗品一般都经受更严格的监管和审批流程。对于被理解为本发明菌株、突变体或变异体的主要施用方式和主要应用的食品，这些审批流程是不必要的。如上文已经解释的，本发明中的“益生菌”包括非致病性的、人类来源的益生菌，并且已被定义为活微生物食品和医疗补充剂，其在以特定量摄入后，发挥超出固有的基本营养的健康效应。各种微生物，特别是乳杆菌属和链球菌属的种的混合物，在传统上已用于发酵乳制品中用以促进健康。本发明的益生菌至少包含本发明的粘附性两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，或本发明的两歧双歧杆菌MMBb75菌株或其突变体或变异体。然而，已被认为是有用的益生菌的其他种的其他菌株、细胞、突变体或变异体也可以作为细菌成分存在于本发明的益生菌制剂中。这些是例如乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母属、链球菌属的种的益生菌菌株或其混合物。因此，“细菌成分”表示如上提及的益生菌菌株的存活的或非存活的菌株或细胞，并且可以进一步用于化合物，如细菌来源的或通过细菌发酵或表达产生的生物分子、多糖、脂质或其他。甚至任何细菌种的死材料也可以被理解为细菌化合物。
[0030]本发明的益生菌制剂可进一步包含至少一种益生素，或两种、三种、四种或更多种不同益生素的组合。对于本发明来说，“益生素”意指充当本发明的菌株的营养物，并使他们在从冻干状态解冻后保持存活和健康状态。每克微生物细胞，即每克菌株，通常2-5g、优选约2.5g、更优选至少2.5g、甚至更优选至少3g、最优选至少4g益生素是必要的。通常，无法被人消化的食物成分，如某些碳水化合物，用作益生素。益生素的例子包括碳水化合物，优选寡糖、菊粉、果糖寡糖、半乳糖寡糖、亚麻籽车前草(psyllium)、低聚果糖、异麦芽糖寡糖、木糖寡糖、大豆寡糖、麦芽糊精、葡萄糖寡糖、甘露糖寡糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、低聚乳果糖、葡甘露聚糖(gluconannan)、乳果糖、聚右旋糖、低聚葡聚糖(oligodextran)、龙胆糖寡糖(gentioligosaccharide)、果胶寡糖、黄原胶、阿拉伯胶、半纤维素、抗性淀粉及其衍生物，以及它们的混合物和/或组合。
[0031]本发明的益生菌制剂可进一步包含至少一种药学上可接受的化合物、至少一种可摄取的载体、至少一种佐剂、至少一种细菌成分、至少一种药物实体、至少一种生物化合物和/或至少一种蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素。
[0032]“药学上可接受的化合物”是指在药物组合物或制剂中是可以接受的液态、固态或气态的化学或生物化合物，其特征在于对于人动物的生理学和身体的良好耐受性，以及在药理学上无活性或对接受者的生理学无有害影响。至少一种、两种、三种、四种、五种乃至更多种不同的药学上可接受的化合物可以以不同的量存在于本发明的益生菌制剂中。可以由生产者根据所用两歧双歧杆菌菌株的具体需要并且根据特定应用、施用方式或剂量方案对该量进行调整。药学上可接受的化合物的例子包括益生素、碳水化合物、脂质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、核酸、麦芽糊精、菊粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、右旋糖、果糖、山梨糖醇、果糖寡糖、甘露糖醇、玉米淀粉、结晶纤维素、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、明胶，优选牛明胶、糖浆、氨基水杨酸盐、柳氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸、4-氨基水杨酸、苄连氮、二盐酸盐、奥沙拉嗪、巴柳氮、次水杨酸铋、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、惰性聚合物、水和矿物油、碘、镁、天冬氨酸-抗坏血酸镁络合物、镁氨基酸螯合物、锌、锌氨基酸螯合物、硒、硒氨基酸络合物、铜、铜氨基酸螯合物、锰、锰氨基酸螯合物、铬、聚烟酸铬、钥、钥氨基酸螯合物、钾、天冬氨酸-抗坏血酸钾络合物、胆碱、重酒石酸胆碱、肌醇、钒、硫酸氧钒、硼、天冬氨酸-柠檬酸硼、柑橘生物黄酮、改性纤维素胶、二氧化硅、植物硬脂(vegetarian stearine)、二氧化钛、硬脂酸镁,优选地所述至少一种、两种、三种、四种、五种乃至更多种药学上可接受的化合物是选自一种或多种维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如镁和钙、一种或多种碳水化合物、明胶(优选牛明胶)、甘露糖醇、糊精、果糖、山梨糖醇、益生素、麦芽糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、铁、乳糖及其混合物的成员。而且，益生菌制剂可包含本领域技术人员已知的药学上可接受的填充剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂和调味剂。
[0033]本发明的益生菌制剂和菌株或其突变体或变异体可以进行配制，以使得向患者施用后，该菌株或细胞快速、持续或缓慢地释放。可以包含在本发明益生菌制剂中的维生素的例子有水溶性和水不溶性维生素，如维生素A(例如视黄醇、视黄醛和类胡萝卜素类，包括13-胡萝卜素)、维生素B1 (硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(例如烟酸、烟酰胺、尼克酰胺)、维生素B5 (泛酸)、维生素B6 (例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7 (生物素)、维生素B9(例如叶酸、亚叶酸)、维生素B12 (例如氰钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D (例如麦角钙化醇、胆骨化醇)、维生素E (例如生育酚、生育三烯酚)、维生素K (例如叶绿醌、甲基萘醌类)，优选地本发明的益生菌制剂中包含B族维生素，如维生素B1 (硫胺素)、维生素B2 (核黄素)、维生素B3 (例如烟酸、烟酰胺、尼克酰胺)、维生素B5 (泛酸)、维生素B6 (例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7 (生物素)、维生素B9 (例如叶酸、亚叶酸)、维生素B12 (例如氰钴胺素、羟钴胺素、甲基钴胺素)及其混合物。包含在本发明益生菌制剂中的矿物质的例子有镁、钙、锌、硒、铁、铜、锰、铬、钥、钾、钒、硼、钛，优选存在镁和/或钙。“微量元素”是对于有机体、优选人类有机体的生长、发育和/或生理学而言只需要极低量的化学元素。“碳水化合物”是仅由碳、氢和氧组成并具有经验式Cm(H2O)?的有机化合物，其中氢:氧原子比为2:1。“脂质”是由于长疏水性碳水化合物部分而至少部分地不溶于水的生物化合物。脂质是生物系统中的细胞膜的非常重要的部分。
[0034]对于本发明而言，“可摄取的载体”是用于向受试者或患者施用本发明的益生菌制剂或菌株或其突变体或变异体的载体，从而帮助摄取本发明的益生菌制剂和菌株或其突变体或变异体。本文所用的术语“乳制品”意在包括含有动物和/或植物来源的乳的介质。动物来源的乳包括来自牛、绵羊、山羊和水牛的乳。作为植物来源的乳，可以提到任何可根据本发明使用的植物来源的可发酵物质，特别是来源于大豆、大米或谷物的。一种可能的可摄取载体是选自胶囊、片剂、粉末、颗粒剂、锭剂、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液、糖浆、悬浮剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌包装的粉末或食物产品的成员；任选地，食物产品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、酸奶产品如发酵酸奶饮料、饮用酸奶、乳酪、发酵奶油、乳基甜品发酵乳或人化乳、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调料、饮料等等。对于本发明而言，“佐剂”是一种药理学或免疫学制剂，其改变其它药 剂如药物或疫苗或本发明的益生菌制剂、菌株或其突变体或变异体的效果，同时在单独给予时具有极少的-如果有的话-直接效应。
[0035]“药物实体”涉及药学活性的、同时对于患者而言药学可耐受的化学或生物化合物，如比沙可啶、洛哌丁胺、氨基水杨酸盐、柳氮磺胺吡啶、5-氨基水杨酸、4-氨基水杨酸、苄连氮、二盐酸盐、奥沙拉嗪、巴柳氮、次水杨酸铋或其混合物。这样的化合物可以是任何直接或间接地促进本发明益生菌制剂或菌株、其突变体或变异体的有益效果的化合物。“直接地”意指两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体本身得到保护，其生长或对肠屏障的粘附得到支持。“间接地”意指在益生菌制剂中可以单独地或与其他药物实体组合地包含额外的物质或化合物，即药物实体，已知其可用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合的受试者，或用于改善患者的生活质量。特别是，益生菌制剂中可以包含作为用于治疗以下疾病的已知药物的药物实体:胃肠道疾病如肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌，全身性疾病如类风湿关节炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，及其组合。这样的药物实体的例子是本领域技术人员已知的，并且可见于Rote Liste, 2010, Germany或任何其他药品登记表中。“生物化合物”可以是任何生物化合物，如碳水化合物、氨基酸、脂质、核酸、蛋白质、肽、细胞区室、磷脂、聚醚、植物、动物或微生物化合物。“蛋白质”、“肽”或“多肽”将根据它们的通常含义理解为蛋白质性或非蛋白质性氨基酸的线性组合物，其中蛋白质还可以包含一个或多个亚基和催化相关物质，如维生素、矿物质或物质。
[0036]“菌落形成单位”(cfu)是本发明的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体的活细菌细胞的量度。本发明的益生菌制剂以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO1Cfu，任选地不小于102、103、IO4UO5或IO6菌落形成单位(Cfu)包含该菌株、其突变体或变异体，优选地，该菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO7Cfu存在，更优选地，该菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO8Cfu存在，甚至更优选地，该菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO9Cfu存在。在益生菌制剂中向患者施用的菌株、其突变体或变异体的每日量不小于IO1Cfu,任选地不小于102、103、IO4UO5或106cfu，优选不小于107cfu，更优选不小于IO8Cfu,甚至更优选不小于IO9Cfu或不小于101(lCfu。每日量可根据患者的生理状况增加，即在严重症状的情况下增加。在此，该量可以增加，其中每日量加倍、为三倍或多倍。与此相反，每日量可以减少、减半或除以2、3或4，例如在不耐受性或给予额外药物的情况下，或者如前面提到的每日量可以不每天施用，而是每隔一天或两天或每周施用。该菌株、其突变体或变异体或益生菌制剂可以在个人或患者认为方便的任何时间服用，例如在早晨、中午、下午或晚上，优选地，时间是在早晨，例如醒后，或在晚上，例如临睡前。如果该菌株、其突变体或变异体或益生菌制剂包含作为食物产品的可摄取载体，则根据可摄取载体的性质，即食物产品，进行施用。如果该菌株、其突变体或变异体或益生菌制剂包含可摄取的载体，如片剂胶囊或相当的可摄取载体，则伴随着饮料或水，优选伴随着水进行口服施用。
[0037]通常，本发明的益生菌制剂和菌株根据益生菌、食品或药物的具体形式进行施用。因此，在正常情况下，口服、优选肠胃外或通过直肠施用本发明的益生菌制剂和菌株。
[0038]生产本发明的益生菌制剂的方法至少包括以下步骤:
[0039]a)在富含蛋白质的液体生长培养基中发酵和/或生长显示每mm2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，或作为在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，
[0040]b)通过细胞的离心、稳定化、冷冻干燥、研磨和过筛来收获上述菌株的细胞，
[0041]c)任选地混合/掺混所述细胞与益生素、药学上可接受的化合物、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物、蛋白质和/或肽中的一个或多个成员，和
[0042]d)将步骤b)的细胞或步骤c)的混合物引入可摄取的载体中。
[0043]首先应当指出，本发明的两歧双歧杆菌菌株、突变体或变异体的发酵和生长可以通过如在〃Probiotics and Health Claims" , Wolfgang KneifeI, Seppo Salminen, Johnffiley&Sons ；1.Edition(2011年I月7日)中描述的、本领域技术人员已知的标准手段和
方法进行。
[0044]通常，用于生长和/或发酵本发明的两歧双歧杆菌菌株、突变体或变异体的培养基至少包含水、右旋糖、酵母提取物和矿物质。用于生长和/或发酵本发明的菌株或其变异或突变体的标准培养基是补充有0.05% L-半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤(Difco，Detroit,MI, USA) (cMRS)。本领域技术人员非常清楚以下事实:其他培养基也可以用于生长、发酵和预培养细菌有机体，如两歧双歧杆菌菌株。任选地，在步骤a)之前，菌株或其变异体或突变体在摇瓶中进行预培养生长。为了这个目的，在体积为至少200mL、优选至少300mL、更优选至少400mL、甚至更优选至少500mL和最优选至少600mL的如上提及的标准培养基中接种该菌株或其变异体或突变体的至少单细胞。这种预培养一般在37°C下以220rpm厌氧生长过夜。
[0045]预培养然后可以完全或部分地用于在容积为至少500L、优选至少600L、更优选至少700L、甚至更优选至少800L、最优选至少1000L的预发酵罐中接种用于上层发酵(higherfermentation)。在预发酵罐中进行本发明的菌株、变异体和突变体的发酵后，将含有所述菌株、变异体和突变体的细胞培养物至少部分地转移到容积为至少5000L、优选至少7500L、更优选至少10000L、甚至更优选至少15000L、最优选至少20000L的主发酵罐中。在预发酵罐和主发酵罐中，也使用上述标准培养基发酵和生长本发明的两歧双歧杆菌菌株、其突变体和变异体。在包含在培养基中充当本发明菌株、突变体和变异体的营养物的碳水化合物耗尽后，停止发酵和生长并收获细胞。通常，碳水化合物耗尽后的细胞密度是至少IO1Cfu,任选地不小于ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5或IO6个细胞/ mL,优选至少IO7个细胞/ mL,更优选至少IO8个细胞/ mL,甚至更优选至少IO9个细胞/ mL或至少101°个细胞/ mL。本领域技术人员知道细胞密度或生物量测定的方法，如使用标准干燥程序测定作为干重的生物量，和预称重的玻璃管的重量测定，或使用分光光度计(如Hitachi U-1100，Japan)在578nm处吸光度的光密度测量。
[0046]预发酵罐和主发酵罐可以来源于适于培养、发酵、生长和/或处理本发明的两歧双歧杆菌菌株、突变体和/或变异体的标准生物反应器。标准生物反应器的供应商例如有 Applikon Biotechnology B.V.(Schiedam, The Netherlands)、Infors(Bottmingen,Switzerland) > Bioengineering (, Wald, Switzerland)和 Sartorius Stedim BiotechGmbH (Gottingen, Germany)。预发酵和主发酵两者以分批模式进行,分批模式通常意味着在发酵过程中不补充培养基或其他成分。
[0047]主发酵后，通过离心分离收获细胞，如通过使用盘式离心机或如由GEA WestfaliaSeparator Group GmbH(0eIde, Germany)提供的、具有约 2000-15000L / h 工作能力的分离器或其他的。随后使用本领域技术人员公知的标准应用和手段将细胞稳定化、冷冻干燥、研磨并过筛。冷冻干燥获得体积为500L-1000L、优选600L-800L且重量约为100kg_200kg、优选约150kg的浓缩物。
[0048]之后，任选地将细胞与益生素和/或至少一个或多个选自下组的成员混合:药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽和/或其混合物，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素；任选地，所述至少一种药学上可接受的化合物是选自一种或多种维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如钙或镁、一种或多种碳水化合物如乳糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其不同量的混合物的成员。
[0049]为了获得本发明的益生菌制剂，通常，15_40g、优选18_35g、更优选20_30g、甚至更优选22-28g、最优选25g本发明两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体与50-100g、优选60-90g、更优选65-85g、甚至更优选70-80g、最优选75g的作为该细胞、菌株、其突变体或变异体的营养物的一个或多个选自益生素、碳水化合物、药学上可接受的化合物或其混合物的成员混合，并且任选地与30-70g、优选35-65g、更优选40_60g、甚至更优选45_55g、最优选50g的一个或多个选自下组的成员混合:药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素和/或其混合物，以用于改善益生菌制剂的流动性。优选地，15-40g、优选18-35g、更优选20-30g,甚至更优选22-28g、最优选25g的本发明两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体与50-100g、优选60-90g、更优选65-85g、甚至更优选70_80g、最优选75g碳水化合物、碳水化合物混合物、益生素或其混合物混合，并且任选地与30-70g、优选35-65g、更优选40_60g、甚至更优选45-55g、最优选50g的一个或多个选自药学上可接受的化合物、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素和/或其混合物的成员混合。更优选地，15-40g、优选18-35g、更优选20-30g、甚至更优选22-28g、最优选25g本发明两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体与50-100g、优选60-90g、更优选65-85g、甚至更优选70_80g、最优选75g碳水化合物、菊粉、果糖寡糖或其混合物混合，并且任选地与30-70g、优选35-65g、更优选40_60g、甚至更优选45-55g、最优选50g的一个或多个选自下组的成员混合:维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如钙或镁、一种或多种碳水化合物如乳糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露醇、果糖寡糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物。甚至更优选地，25g本发明的两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体与75g选自碳水化合物、益生素、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成员混合，并且与50g选自下组的成员混合:纤维素、药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素或其混合物。最优选地，25g本发明的两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体与75g麦芽糊精混合，并与50g纤维素混合。在发酵和/或生长菌株、收获、稳定化、冷冻干燥、研磨、过筛后，所述成分与本发明的细胞、菌株、其突变体或变异体的混合/掺混可以通过本领域技术人员已知的标准技术、应用和手段进行，优选地使用柱混合器。当然，在混合/掺混中也可使用更高或更低的量，这取决于用于混合/掺混的装置的容积，只要成分的比例对应于以上提及的比值即可。例如，一个典型的比率为25%的菌株、75%的益生菌或碳水化合物或麦芽糊精和70%的药学上可接受的化合物，如纤维素。例如，将50mg-300mg、优选75mg-250mg、更优选100mg-200mg、甚至更优选120mg-175mg、最优选150mg本发明的两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体，或本发明的上述混合物或益生菌制剂，引入一个单位的可摄取载体中，例如引入胶囊、片剂、锭剂、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液、糖浆、悬浮剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌包装的粉末或食物产品中，如乳制品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、酸奶产品如发酵酸奶饮料、饮用酸奶、乳酪、发酵奶油、乳基甜品发酵乳或人化乳、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调料、饮料等等，优选地将50mg、优选75mg、更优选lOOmg、甚至更优选120mg、最优选150mg本发明的两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体或上述混合物引入到胶囊、片剂、锭剂、扁囊剂、软和硬明胶胶囊、栓剂中，更优选地引入胶囊、软和硬明胶胶囊中。由此，在引入此可摄取载体单元中后，即胶囊、片剂、粉末、颗粒剂、锭剂、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液、糖浆、悬浮剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌包装的粉末或食物产品(如乳制品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、酸奶产品如发酵酸奶饮料、饮用酸奶、乳酪、发酵奶油、乳基甜品发酵乳或人化乳、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调料和/或饮料)，其包含超过IO1Cfu,任选地不小于102、IO3,104、IO5或106cfu，优选超过107cfu,更优选超过108cfu,甚至更优选超过IO9Cfu或超过101Qcfu。在任何情况下,可根据cfu的浓度调整该量(按重量)，使得最终产品如胶囊、片剂、粉末、颗粒剂、锭剂、扁囊剂、酏剂、乳剂、溶液、糖浆、悬浮剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌包装的粉末或食物产品中本发明的两歧双歧杆菌细胞、菌株、其突变体或变异体的量相当于超过IO1Cfu,任选地不小于102、
103、IO4>IO5或IO6Cfu,优选超过IO7Cfu,更优选超过108cfu,甚至更优选超过IO9Cfu或超过IO10Cfu0 在 cfu 的量小于 IO1Cfu,任选地小于 102、103、IO4UO5 或 106cfu、107cfu、108cfu、甚至IO9Cfu或小于IOltlCfu的情况下，患者可通过施用超过一个可摄取载体单位而适应上述cfu 量。
[0050]在一个不例性实施方案中，将25mg在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75细胞，即至少IO9Cfu的在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75、75mg麦芽糊精和50mg纤维素引入一个明胶胶囊中，优选牛明胶胶囊。优选地，上述含有25mg在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75细胞的胶囊包含至少IO9Cfu的在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75、75mg麦芽糊精和50mg纤维素，其每日施用一次。可摄取的载体通常应当是标准质量至高质量的，应当符合食品添加剂的卫生要求，并可从各个生产商获得。胶囊，例如牛明胶胶囊，例如可以从Capsugel (Bornem, Belgium)获得。[0051 ] 在另一个优选实施方案中，25mg在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75细胞(优选包含至少IO9Cfu的在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75)和2g麦芽糊精混合，并被看作一个单位的粉末。优选地，含有25mg在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75细胞，即至少IO9Cfu在保藏号DSM24514下保藏的两歧双歧杆菌MMBb75的上述粉末单位每日施用一次。
[0052]不依赖于由个人或患者选择的特定可摄取载体，在益生菌制剂中向患者施用的两歧双歧杆菌细胞、菌株、突变体或变异体的每日量不低于IO1Cfu,任选地不低于102、103、
104、IO5或IO6Cfu,优选不低于IO7Cfu,更优选不低于IO8Cfu,甚至更优选不低于IO9Cfu或不低于10lclcfu。可选的剂量在上文讨论。
[0053]本发明并不限定于前文所述的实施方案，它们在细节上可以进行改变。
实施例
[0054]1.细菌培养条件
[0055]通常，双歧杆菌属的种，如两歧双歧杆菌MMBb75，常规地在补充有0.05% L-半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤(cMRS) (Difco, Detroit, MI, USA)中37°C下厌氧生长过夜。[0056]2.两歧双歧杆菌MLMBb75对Caco_2人肠上皮细胞系的粘附性质的测试
[0057]2.1细菌对Caco-2细胞的粘附
[0058]可以进行该试验以测试某些双歧杆菌菌株对人结肠细胞是否具有粘附性质，并因此被理解为对于本发明而言的粘附性菌株。人结肠腺癌Caco-2细胞(ATCC HTB-37)在显微镜盖玻片上的3-cm培养皿中，在补充有10% (体积/体积)热灭活(56°C，30分钟)的胎牛血清、100U mL—1青霉素、IOOmg mL—1链霉素、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基中常规生长，并在带水夹套的培养箱中在95%空气和5%二氧化碳的气氛下37°C温育。对于该试验，来自任何体内来源的上皮细胞，包括但不限于来自于人胃肠道的上皮细胞，是合适的，然而，CaCo-2细胞或其衍生物是最优选的，并且可从培养物保藏库如ATCC和ECACC商购获得。培养基每周更换两次。对于粘附分析，细胞在汇合后15天使用(完全分化的细胞)。在加入细菌细胞之前，细胞单层用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.3)仔细洗涤两次。在DAPI (4'，6' - 二脒基_2_苯基吲哚)染色后，用显微镜测定生长过夜的培养物的细菌细胞浓度。在PBS (pH7.3)中重悬浮的各菌株约2X IO8个细胞与完全分化的Caco-2细胞的单层一起温育。在缺氧条件下37°C I小时后，所有单层用PBS洗涤三次以释放未结合的细菌。然后将细胞用3mL甲醇固定，并在室温下温育8分钟。除去甲醇后，用3mL姬姆萨染色液(I:20) (Carlo Erba，Milan，Italy)对细胞进行染色，并在室温下放置30分钟。然后洗涤各孔，直到在洗涤溶液中观察不到颜色，并在培养箱中干燥I小时。然后从培养皿中取出显微镜盖玻片，并进行油浸显微镜检查(放大倍数X 100)。对20个随机选择的显微镜视野中的粘附性细菌进行计数和平均。运行未配对Studentt检验以分析统计学显著性差异。
[0059]发现两歧双歧杆菌MMBb75良好地粘附至Caco_2人结肠细胞，因为显著比例的该细菌菌株的细胞保持附着于Caco-2单层，从而提供了该粘附不只是非特异性物理捕集的证据。特别是，约55个细菌细胞粘附到Ι-mm2上皮细胞单层上，导致3874的粘附指数(细菌细胞/ 100个Caco-2细胞)(P < 0.026)。在这点上，显示每mm2上皮细胞单层至少约10个细菌细胞的粘附或具有至少1.5的粘附指数的双歧杆菌菌株细胞被认为是粘附性菌株。
[0060]2.2细菌细胞壁提取物的制备
[0061]通过离心从0.2L液体培养物中收获细菌细胞，并根据以前Mattarelli等人(1993)所描述的方法进行处理，其中改进是采用弗氏压碎器(12，0001b / in2，约2，142kg / em2)破碎细胞。
[0062]3.用于评估两歧双歧杆菌MMBb75在肠易激综合征患者中的功效的双盲、随机化和安慰剂对照研究
[0063]3.1 概述
[0064]将122名患者成功地随机分组以接受安慰剂(N=62)或两歧双歧杆菌MIMBb75 (N=60)(也称为“双歧杆菌组”)。受试者服用I X IO9Cfu /胶囊或安慰剂，每天一次，共四周。每天按照7点利克特量表记录IBS和单个IBS症状的严重程度。
[0065]3.2研究人群
[0066]患者由主要研究者通过广告招募。营养研究方案已提交Bavarian Chamber ofPhysicians的伦理委员会。对于入组，考虑年龄为18_68岁、具有轻度到中度IBS (RomeIII标准)的临床上不显著的受试者。已排除具有炎性器质性胃肠疾病、全身性疾病、癌症、自身免疫性疾病、糖尿病、已知乳糖不耐受或免疫缺陷、已知除阑尾切除术外的其他腹部手术、当超过50岁时在最近5年内没有无病乙状结肠镜检查或结肠镜检查、诊断为甲状腺机能亢进、在研究开始前使用抗精神病药或全身性皮质类固醇至少3个月、主要精神异常、乳糜泻或妊娠的个体。
[0067]3.3研究设计
[0068]该研究作为一项前瞻性、多中心、随机化、双盲、安慰剂对照、双组营养研究而进行。在整个研究中，患者采用患者日记每天记录其总体IBS症状以及单个IBS症状。另外，在医疗场所询问患者的总体及单个IBS症状(访视2-4)和生活质量(访视3和4)。医生访视发生在筛选时、两周后(测试期(run-1n phase) )、6周后(治疗结束时)及8周后(清除期结束时)(图1)。
[0069]在患者给予书面知情同意后，他们有资格进行第I天的筛选检验(访视I)，这包括完整医疗史和身体检查。采集血样以在中心实验室进行分析，包括妊娠试验。在筛选访视时，指示患者在整个研究过程中保持其饮食和生活方式习惯。分发患者日记。
[0070]在第二次访视时(第15天)，审阅日记。将测试期第二周期间有至少2天具有轻度至中度疼痛且符合所有入选标准和不违反任何排除标准的患者按1:1随机分组以接受两歧双歧杆菌MMBb75或安慰剂。根据计算机生成的、区组大小为4的区组随机化列表分配治疗。区组大小没有透露给研究人员。在干预期期间，患者每天接受一粒包含益生菌制剂的胶囊共4周，或接受相同外观的安慰剂。患者和工作人员对于该分配均不知情。
[0071]在治疗期结束时(访视3，第43天)，研究人员收集未使用的研究产品和空药囊以确认顺应性。收集并审阅日记。
[0072]在无营养补充剂的清除期后(访视4，第57天)，进行全面的身体检查，并采集血样。允许用比沙可啶和洛哌丁胺作为救护药物。可能影响研究产品的功效的其他益生菌剂和药物是不允许的。
[0073]3.4益生菌制剂
[0074]在优质生产规范(GMP)条件下制备营养补充剂。两歧双歧杆菌MMBb75在富含蛋白质的液体生长培养基中生长，通过离心收获，稳定化，冷冻干燥，研磨并过筛。干粉细菌与药学上可接受的化合物混合，并以I X IO9Cfu填充到胶囊中。安慰剂胶囊外观相同，并含有麦芽糊精。
[0075]3.5终点定义
[0076]前瞻性定义的主要功效变量为使用7点利克特量表对受试者的IBS症状的整体评价。要求患者每天回答以下问题:“如果你总体上考虑你的IBS症状(如腹痛/不适、腹胀/气胀、消化障碍、急迫、大便习惯)，在过去24小时期间你受这些症状的影响如何？”可能的回答是从0(根本没有)、1(极轻度)、2(轻度)、3(中度)、4(强)、5(极强)到6(无法忍受)。
[0077]次要功效变量包括单独IBS的单个症状，如“腹痛/不适”、“腹胀/气胀”、“消化障碍”和“急迫”，按照相同的7点利克特量表记录。将单个症状评分另外组合成综合征状评分，作为三个单个症状评分的算术平均值。此外，排便次数减少和/或增加、不完全肠排空感和其他药物的摄入也每天记录在日记中。
[0078]在结束治疗时以及在研究结束时，医生询问患者关于对功效和耐受性的整体评价。功效通过以下问题进行评价:“请考虑在4周的治疗期间，关于你的总体健康和腹部不适/疼痛症状和大便习惯改变，你感觉如何。与你在服用研究药物之前通常的感觉相比，你如何评价你在过去4周内的症状缓解？”可能的回答是:“完全缓解(I)、明显缓解(2)、略微缓解(3)、未改变(4)或更糟(5)”。“完全缓解”和“明显缓解两者被定义为“充分缓解”。与健康相关的生活质量在治疗前和治疗结束时利用SF-12调查问卷进行评估。
[0079]整个研究期间记录不良事件，并在医生访视3和4时询问对耐受性的整体评价。在筛选访视时和在研究结束时检查实验室值和生命体征。
[0080]3.6统计学方法
[0081]3.6.1样本大小估计
[0082]按照7点利克特量表，受试者的整体评价(SGA)至少降低20%被认为是相关的治疗效果。基于公布的数据(WhOrwell，2006年)，预计按照7点利克特量表，两歧双歧杆菌MIMBb75与安慰剂之间IBS症状的SGA相差0.6个点(例如，在安慰剂组中为3.0而在双歧杆菌组中为2.4)。使用相同的数据估计1.0的标准差。应用这些假设，需要Wilcoxon-Mann-Whitney检验,其双侧显著性水平为α =0.05,效能为1- β =0.8,样本大小为每组47名患者。采用估计的随机分组后15-20%的退出率，计划有110名随机分组的患者，并招募132名来应对研究开始前可能的退出。
[0083]3.6.2统计分析
[0084]本研究的主要目标是证明双歧杆菌组与安慰剂组相比在治疗结束时总体IBS症状的SGA显著降低。将每名受试者的SGA在基线处、治疗期间和清除期计算为算术平均值。为了说明基线值可能的差异，通过4周治疗期间的平均评分减去测试期(第1-2周)期间的平均评分而计算的距基线的变化被定义为主要目标标准。由研究中心分层的非参数VanElteren检验用于治疗组的比较。ρ < 0.05被认为统计学显著。
[0085]主要分析基于有治疗意向的人群，其中包括所有成功随机分组的患者。对于主要目标标准用基线值输入基线后漏失值，并且这些患者被评价为非响应者。为了支持目的，进行额外的符合方案分析(per protocol analysis)。
[0086]次要目标标准的描述性分析是基于可获得的数据。对于连续变量利用非参数Wilcoxon检验,或者对于二元变量利用Fishers精确检验对治疗差异进行检验。所有的P值均为双侧的。
[0087]次要功效变量包括治疗期间基于50%症状缓解原则的响应(治疗期内的四周中至少有两周改善，以及被定义为距基线降低至少一个点的改善)。所有的统计分析都采用windows 版的 SAS9.1.3 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)进行。
[0088]3.7 结果
[0089]3.7.1 受试者
[0090]总共132名患者入选该研究，而122名患者成功随机分组以接受安慰剂(N=62)或两歧双歧杆菌MMBb75(N=60)。分析所有随机分组的患者的治疗意向(ITT) (N=122)。一名未接受随机分组后访视的患者被排除在不良事件分析之外。总共103名患者(49人安慰剂，54人真实(verum))按照方案进行了分析(图2)。
[0091]3.7.2基线特征
[0092]在基线特征方面，组间无显著性差异。21.5%被分类为以腹泻为主的IBS，19.8%分类为以便秘为主的IBS，58.7%分类为交替者，双歧杆菌和安慰剂组之间无显著性差异。
[0093]人口统计数据在治疗组之间得到很好的平衡，具有约67%的女性患者，平均体重为71kg，对应于体重指数为24。安慰剂组中的患者平均41岁，而双歧杆菌组中的患者平均37岁(表1)。
[0094]
【权利要求】
1.一种作为益生菌用于食品中和/或用作药物的两歧双歧杆菌菌株或其突变体或变异体，该菌株是以保藏号DSM24514保藏的两歧双歧杆菌MIMBb75或其突变体或变异体。
2.如权利要求1所述的菌株、突变体或变异体，其作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合的受试者，或用于改善患者的生活质量。
3.如权利要求2所述的菌株、突变体或变异体，其中，所述疾病选自肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，以及它们的组合。
4.一种包含如权利要求1至3中任一项所述的菌株、突变体或变异体的益生菌制剂，其优选地作为益生菌用于食品中和/或用作药物。
5.如权利要求4所述的益生菌制剂，其进一步包含至少一种益生素，任选地至少包含菊粉和/或果糖寡糖。
6.如权利要求4或5所述的益生菌制剂，其进一步包含至少一种药学上可接受的化合物、可摄取的载体、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物和/或蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白质和/或肽、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素；任选地，所述至少一种药学上可接受的化合物是选自一种或多种维生素如B族维生素、一种或多种矿物质如钙或镁、一种或多种碳水化合物如乳糖、麦芽糊精、菊粉、右旋糖、甘露糖醇、麦芽糖、糊精、山梨糖醇、果糖及其混合物的成员。
7.如权利要求6所述的 方法，其中，所述可摄取的载体是胶囊、片剂、粉末或食物产品；任选地，该食物产品是乳制品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、浓缩乳、涂抹干酪、调料或饮料。
8.如权利要求4至7中任一项所述的益生菌制剂，其中，所述菌株、突变体或变异体以每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品超过IO1Cfu,任选地每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品不小于102、103、104、IO5或IO6Cfu存在。
9.如权利要求4至8中任一项所述的益生菌制剂，其中，对患者施用的所述菌株、突变体或变异体的每日量不小于每个胶囊或片剂或每单位粉末或食物产品IO1Cfu,任选地不小于 IO2UO3UO4UO5 或 IO6CfUo
10.如权利要求4至9中任一项所述的益生菌制剂，其作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，和/或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合的受试者。
11.如权利要求10所述的益生菌制剂，其中，所述疾病选自肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，以及它们的组合。
12.如权利要求1至3中任一项所述的菌株、突变体或变异体或如权利要求4至11中任一项所述的益生菌制剂作为益生菌用于食品中和/或用作药物以用于预防和/或治疗与胃肠道功能紊乱相关、与不希望的胃肠炎性活性相关、与肠道菌群失衡、胃肠道中双歧杆菌的减少和/或胃肠道的肠屏障功能障碍相关的疾病，和/或用于减轻、预防和/或治疗患有腹痛、不适、腹胀、气胀、消化失调、排便急迫和/或排便次数减少和/或增加、不完全排空感和/或其组合的受试者中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述疾病选自肠易激运动、炎性肠病例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、肠易激综合征、储袋炎或感染后结肠炎、胃肠癌、全身性疾病如类风湿关节炎、由不希望的炎性活性引起的自身免疫性障碍、由不希望的炎性活性引起的腹泻病如艰难梭菌相关腹泻、抗生素相关腹泻、轮状病毒相关腹泻或感染后腹泻，以及它们的组口 ο
14.一种生产如权利要求4至11中任一项所述的益生菌制剂的方法，至少包括以下步骤: a)在富含蛋白质的液体生长培养基中发酵和/或生长如权利要求1至4中任一项所述的菌株， b)通过细胞的离心、稳定化 、冷冻干燥、研磨和过筛来收获细胞， c)任选地混合/掺混细胞与益生素、药学上可接受的化合物、佐剂、细菌成分、药物实体、生物化合物、蛋白质和/或肽中的一个或多个成员，和 d)将步骤b)的细胞或步骤c)的混合物引入可摄取的载体中。
【文档编号】A61K35/74GK103476273SQ201280012521
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年1月27日 优先权日:2011年1月31日
【发明者】S·古列尔梅蒂, D·莫拉 申请人:纳图尔沃尔制药有限责任公司