通过改变基因拷贝数制备多肽的方法

专利名称：通过改变基因拷贝数制备多肽的方法
背景技术：
用来增加多肽产生的广泛采用的方法是通过称为扩增的方法获得具有编码多肽的基因的多重拷贝之菌株。
美国专利5578461公开了通过与基因串联的一种可扩增的选择标记基因的同源重组的导入方法，其中，通过在加大量的适当选择剂存在下培养细胞，可筛选含有与多重拷贝之基因串联的一种扩增拷贝的选择标记基因的细胞。
特定多肽生产的降低可通过破坏、失活或者通过编码多肽之基因的重组强迫丧失来实现。
本发明的一个目的是提供制备多肽的新方法。
本发明还涉及获得突变细胞的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的一个拷贝之中的基因座处导入亲本细胞的基因组，产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
本发明还涉及获得突变细胞的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列之外的基因座处导入亲本细胞的基因组，产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，所述核酸序列在该核酸序列之5’和3’端含有重复序列，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
本发明还涉及突变细胞和用于获得突变细胞的方法。


图1是pJaL292的限制性酶切图谱。
图2是pKS6的限制性酶切图谱。
图3是pBANe13的限制性酶切图谱。
图4是pBANe6的限制性酶切图谱。
图5是pMHan37的限制性酶切图谱。
图6是pBANe8的限制性酶切图谱。
图7是pSO2的限制性酶切图谱。
图8是pSO122的限制性图谱及来自pSO 122的pDSY81及pDSY82的结构。
图9是pJaI400的限制性酶切图谱。
图10是pMT1935的结构。
图11是pJaL394的限制性酶切图谱。
图12是pMT1931的限制性酶切图谱。
图13是pMT1936的限制性酶切图谱。
图14是pGAG3的限制性酶切图谱。
图15是pJaL389的限制性酶切图谱。
图16是pJaL335的限制性酶切图谱。
图17是pJaL399的限制性酶切图谱。
图18是pDM176的限制性酶切图谱。
图19是pHB218的限制性酶切图谱。
图20是pSE39的限制性酶切图谱。
图21是pDSY153的限制性酶切图谱。
发明详述在第一个实施方案中，本发明涉及用于制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的拷贝之外的基因座处导入亲本细胞的基因组，产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的增加不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
术语“基因组”在此定义为一套完整的细胞DNA，包括染色体、人工染色体DNA和染色体外DNA，即自我复制性遗传元件。
术语“拷贝数”在此定义为包含于细胞的每个基因组中的基因分子的数目。
术语“选择压力”在此定义为在增加了量的适宜选择剂存在下培养细胞，所述细胞含有一种表达盒，该表达盒带有与编码目标多肽的核酸序列串联连接的一种可扩增选择标记基因，由此使选择标记基因及串联的核酸序列的拷贝数扩增。
一种“产生更多的多肽”的突变细胞在此定义为与亲本细胞相比可从其中回收更多的多肽的细胞。
在第二个实施方案中，本发明涉及制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的拷贝之外的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体降低了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的降低不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
一种“产生更少的多肽”的突变细胞在此定义为与亲本细胞相比可从其中回收更少的多肽的细胞。
在第三个实施方案中，本发明涉及制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中
(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的一个拷贝之内的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的增加不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
在第四个实施方案中，本发明涉及制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的一个拷贝之内的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体降低了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的降低不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
在第五个实施方案中，本发明涉及制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列之外的基因座处导入亲本细胞的基因组，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，该核酸序列在所述核酸序列之5′和3′端含有重复序列，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
术语“核酸序列的至少两个串联拷贝”在此定义为编码目的多肽的核酸序列之两个或多个拷贝，其中核酸序列的拷贝在细胞的基因组中以一个接一个的方式排列，有或没有间隔序列。当有间隔序列时，间隔序列的长度应当小于10,000bp，优选小于5,000bp，更优选小于2,000bp，甚至更优选小于10,00bp，最优选小于100bp。然而，间隔序列可以是任一长度，只要该长度不阻止拷贝数的增加或降低。在一个优选实施方案中，核酸序列的串联拷贝之间无间隔序列存在。
术语“在核酸序列的5’和3’端的重复序列”在此定义为在编码目标多肽的核酸序列之5’端和3’端均存在的核苷酸序列。重复序列彼此之间可为同一方向(正向重复)或为相对方向(反向重复)。重复序列可为任一合适的长度，但优选约100-约1000bp，更优选约100-约500bp，最优选约100-约300bp。多肽术语“多肽”它包括肽、寡肽和蛋白质，所以，在本文并不限于特定长度的编码产物。多肽可以是对细胞而言天然的或异源性多肽。优选的是异源多肽。术语“异源多肽”被定义为对所述细胞来说不是天然的多肽。多肽可是野生型多肽或其变体。多肽也可是这样的重组多肽，其为细胞的天然多肽，其由含有一个或多个对于核酸序列而言为异源的控制序列之核酸序列所编码，其参与多肽的生产。编码多肽的核酸序列可以已经过如下所述的操作。在术语“异源多肽”的范围之内，本发明也包含这样的对于丝状真菌细胞而言内源性多肽的重组生产，使得这样的表达包括使用对于细胞而言非天然的遗传元件，或使用了经操作以在宿主细胞中非天然存在的方式行使功能的天然元件。多肽也可是一种杂合多肽，其含有从至少两种不同的多肽中获得的部分或完整多肽序列之组合，其中的一种或多种多肽对细胞而言可为异源的。多肽还包括上述多肽之天然存在的等位基因及基因工程变体。
在一个优选的实施方案中，所述多肽是抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或其变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报道分子或转运蛋白质。
在一个更优选的实施方案中，酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。
在一个更进一步优选的实施方案中，酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
在另一个更进一步优选的实施方案中，多肽是人胰岛素或其类似物、人生长激素、人第7因子、红细胞生成素、或促胰岛素(insulinotropin)。编码异源及重组多肽的核酸序列编码异源多肽的核酸序列可获自任何原核、真核或其它来源，如古细菌。为本发明的目的，术语“获自”如此处与给定的来源一起所用，是指多肽由该来源产生，或由其中已插入该来源的基因的细胞产生。
在本发明的方法中，细胞可用于对于细胞而言为天然的多肽的重组生产。天然多肽可重组地产生，如通过将编码多肽的基因置于不同的启动子控制之下以增加表达，通过使用信号序列促进目标天然多肽向细胞外的运输，以及通过增加编码该细胞天然产生的多肽之基因的拷贝数。本发明也包含这种天然多肽的重组生产。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，它们包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。从这样的基因组DNA克隆本发明的核酸序列可这样进行例如，通过应用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，检测具有共享结构特征的克隆化DNA片段。参见例如，Innis等，1990，“PCR方法和应用指南”(PCRA Guideto Methods and Application)，Academic Press，New York。可应用其它核酸扩增方法，例如，连接酶链反应(LCR)，连接活化的转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。克隆方法可包括含有编码多肽之核酸序列的目标核酸片段的切割与分离，将片段插入载体分子，将重组载体掺入细胞。核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的或任一组合。
术语“分离的核酸序列”如此处所用是指一种基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如如琼脂糖凝胶电泳所测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选至少约60％纯，甚至更优选至少约80％纯，最优选至少约90％纯。
可以用多种方法操作编码异源多肽的分离的核酸序列，以表达多肽。在核酸序列插入载体之前对核酸序列的操作是期望的或必需的，这取决于表达载体。利用克隆方法进行核酸序列修饰的技术为本领域周知。
编码多肽的核酸序列之修饰对于合成基本上与该多肽相似的多肽可能是必需的。术语与多肽“基本上相似”是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽从基因工程角度讲，可与从其天然来源分离的多肽不同。例如，可能希望利用诸如定点突变方法合成一种多肽的变体，其中变体在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同。类似序列可在编码该多肽之核酸序列基础上构建，和/或通过将这样的核苷酸置换导入，所述置换不会产生由核酸序列编码的多肽之另一种氨基酸序列，但是其相应于旨在用于产生酶的宿主生物之密码子偏好；或者通过导入可产生不同氨基酸序列的核苷酸置换。对于核苷酸置换的一般性描述，如见Ford等，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression and Purification)295-107。
可修饰核酸序列以制备表达盒，其中核酸序列可操作地与一种或多种控制序列连接，该控制序列在适于控制序列的条件下于适当的宿主细胞中指导编码序列的表达。应理解表达包括参与多肽产生的任一步骤，包括但不限于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及分泌。
“表达盒”在本文被定义为一种核酸分子(单链或双链的)，它是从天然存在的基因分离的，或者已被修饰以包含核酸的区段(该区段以自然界不存在的方式被组合和排列，且包含表达编码序列所需的全部控制序列)。术语“编码序列”在本文被定义为被转录成mRNA和被翻译成多肽的序列。基因组编码序列的边界一般是通过核糖体结合位点(原核)或通过ATG起始密码子(真核)(恰好位于mRNA的5′端处开放阅读框的上游)和转录终止子序列(恰好位于mRNA的3′端处开放约读框的下游)来确定的。编码序列可包括但不限于DNA、cDNA、RNA和重组核酸序列。
术语“控制序列”在本文被定义为包含对于多肽表达来说必要的或有益的所有组分。每种控制序列可以是对于编码多肽的核酸序列而言天然的或异源的序列。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、转录终止信号和翻译终止信号。控制序列可与接头一起提供，用以引入特异性限制位点，从而促进该控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接。术语“可操作地连接”在本文被定义为一种构型，其中，控制序列被适当地置于相对于DNA序列的编码序列的位置，以使该控制序列指导多肽的生产。
控制序列可以是合适的启动子序列、可被表达该核酸序列的丝状真菌细胞识别的核酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。所述启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，且可得自编码与宿主细胞同源的或异源的、胞外或胞内多肽的基因。
在细菌宿主细胞中指导表达盒转录的合适启动子实例有如下启动子大肠杆菌lac操纵子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌左聚蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院学报753727-3731)，及tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院学报8021-25)。更多的启动区在下面文章中有描述“来源于重组细菌的有用蛋白质”，科学美国人，1980，24274-94；和Sambrook等，1989，出处同前。
用于指导在丝状真菌宿主细胞中表达盒转录的适宜的启动子例子有得自编码下列酶的基因的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根粘菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根粘菌脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、Fusariumoxysporum胰蛋白酶样蛋白酶(美国专利4,288,627)，及其突变的、截短的和杂合启动子。特别优选的启动子是NA2-tpi启动子(一种得自编码黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子杂合体)。
在酵母宿主中，有用的启动子获自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶基因(ENO-I)，酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它可用于酵母宿主细胞的启动子见Romanos等人，1992，酵母8423-488中所述。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括病毒启动子，如来自猿猴病毒40(SV40)，劳氏肉瘤病毒(RSV)，腺病毒，牛乳头状瘤病毒(BPV)，及人巨细胞病毒(CMV)。
所述控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即，一种被宿主细胞识别而终止转录的序列。该转录终止子序列被可操作地连接到编码多肽的核酸序列的3′端。在所选宿主细胞中起作用的任一终止子都可被应用于本发明。
优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子得自编码下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
在酵母宿主中，优选的终止子获自编码如下酶的基因酿酒酵母烯醇化酶基因，酿酒酵母细胞色素C(CYC1)，或酿酒酵母甘油醛3-磷酸脱氢酶基因。其它可用于酵母宿主细胞的启动子见Romanos等人，1992，酵母8423-488中所述，出处同前。哺乳动物宿主细胞的终止子序列为本领域周知。
所述控制序列还可以是合适的前导序列，即mRNA的非翻译区，它对于宿主细胞的翻译是重要的。该前导序列被可操作地连接到编码多肽的核酸序列的5′端。在所选宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。
优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。
用于酵母宿主细胞中的适当的前导序列获自酿酒酵母烯醇化酶基因(ENO-I)，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因，酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)。
所述控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即一种这样的序列其被可操作地连接到所述核酸序列的3′端，并且当转录时，它被宿主细胞作为一个信号识别而添加聚腺苷残基到转录的mRNA。在所选宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。
优选的聚腺苷酸化序列得自编码下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列如Guo和Sherman 1995，分子细胞生物学155983-5990所述。对于哺乳动物宿主细胞的聚腺苷酸化序列是本领域人员周知的。
所述控制序列还可以是信号肽编码区，它编码与所述多肽的氨基端连接的氨基酸序列，所述多肽指导编码多肽进入细胞的分泌途径。所述核酸序列的编码序列的5′端可天然包含一个信号肽编码区，所述编码区符合翻译读框地与编码分泌型多肽的编码区段天然连接。所述编码序列的5′端也可能包含相对于该编码序列而言外源的信号肽编码区。如果所述编码序列通常不含信号肽编码区，所述外源信号肽编码区可能是需要的。或者，该外源信号肽编码区也可能仅仅替代天然信号肽编码区，以使多肽的分泌增加。信号肽编码区可得自曲霉属的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、根毛霉属(Rhizomucor)的脂酶或蛋白酶基因、酿酒酵母α-因子基因、芽孢杆菌属的淀粉酶或蛋白酶基因或牛前原凝乳酶基因。然而，任何指导表达的多肽进入所选宿主细胞分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。
在细菌宿主中有效的信号肽编码区是来源于以下基因的信号肽编码区芽孢杆菌NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因，地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因，地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)，或枯草芽孢杆菌prsA基因。更多的信号肽描述可见Simonen和Palva，1993，微生物学评论57109-137。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是获自以下基因的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)纤维素酶基因或柔毛腐质霉脂酶基因。
酵母宿主细胞的有用信号肽还可获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其它可用于酵母宿主细胞的信号肽见Romanos等人所述，1992，出处同前。
所述控制序列还可能是一个前肽编码区，它编码位于多肽的氨基端的氨基酸序列。生成的多肽被称为“酶原”(proenzyme)或“多肽原”[或在某些情况下被称为“酶原”(zymogen)]。多肽原一般是无活性的，可通过多肽原之前肽的催化分裂或自催化分裂，而从该多肽原转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可得自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO95/33836)。
如果信号肽区和前肽区二者都存在于多肽的氨基端，那么，前肽区位于邻近多肽的氨基端，信号肽区则位于邻近前肽区的氨基端。
所述编码多肽的表达盒还可能包括一个或多个其它核酸序列，这些核酸序列编码一个或多个对于指导多肽的表达有益的因子，例如，转录激活因子(诸如反式作用因子)、伴侣分子和加工蛋白酶。在所选宿主细胞中起作用的任一因子都可应用于本发明。编码一个或多个这些因子的核酸不必与编码异源多肽的核酸序列串联。
转录激活物是一种激活编码多肽的核酸序列转录的蛋白质(Kudla等，1990，EMBO Journal 91355-1364；Jarai和Buxton，1994，当代遗传学(Current Genetics)262238-244；Verdier.1990，酵母6271-297)。编码激活物的核酸序列可从编码以下的基因中获得嗜热脂肪芽孢杆菌NprA(nprA)，酿酒酵母血红素激活物蛋白质1(hap1)，酿酒酵母半乳糖代谢蛋白质4(gal4)，构巢曲霉氨调节蛋白质(areA)，米曲霉α-淀粉酶激活物(amyR)。更进一步的例子见Verdier.1990，出处同前，和MacKenzie等，1993，普通微生物学杂志(Journal of GeneralMicrobiology)1392295-2307。
陪伴分子是帮助另一多肽正确折叠的蛋白质(Hard等，1994，TIBS1920-25Bergeron等，1994，TIBS 19124-128Demolder等，1994，生物工程杂志(Journal of Biotechnology)32179-189；Craig，1993，科学，2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然，35533-45；Puig和Gilbert.1994，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)2697764-7771；Wang和Tsou，1993，The FASEB Journal 71515-11157；Robinson等，1994.Bio/Technology 1381-384；Jacobs等，1993，分子微生物学(Molecular Microbiology)8957-966)。编码陪伴分子的核酸序列可获自编码如下的基因枯草芽孢杆菌GroE蛋白质、枯草芽孢杆菌PrsA、米曲霉蛋白质二硫化物异构酶、酿酒酵母钙联结蛋白，酿酒酵母BiP/GRP78和酿酒酵母Hsp70。进一步的例子参见Gething和Sambrook，1992出处同前，和Hard等人，1994出处同前。
加工蛋白酶是切割肽原以产生成熟的生物化学活性多肽之蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母1067-79；Fuller等，1989，美国国家科学院院报，861434-1438；Julius等，1984，细胞，371075-1089；Julius等，1983，细胞，32839-852；美国专利No.5,702,934)。编码加工蛋白酶的核酸序列可获自编码如下的基因酿酒酵母二肽酰氨肽酶、酿酒酵母Kex2、Yarrowia lipolytica二碱基(dibasic)加工内切蛋白酶(xpr6)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)金属蛋白酶(p45基因)。
还可能希望添加调节序列，该调节序列能调节与宿主细胞的生长相关的多肽的表达。调节系统的实例有响应化学刺激物或物理刺激物(包括调节化合物的存在)而引起基因表达的开启或关闭的那些。原核系统中的调节系统包括lac、tac、trp操纵子系统。酵母中，可使用ADH2系统活GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKA α淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例有能使基因扩增的那些。在真核系统中包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码异源多肽的核酸序列将可操作地与该调节序列连接。
上述各种核酸序列和控制序列可被连接在一起而产生可能包含一个或多个合适的限制位点的重组表达载体，所述限制位点可供在这样的位点插入或替代编码多肽的核酸序列。所述核酸序列也可通过将该序列或上述包含该序列的表达盒插入用于表达的合适载体中来表达。在产生重组表达载体时，编码序列处于该载体中，使得该编码序列与用于表达和合适的控制序列可操作地连接。
所述重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，该载体可以方便地经历DNA重组操作而且能引起编码多肽的核酸序列表达。该载体的选择一般将取决于该载体与该载体被引入的宿主细胞的相容性。该载体可以是线形质粒或闭合环状质粒。该载体可以是自主复制型载体，即，一种作为染色体外的实体存在的载体，它的复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。所述载体可包含保障自主复制的任何方法。或者，该载体也可以是这样的载体当引入宿主细胞时，它被整合入基因组并与其所整合入的染色体一起复制。所述载体系统可以是单一的载体或质粒，或者是两种或多种载体或质粒，它们共同包含将待导入宿主细胞基因组的全部DNA，或者是一种转座子。
所述载体优选包含一种或多种允许容易地选择转化的细胞之选择性标记。一种选择性标记是一种基因，它的产物可提供杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷体的原养型等。细菌可选择性标记的例子是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素抗性(amp)、卡那霉素抗性(kan)、氯霉素抗性(cam)、或四环素抗性(tet)的标记。用于哺乳动物细胞的适宜标记是二氢叶酸还原酶(dfhr)、潮霉素磷酸转移酶(hygB)、氨基糖苷磷酸转移酶II及腐草霉素抗性基因。适于酵母宿主细胞中的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记可选自包括但不限于下组的物质amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(phosphinothricin乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及得自其它种的等同物。
所述载体优选包含这样的元件，即，该元件允许所述载体整合入宿主细胞基因组或所述载体在该细胞中独立于该细胞的基因组而自主复制。
就整合入宿主细胞的基因组来说，所述载体可能依靠编码多肽的核酸序列或者该载体的任何其它(通过同源重组或非同源重组将该载体稳定整合入基因组的)元件。或者，该载体也可能包含用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组的另外的核酸序列。该另外的核酸序列能使载体整合入染色体的准确位置上的基因组。为了增大准确位置上整合的可能性，整合性元件应优选包含足够量的核酸，例如至少100～10,000个碱基对，优选至少400～10,000个碱基对，最优选至少800～10,000个碱基对，它们与相应的靶序列是高度同源的，从而提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件还可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组被整合入宿主细胞的基因组。
就自主复制来说，所述载体可进一步包含一种复制起点，它能使该载体在所述丝状真菌细胞中自主复制。细菌来源的复制起点例子是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYCl77和pACYC 184及允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。在酵母宿主中所用的复制起点是2μ复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的复制起点组合、及ARS4与CEN6的组合。复制起点可是一个具有使其在宿主细胞中的功能为温度敏感型的突变的复制起点(见如，Ehrlich，1978，美国国家科学院院报751433)。
用于连接本文描述的因子而构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，“分子克隆，实验手册”，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。细胞本发明方法可用任何含有编码目标多肽的核酸序列之细胞，包括原核细胞如细菌，或真核细胞如哺乳动物、昆虫、植物和真菌细胞。细胞可为野生型或突变细胞。例如，突变细胞可是经历传统诱变或遗传操作的细胞。此外，细胞可为重组细胞，包括编码如此处定义的异源多肽之核酸序列，其有益地用于异源多肽之重组生产。
有用的原核细胞是细菌细胞如，革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属的细胞，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus lautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。或链霉菌属的细胞，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌及假单胞菌属的种(Pseudomonas sp.)。
在一个优选实施方案中，细胞是真菌细胞。“真菌”如此处所用包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(Hawksworth等，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版所述，1995，CABinternational.University Press，Cambridge，UK)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，出处同前中所述，171页)以及所有有丝分裂孢子型(mitosporic)真菌(Hawksworth等，1995出处同前)。代表性的子囊菌门包括例如，链孢菌属(Neurospora)，真青霉属(Eupenicillium＝青霉属(Penicillium))，裸孢壳属(Emericella，＝曲霉属)，散囊菌属(Eurotium，＝曲霉属)以及真酵母。担子菌门的代表性组包括蘑菇，锈菌属及黑粉菌属。壶菌门的代表性组包括如异水霉属(Allomyces)，小芽枝霉属(Blastocladiella)，雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌门的代表性组包括如水霉属(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉)如绵霉属(Achlya)。有丝分裂孢子型真菌包括链格孢属(Alternaria)、曲霉属、假丝酵母属(Candida)和青霉属。结合菌门的代表性组包括毛霉菌属(Mucor)、和根霉属(Rhizopus)。
在一个优选实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。此处所用“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母和属于半知真菌的酵母(Blastomycetes)。产子囊酵母可分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括四个亚科裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae，如裂殖酵母属的种(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae，如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)的种)。产担子孢子囊酵母包括线状黑粉菌属(Filobasidiella)、Filobasidium、白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和锁掷酵母属(Sporidiobolus)。属于半知真菌的酵母分为两个科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae，如布勒掷孢酵母属(Bullera)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)的种)和隐球酵母科(Cryptococcaceae，如假丝酵母属(Candida)的种)。由于酵母的分类在将来可能改变，对于本发明，可将酵母如酵母生物学及活性(Skinner等，1980，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述定义。酵母的生物学及酵母遗传学操作为本领域公知。(见如酵母生物化学及遗传学(Biochemistry and Genetics of Yeast)，Bacil，M.，Horecker，B.J.及Stopani，A.O.M.编第2版，1987；酵母(The Yeasts)，(Rose，A.H.，和Harrison，J.S.编)第2版，1987；及酵母属酵母的分子生物学(TheMolecular Biology of the Yeas Saccharomyces)，Strathern等，编1981)。
在一个优选实施方案中，酵母细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia属的菌株。
在一个最优选的实施方案中，酵母细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。在另一最优选的实施方案中，酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一最优选的实施方案中，酵母细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一优选实施方案中，真菌细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有真菌门(Eumycota)及卵菌门(Oomycota)分类中的全部丝状形式(如Hawksworth等，1995，出处同前)。丝状真菌的一般特征为菌丝体壁由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖及其它复合多糖组成。营养性生长是通过菌丝伸长，且碳源代谢是需氧型。相反，酵母的营养性生长如酿酒酵母是通过单核菌体的出芽，且碳源代谢可以是发酵型。在一个更优选的实施方案中，丝状真菌细胞是如下，但不限于此的属的种支顶孢属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium及木霉属(Trichoderma)菌株。
在更优选实施方案中，丝状真菌是支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属细胞。
在最优选实施方案中，丝状真菌是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一优选实施方案中，丝状真菌细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、并孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum细胞。在另一优选实施方案中，丝状真菌细胞是Humicola insolens、柔毛腐质霉、米黑毛霉(Mucormiehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)或Thielavia terrestris细胞。在另一优选实施方案中，丝状真菌细胞是Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
有用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、幼豚鼠肾细胞(BHK)、COS细胞或任一数量的可得永生化细胞，如获自美国典型培养物保藏中心。核酸构建体在本发明的方法中，将核酸构建体在这样的基因座中导入亲本细胞的基因组中，所述基因座不在编码目标多肽的核酸序列之中。或者，将核酸构建体在这样的基因座中导入亲本细胞，所述基因座位于核酸序列之串联拷贝的一个中，或者位于含有重复序列的核酸序列中。
核酸构建体可为单链或双链的任一核酸分子，其可为合成DNA，从天然基因分离的或经过修饰以含有这样的核酸区段，所述区段以不会天然存在的方式结合且并列。核酸构建体可为线性或环状。此外，核酸构建体可含于载体中，可为限制性酶切割的线性化片段，或可为PCR扩增的线性片段。
核酸构建体可含有任意大小的任何核酸序列。在一个实施方案中，核酸构建体长度为约10-20000bp之间；优选长度约100-15000bp，更优选长度约500-15000bp，甚至更优选长度约1000-15000bp，最优选长度约1000-10000bp。
核酸构建体可作为两个或更多的分离片段导入细胞。在使用两个片段的情况中，两个片段在一个片段的3’端及另一个的5’端共有足够长的核酸序列同源性(重叠)，以使两个片段一经导入细胞即可经历同源重组，形成单一片段。然后产物片段成为适于与细胞序列重组的形式。可使用两个以上的片段，这些片段经设计使得其相互之间经历同源重组，最终形成适于与细胞序列重组的形式。
应当知晓，两个或更多的核酸构建体可以用本发明的方法以环状或线性的形式被导入细胞，其中片段不含有如上述的重叠区。本领域周知，对于有些生物，多种构建体向细胞的导入可导致其整合于同一基因座。
核酸构建体可含有编码或非编码DNA序列。编码序列如此处定义。
在一个优选实施方案中，核酸构建体含有选择性标记。所述选择性标记的实例如前面所述。
在一个优选实施方案中，构建体仅含有载体序列或是含有与选择性标记结合的载体序列，包括含有复制起点的载体序列，如大肠杆菌载体序列(如pUCI9，pBR322或pBluescript)。例如一种含有复制起点的大肠杆菌载体，由于大肠杆菌的复制起点可促进整合后从宿主基因组中回收构建体。用限制性内切酶消化基因组DNA后可从宿主基因组中回收构建体，随后是连接回收的构建体并转化大肠杆菌。
在另一个优选实施方案中，核酸构建体不含有多肽或其部分的核酸序列之编码序列。在一个优选实施方案中，核酸构建体含有与编码多肽的核酸序列不同源的序列，以阻止构建体整合或破坏核酸序列。
优选地，核酸构建体与编码目标多肽的核酸序列的同源性不超过40％，优选地不超过30％，更优选地不超过20％，甚至更优选地不超过10％，最优选地无同源性。为本发明之目的，两个核酸序列的同源性这样测定通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美国国家科学院院报，80726-730)测定的，即应用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，采用同一性表和下列序列多重对比参数间隙罚(gap penalty)为10，并且间隙长度罚(gap length penalty)为10。成对对比参数为Ktuple＝3，间隙罚＝3，窗(windows)＝20。
在另一优选实施方案中，核酸构建体含有至少一个多肽或其部分的核酸序列之拷贝。在另一优选实施方案中，核酸构建体含有与编码多肽之核酸序列同源的序列。
当含有一个或多个编码目标多肽之核酸序列拷贝的核酸构建体导入细胞，拷贝数的增加大于导入构建体之前细胞内核酸序列拷贝数与导入细胞中的构建体内的核酸序列拷贝数之和。或者，当含有一个或多个编码目标多肽之核酸序列的拷贝之核酸构建体导入细胞，拷贝数的减少大于导入构建体之前细胞内核酸序列拷贝数与导入细胞中的构建体内的核酸序列拷贝数之和。但是，可能需要以例如独特性限制酶位点的方法标记包含于构建体内的核酸，使得可鉴定实际上整合入细胞基因组的构建体之序列拷贝数。
在另一优选实施方案中，核酸构建体含有可转移元件，即转座子。一个转座子是一种DNA分离片段，其可自身插入同一细胞的其它DNA序列中的不同位点。转移过程中必须的蛋白质在转座子中编码。转座子的末端通常是相同但是为彼此相反的方向。
在一个优选实施方案中，核酸构建体可含有一种或多种控制序列，如启动子自身或与选择性标记一起，其中控制序列经整合不与编码目标多肽的核酸序列可操作地连接。这类控制序列可为启动子、信号序列、原肽序列、转录终止子、聚腺苷酸化序列、增强子序列和衰减子序列和内含子剪接位点序列。每一控制序列对细胞或编码多肽的序列而言可为天然的或异源的。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体含有除了启动子之外的控制序列。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体不含有控制序列。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体是pDSY82、pDSY112、pMT1612、pMT1936、pLRF2、pDSY153或pHB218。核酸构建体导入细胞可通过本领域周知的多种物理或化学方法将核酸构建体导入细胞，包括但不限于转染或转导、电穿孔、显微注射、微颗粒轰击、碱盐或原生质体介导的转化。
核酸构建体向细菌宿主细胞的导入可例如，通过原生质体转化(见如，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学(Molecular GeneralGenetics)，168111-115)，利用感受态细胞(见如，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志(Journal of MolecularBiology)，56209-221)，通过电穿孔(见如，Shigekawa和Dower，1988.生物技术(Biotechniques)，6742-751)，或通过偶联(见如，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志，1695771-5278)等方法实现。
用于转化曲霉属细胞的适当方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，美国国家科学院院报811470-1474。用于转化镰孢属细胞的适当方法描述于Malardier等，1989，基因78147-156，和WO 96/00787。
可利用Becker和Guarente，酵母遗传学及分子生物学指南(Guide toYeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methods ofEnymology)，194182-187；Ito等，1983，细菌学杂志，153163；及Hinnen等，1978，美国国家科学院院报，751920中所述转化酵母。
可利用Graham和Van der Eb，1978，病毒学，52546中磷酸钙沉淀法直接摄取转化哺乳动物细胞。也可使用其它本领域已知的方法如电穿孔。
当核酸构建体为载体时，取决于所选细胞通过同源和/或非同源重组随机发生整合入细胞基因组。
核酸构建体通过限制酶介导的整合(REMI)可导入亲本细胞，REMI这种方法描述于Schiestl和Petes，1991，美国国家科学院院报，887585-7589，这种方法是将用限制性酶消化的质粒DNA与限制性酶一起导入细胞，随后导致质粒DNA常常在由附加限制性酶限定的位点处整合入基因组。REMI的优点在于其可产生这样的突变，即突变的分子基础可被容易的鉴别。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体以环状分子的形式导入亲本细胞。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体以载体的一部分的形式导入亲本细胞。
在另一优选的实施方案中，核酸构建体以线性片段的形式导入亲本细胞。突变细胞的筛选将核酸构建体导入细胞后，下一步是从预计突变细胞的群落中分离出具有改变的目标核酸序列拷贝数之突变细胞，其中当在同一条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽。突变细胞的分离优选最初通过测量在同一条件下培养亲本细胞和突变细胞时，相对于亲本细胞突变细胞产生的多肽。突变细胞的分离可包括本领域周知的针对多肽的方法和/或用于测定核酸序列拷贝数的方法。用于测定基因拷贝数的方法为本领域周知，且包括Southern分析、定量PCR或实时PCR。
通过将核酸构建体导入生物体细胞中获得的推定突变体群落首先利用标准铺板技术进行纯化，如那些用于经典诱变的技术(见如，Lawrence，C.W.，1991，Christine Guthrie及Gerald R.Fink编，酶学方法，194卷，273-281，Academic Press，Inc.，San Diego)，单孢子分离，或加富技术。标准铺板技术优选地与检测期望的多肽之方法一起使用。但是，无论用于鉴定带有目标多肽之突变细胞的方法是否与铺板培养物一起使用，经纯化的推定突变株优选进一步表征，以证实由核酸序列编码之多肽产生的增加或减少。此外，还期望核酸序列拷贝数的测定，以证实多肽产生的增加或减少是核酸序列拷贝数改变的结果。
可通过本领域已知的针对多肽的检测方法鉴定特定多肽产生增加的突变细胞。多肽检测的方法包括但不限于特异性抗体的使用，通过测定酶产物的形成或酶底物的减少测定酶活性，在含有酶底物的琼脂平板上的透明区带及生物活性检测。
在一个优选实施方案中，与亲本细胞相比突变细胞产生的多肽的量高出或多出至少20％，优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，更优选至少100％-1000％，甚至更优选至少200％-1000％，最优选至少500％-1000％。
可利用上述相同的针对多肽的方法鉴定不再能产生特定多肽或产生能力降低的突变细胞，其中相比于亲本细胞，测量的产量为零或降低。
在一个优选实施方案中，与亲本细胞相比突变细胞产生的多肽的量降低至少20％，优选至少50％，更优选至少75％，最优选至少100％。基因座在本发明的方法中，可在“目标核酸序列之外的基因座”中导入核酸构建体是指未将核酸构建体导入多肽编码序列、其控制序列或核酸序列编码序列内的任意内含子序列中。当间插序列存在于核酸序列串联拷贝之间时，可将构建体导入这些间插序列中。或者，在本发明的方法中，核酸构建体可被导入“目标核酸序列之内的基因座”中，这是指将核酸构建体导入多肽编码序列、其控制序列或核酸序列编码序列内的任意内含子序列中。
控制序列包括与核酸序列可操作地连接且参与多肽产生的所有组分。这些控制序列包括但不局限于如此处所述的启动子、信号序列、原肽序列、转录终止子、前导序列和聚腺苷酸化序列。每一控制序列相对于编码序列可为天然的或异源的。
当基因座不在目标核酸序列之内时，基因座可与上述控制序列相邻或不相邻。优选地，基因座是不相邻的。基因座可与目标核酸序列处于同一染色体或同一染色体外元件，或处于不同染色体或不同染色体外元件。此外，基因座对细胞来说可为天然的或异源的。
在一个优选实施方案中，基因座距离核酸序列的5’或3’末端至少100bp，优选至少1000bp，更优选至少2000bp，甚至更优选至少3000bp，更加优选至少4000bp，最优选至少10,000bp。
在另一个优选实施方案中，基因座与编码目标多肽的核酸序列位于不同的染色体上。
在另一个优选实施方案中，基因座编码之多肽不同于由核酸序列编码的多肽。
在另一个优选实施方案中，基因座是编码多肽的核酸序列。用插入的核酸构建体营救基因座及靶向构建体的用途本发明还涉及用插入的核酸构建体恢复(rescue)基因座的方法，包括从鉴定的突变细胞中分离(i)核酸构建体，及(ii)基因组的基因座之3′和5′侧翼区，所述基因座中整合了核酸构建体；以及鉴定基因座之3′和5′侧翼区。
可通过本领域周知的方法如用限制性酶切和随后的连接及大肠杆菌转化，反向PCR、随机引物基因步移(walking)PCR或探查突变细胞文库等方法分离核酸构建体和侧翼区。带有或不带有3′和5′侧翼区之分离的核酸构建体在此称为“靶向构建体”。
靶向构建体包括距离核酸构建体整合位点上游和/或下游之间的100-9000bp，优选200-9000bp，更优选500-7000bp，甚至更优选1000-7000bp，最优选1000-3000bp。
本发明靶向构建体可被导入不同的细胞以改变多肽的产生，所述多肽与原初细胞中修饰的多肽类似、相同或完全不同。其他细胞可与原初细胞相同或属于不同的种或不同的属。如果原初细胞是真菌细胞，其他细胞优选为真菌细胞。如果原初细胞为细菌细胞，则其他细胞优选为细菌细胞。如果原初细胞为哺乳动物细胞，则其他细胞优选为哺乳动物细胞。
当细胞为不同的细胞时，靶向构建体的整合优选发生在这样的靶基因座，其与该靶向构建体来源的原初细胞之基因座序列同源，即相同或足够相似，使得靶向构建体和细胞DNA可经历同源重组，产生期望的突变。因此，靶向构建体的序列优选与将进行同源重组之细胞染色体DNA的预选位点同源。但是，应当为本领域普通技术人员知晓，靶向构建体重新于靶基因座位点插入的概率取决于细胞，因为同源重组的频率范围可从酿酒酵母这样的酵母中几乎100％，变化到低至在曲霉属中的1％。靶向构建体可通过非同源重组在非靶定基因座中整合，造成编码目标多肽的核酸序列拷贝数的改变。
优选地，靶定基因座包括具有与靶向构建体的侧翼序列有高于40％同源性，优选高于60％，更优选高于70％，甚至更优选高于80％，最优选高于90％的同源性之DNA序列。两个序列之同源性程度可用此处所述的Wilbur-Lipman方法测定。
靶向构建体可含有3’和5’区的任一个或二者均有，这取决于期望单一交叉或是替换。此外，可修饰靶向构建体以校正任何差错事件，如重排、重复序列、删除或插入，这些差错发生在原初核酸构建体于基因座处导入并整合入细胞基因组的过程，该原初序列最初从该基因座恢复。
上述靶向构建体可以如限制性酶切割的线性核苷酸序列形式使用，或可被环化或插入适当的载体。例如，环状质粒或DNA片段优选地采用单靶定序列。线性质粒或DNA片段优选地采用两个靶定序列。靶向构建体一经导入细胞(所述细胞含有编码目标多肽之核酸序列)，就在靶基因座或在非靶基因座(但优选靶基因座)处整合入细胞的基因组，其可位于编码目标多肽之核酸序列之内或之外。靶基因座可与目标DNA序列位于相同染色体或相同染色体外元件，或位于不同染色体或不同染色体外元件。当在相同条件下培养突变细胞及亲本细胞时，相对于亲本细胞，整合改变了编码多肽之核酸序列的拷贝数。在一个优选实施方案中，靶向构建体含有选择性标记。
任选地，靶向构建体可以以两个或多个分离的片段形式导入细胞。例如，当使用两个片段时，片段间共有在一个片段3’端及另一个片段5’端同源(重叠)的DNA序列，两个片段中一个携带第一靶定序列，另一个携带第二靶定序列。一经导入细胞，两个片段可经历同源重组，形成具有侧翼为两个原初片段之间的重叠区的第一及第二靶定序列之单一片段。产物片段然后呈适于同细胞靶序列同源重组的形式。可使用两个以上经设计的片段，使得其彼此间可经历同源重组，最终形成适于与细胞靶序列同源重组的产物。
一旦靶向构建体导入细胞，靶向构建体可通过包含一种可扩增的选择性标记被进一步扩增，所述选择性标记具有这样的性质，即通过在适当选择剂存在下培养细胞，以选择含有选择性标记扩增拷贝的细胞。
在一个优选实施方案中，将一个或多个靶向构建体导入靶基因座。在另一个优选实施方案中，每个靶向构建体改变编码不同多肽之另一个核酸序列的拷贝数。在另一个优选实施方案中，两个或多个靶向构建体一起导入靶基因座，叠加性地或协同地作用，以改变编码多肽之核酸序列的拷贝数。培养突变细胞及回收多肽的方法利用本领域周知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养目标多肽产生升高或降低的所选突变细胞。例如，细胞可通过摇瓶培养法培养，通过在合适的培养基中在使所述多肽能被表达和/或分离的条件下进行的、在实验室用发酵罐或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、间歇发酵、补料分批发酵或固态发酵)培养。该培养是应用本领域已知的方法在合适的营养培养基(包含碳源和氮源和无机盐)(参见如Bennett.J.W.和LaSure，L.，编，真菌基因操作增编(More GeneManipulations in Fungi)，Academic Press，CA.1991)中进行的。合适的培养基可从供应商获得或者可按公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心的产品目录)制备。如果多肽分泌的话可直接从培养液中回收多肽。如果多肽未被分泌，则从细胞裂解物中回收。
可利用针对多肽的本领域周知的方法，如早先描述的那些方法或在实施例中描述的方法检测多肽。
可通过本领域周知的方法回收多肽。例如，可通过包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规方法从营养培养液中回收所述多肽。
可通过本领域已知的各种方法进一步纯化多肽，这些方法包括但不限于层析法(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)，电泳法(例如制备型等电聚焦)，差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)，或者提取(参见例如，“蛋白质纯化”(Protein Purification)，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。获得突变细胞的方法本发明还设计一种获得突变细胞的方法。
在第一个实施方案中，获得突变细胞的方法包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列拷贝之外的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的增加不是选择压力的结果；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，鉴定比亲本细胞产生更多的多肽的突变细胞。
在第二个实施方案中，获得突变细胞的方法包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列拷贝之外的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中降低了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的降低不是选择压力的结果；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，鉴定比亲本细胞产生更少的多肽的突变细胞。
在第三个实施方案中，获得突变细胞的方法包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列拷贝之一内的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的增加不是选择压力的结果；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，鉴定比亲本细胞产生更多的多肽的突变细胞。
在第四个实施方案中，获得突变细胞的方法包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列拷贝之一内的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中降低了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的降低不是选择压力的结果；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，鉴定比亲本细胞产生更少的多肽的突变细胞。
在第五个实施方案中，获得突变细胞的方法包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体在核酸序列拷贝之外的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，所述核酸序列在该核酸序列之5’和3’端含有重复序列，其中将核酸构建体整合入基因座中增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，鉴定比亲本细胞产生更多的多肽的突变细胞。
本发明通过下面的不应理解为限制本发明范围的实施例进一步描述。
PDA含有39g/l马铃薯葡萄糖琼脂(Difco)，除非有其它特别注明，对pyrG营养缺陷型补加10mM尿苷。
pH 6.5的MY25培养基每升由25g麦芽糖，2.0g MgSO47H2O，10gKH2PO4，2.0g柠檬酸，10g酵母提取物，2.0g K2SO4，2.0g尿素和0.5ml微量金属溶液组成。MY25摇瓶培养基用玻璃蒸馏水以1∶100或1∶1000稀释，用于微量滴定生长实验(MY25/100或MY25/1000)。培养物在34℃生长。
2X MY盐(pH 6.5)溶液每升由4g MgSO47H2O，4g K2SO4，20gKH2PO4，4g柠檬酸，1ml微量金属及2ml CaCl22H2O(100g/l储藏原液)组成。
基本培养基转化平板每升由6g NaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，1ml微量金属溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O，342.3g蔗糖及20g的Noble琼脂(pH 6.5)组成。基本培养基转化平板(pH6.5)每升由6gNaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，1ml微量金属溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O，及20g的Noble琼脂组成。
微量金属溶液(1000X)每升由22g ZnSO4-7H2O，11g H3BO3，5gMnCl24H2O，5g FeSO47H2O，1.6g CoCl25H2O，1.6g(NH4)6Mo7O24，及50g Na4EDTA组成。
COVE平板每升由343.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10ml 1M乙酰胺，10ml 3M CsCl及25g Nobel琼脂。COVE微量金属盐(50X)溶液每升由26g KCl，26g MgSO47H2O，76g KH2PO4和50ml COVE微量金属溶液组成。COVE微量金属溶液每升由0.04g NaB4O710H2O，0.040gCuSO45H2O，0.70g FeSO4H2O，0.80g Na2MoO22H2O及10g ZnSO4组成。
YEG培养基每升由5g酵母提取物及20g葡萄糖组成。
BASTA平板每升含有342.3g蔗糖，20ml COVE盐溶液，10ml 1M尿素，25g Noble琼脂及5mg/ml终BASTA浓度，用于筛选转化子。用于BASTA转化的上层平板具有上述BASTA平板的相同组分。BASTA转移平板同上，只是含有10mg/ml BASTA。实施例1米曲霉HowB430的构建构建含有来自柔毛腐质霉(LIPOLASETMgene，Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)的脂酶基因的米曲霉HowB430。
如下述构建含有TAKA/NA2-tpi前导杂合启动子，来自柔毛腐质霉的脂酶基因，AMG终止子以及作为选择标记的全长构巢曲霉amd S基因的pBANe8。
利用PCR，采用下面的引物1及2插入位于pToC90(Christensen等，1988，生物工程学，61419-1422)全长amd S基因侧翼之NsiI位点，采用下面的引物3及4在pJaL292(图1)NA2-tpi前导杂合启动子的5’端插入EcoRI位点，在其3’端插入SwaI位点。用Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)根据制造商说明合成引物。引物1S′-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3′引物25′-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3′引物35′-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3′引物45′-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3′利用约0.2μg的pToC90或pJaL292作为模板准备扩增反应(100μl)。每一反应含有如下成分0.2μg质粒DNA，48.4pmol正向引物，48.4pmol反向引物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1 mM，1x Taq DNA聚合酶缓冲液，及2.5U TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反应在Ericomp热循环仪中以如下程序进行温育95℃5分钟一个循环，随后为30次循环95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，证实存在2.7kb的amdS片段及0.6kb的NA2-tpi片段。
PCR产物随后按照制造商指示利用TA克隆试剂盒(Invitrogen，SanDiego，CA)亚克隆入pCRII。然后通过按照制造商指示利用QIAwell-8质粒试剂盒(Qiagen.Inc..Chatsworth，CA)从转化子中提取质粒DNA，筛选转化子。然后用NsiI或EcoRI/SwaI限制性消化质粒DNA，通过琼脂糖电泳证实分别存在2.7 kb和0.6 kb的NsiI amdS片段与SwaI/EcoRI NA2-tpi片段。为证实PCR产物，将产物用Applied Biosystems Model373A自动DNA测序仪(Applied Biosystems.Inc.，Foster City，CA)利用引物步行技术对产物的两条链测定序列(Giesecke等，1992，病毒学方法杂志，3847-60)，所述技术利用染料终止化学法采用了M13反向(-48)和M13正向(-20)引物(New England Billabs，Beverly，MA)，及对待测序的DNA特异的引物。来自正确转化子的质粒然后用限制性酶消化，对经消化的质粒在1％琼脂糖凝胶上分离，按照制造商指示用FMC SpinBind试剂盒(FMC，Rockland，ME)纯化。
含有TAKA淀粉酶启动子、多接头、AMG终止子及构巢曲霉pyrG基因的pKS6(图2)经EcoRI和SwaI酶切以去除TAKA淀粉酶启动子。该区域用NA2-tpi PCR产物替代，以产生pBANe 13(图3)。
用NsiI消化pBANe 13以去除构巢曲霉pyrG基因。该区域用上述全长amdS基因PCR产物替代，以产生pBANe 6(图4)。
采用如下引物5和6由PCR将SwaI和PacI位点插入全长pMHan37的柔毛腐质霉脂酶基因(图5)的侧翼引物55’-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3’引物65 ′-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3’扩增反应(100μl)含有如下成分0.2μg的pMHan37，48.4pmol引物5，48.4pmol引物6，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，1x TaqDNA聚合酶缓冲液，及2.5U TaqDNA聚合酶。反应在Ericomp热循环仪中以如下程序进行温育95℃5分钟一个循环，随后为30次循环95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟。2μl反应产物在琼脂糖凝胶中电泳，证实约900bp的脂酶基因产物的扩增。
将PCR扩增的脂酶基因产物随后利用TA克隆试剂盒亚克隆入pCRII。然后通过利用QIAwell-8质粒试剂盒从转化子中提取质粒DNA，筛选转化子。用SwaI/PacI限制性消化质粒DNA，根据上述方法进行DNA测序以证实PCR产物。
通过用SwaI和PacI消化将脂酶基因从pCRII质粒中切出，随后亚克隆入SwaI/PacI消化的pBANe6中得到pBANe8(图6)。
用PmeI消化pBANe8，然后利用40mM Tris-乙酸-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液进行制备型琼脂糖电泳，分离含有NA2-tpi启动子的线性PmeI片段、柔毛腐质霉的脂酶基因以及AMG终止子。
通过按照如下方法用线性PmeI片段转化米曲霉HowB425得到米曲霉HowB430。
在100毫升1％酵母提取物-2％蛋白胨-1％葡萄糖中32℃下以150转/分搅拌培养米曲霉HowB425 16-18小时。经0.45毫米滤膜过滤回收菌丝体，直到约10毫升留在滤膜上。用25毫升1.0-1.2M MgSO4-10mM磷酸钠(pH6.5)洗涤，如前述过滤，再次如前述洗涤，直至剩余10毫升，然后在125毫升Ehrlenmeyer烧瓶中重悬于10毫升的5mg/ml NOVOZYM 234TM(Novo Nordisk A/S.Bagsvaerd.，丹麦)(1.2M MgSO4-10mM磷酸钠，pH6.5(0.45微米)过滤的溶液)。悬浮液在50转/分的温和搅拌下于37℃温育约1小时，以产生原生质体。将10毫升体积的原生质体/菌丝体制品加入30毫升Corex离心管，覆盖以5毫升0.6M山梨醇-10mM Tris-HCl pH 7.5，在大容量转头架中以3600×g离心15分钟，回收原生质体。用巴氏吸液器从缓冲液交界面回收原生质体。然后用5倍体积的STC洗涤，离心，再次洗涤并如前述离心。将原生质体重悬于STC至终浓度为每毫升2×107原生质体。
米曲霉HowB425转化的amdS筛选用浓度为2×107/毫升原生质体进行。10μgDNA加入100毫升原生质体中。然后加入体积为250毫升的PEG溶液(60％PEG 4000-10mMCaCl2，-10mM Tris-HCl pH 8.0)，混合物于37℃放置30分钟。加入3毫升1M山梨醇-10mM CaCl2-10mM Tris pH 7.5(STC)，将混合物铺板于补加用于amd S筛选的10mM尿苷之Cove平板。将平板于34℃温育7-10天。将转化子转移到相同培养基的平板，于37℃温育3-5天。在相同条件下采用相同培养基(无蔗糖)的平板通过孢子划线法挑选分离的菌落，纯化转化子。实施例2质粒pSO122、pDSY81及pDSY82的构建如下述构建质粒pSO122，以含有米曲霉pyrG基因的1.5kb片段。
从米曲霉1560基因组文库构建pSO2(图7)。米曲霉1560的基因组文库首先通过用Sau3A(New England Biolabs.Beverly，MA)部分消化米曲霉1560基因组DNA构建。按照制造商推荐的条件采用4单位Sau3A消化10μg米曲霉1560基因组DNA。反应在65℃进行，以5分钟间隔取样(从0-50分钟)。将样品置于冰上，通过加入10μM的EDTA终止反应。将这些消化物于带有溴乙啶的1％琼脂糖凝胶上电泳，切出含有3kb-9kbDNA的凝胶。使用由制造商提供的方法(New England Biolabs.Beverly，MA)利用Beta-Agarase I从凝胶切块中纯化DNA。按照制造商指示(Clontech.Palo Alto，CA)在制造商推荐的条件下于16℃过夜，将所选大小的DNA连接入EMBL4手臂。依制造商的方法利用Gigapack II包装试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将连接反应物包装并滴定。总共获得16000个重组噬菌斑，利用制造商提供的方法扩增文库。
如EMBL 4手臂所提供的方法中所述，将基因组文库适当稀释以获得每150mm培养皿7000个噬菌斑。采用标准方法(Sambrook等，1989，出处同前)将噬菌斑转移至Hybond-N+环状滤膜(Amersham.Cleveland.OH)。利用UV交联固定滤膜，并在42℃预杂交(5X SSPE，35％甲酰胺)。用由黑曲霉pyrG构成的500bp片段以低严谨度(35％甲酰胺，5X SSPE，42℃)探查基因组文库，所述片段用随机引物DNA标记试剂盒(BoebringerMannheim，Indianapolis.IN)以32P标记。从一个噬菌斑中分离到3.8 kbHindIII片段，亚克隆入pUC 118克隆载体，制备pSO2。
利用如下所示引物7和8，采用PCR将BamHI限制性位点导入pSO2的pyrG基因之5’端，产生pSO122。引物7和8以制造商指示用AppliedBiosystems Model 394 DNA/RNA合成仪合成。
引物75′-GCGGGATCCCTAGAGTAGGGGGTGGTGG-3′引物85′-GCGGGATCCCCCCTAAGGATAGGCCCTA-3’
扩增反应(50μl)含有如下成分2ng pSO2，48.4pmol正向引物，48.4pmol反向引物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，1x Taq DNA聚合酶缓冲液，及2.5U TaqDNA聚合酶。反应在Ericomp热循环仪中以如下程序进行温育95℃5分钟一个循环，随后为30次循环95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。
用BamHI消化分离的PCR单于，并克隆入pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的BamH I位点，产生pSO122(图8)。米曲霉HowB430和pSO122基因组之间的仅有的同源性在pyrG插入片段的5’端，因为其余pyrG片段如实施例1所述被从米曲霉HowB430中删除。
为了降低针对基因组该同源性区域的靶定频率且由于pSO122含有两个BamHI位点，构建了两个pSO122的衍生物pDSY81和pDSY82(图8)，其中的一个BamHI位点被破坏。通过用BamHI部分消化pSO122，用Klenow片段补平5’悬垂，经连接关闭质粒，构建pDSY81和pDSY82，然后转化入大肠杆菌DH5α(Sambrook等，1989，出处同前)。然后通过使用QIAwell-8质粒试剂盒提取质粒DNA筛选转化子，用BamHI限制性消化质粒DNA确定是否一个BamHI位点已被破坏。具有一个BamHI位点已被破坏的质粒用NsiI/BamHI消化，以测定哪一个BamHI位点已被破坏。实施例3用pSO122、pDSY81或pDSY82转化米曲霉HowB430如实施例1所述制备米曲霉HowB430的原生质体。将5-15μl的DNA等份(用4-12 U的EcoRI使环状pSO122和pDSY81线性化，或用15UBamH I使pDSY82线性化)加入14毫升Falcon聚丙烯管中的0.1毫升原生质体中(原生质体浓度2×107/毫升)，然后加入250μl 60％PEG4000-10mMCaCl2-10mM Tris-HCl(pH7)，温和混匀，于37℃温育30分钟。转化可用5μg环状pSO122、6μg线性化pDSY81或6μg线性化pDSY82之任一种进行。然后加入3毫升SPTC(1.2M山梨醇-10mM CaCl2-10 mM TrispH 8)，轻轻混合悬浮液。用12毫升融化的上层琼脂(1X COVE盐，1％NZ胺，0.8M蔗糖，0.6％Noble琼脂)或3毫升STC培养基与悬浮液混合，将悬浮液铺板于基本培养基平板。平板于37℃温育3-5天。
环状pSO122转化的转化频率为约100-200个转化子/μg。获得了约120,000个转化子的米曲霉HowB430文库。
EcoRI REMI pDSY81转化的转化频率为约60-100转化子/μg。获得了约28,000个转化子的米曲霉HowB430之EcoRI REMI文库。
BamH I REMI pDSY82的转化频率为约80-110转化子/μg。获得了约27,000个转化子的米曲霉HowB430之BamH I REMI文库。
也利用pDSY81如上述制备了米曲霉HowB430的HindIII及SalIREMI文库。
Hind III REMI pDSY81转化的转化频率为约80-120个转化子/μg。产生了约35,000个转化子的米曲霉HowB430之Hind III REMI文库。
SalI REMI pDSY81的转化频率为约80-110转化子/μl。获得了约25,000个转化子的米曲霉HowB430之SalI REMI文库。
米曲霉HowB430之文库的集合分别命名如下“h”为pSO122；“e”为用EcoRI消化的pDSY81，随后在EcoRI存在下转化；“b”为用BamHI消化的pDSY82，随后在BamHI存在下转化；“hIII”为用HindIII消化的pDSY81，随后在HindIII存在下转化；“s”为用SalI消化的pDSY81，随后在SalI存在下转化。有123个＂h＂集合，28个＂e＂集合，23个＂b＂集合，55个＂hIII＂集合及25个＂s＂集合。
上述文库合并成各个约1000个转化子的组，于-80℃贮存在10％甘油中。实施例4脂酶表达筛选鉴定实施例3中所述米曲霉HowB430突变文库＂h＂、＂e＂、＂b＂、＂s＂及＂hIII＂的脂酶表达。
对于96孔板筛选，用由等体积的无菌水及2X MY盐(pH 6.5)溶液制备的稀释液稀释MY25培养基1000倍。对于24孔板筛选方法，用由等体积的无菌水及2X MY盐(pH 6.5)溶液制备的稀释液稀释MY25培养基100倍。
初级96孔板筛选包括从独立的文库集合中稀释孢子入MY25/1000，使得当将50毫升培养基分散入各个孔时，平均每孔接种一个孢子。接种后，将96孔板在静止条件下于34℃生长7天。然后如下述鉴定脂酶活性。将目标突变体直接接种入含有MY25/100的24孔板，34℃生长7天。然后如下述鉴定脂酶活性。将目标突变体铺板于COVE平板以产生孢子，再铺板于PDA平板，以产生单个菌落，然后在24孔板中用上述方法测试每个分离物的4个单个菌落。
脂酶分析底物的制备如下使用前，将对硝基苯基丁酸储备液底物1∶50稀释(21μl对硝基苯基丁酸/毫升DMSO)入MC缓冲液(4mM CaCl2-100mM MOPS pH 7.5)。制备标准脂酶(LIPOLASETM， Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)，以含有40 LU/ml MC缓冲液，所述缓冲液中含有0.02％α-烯烃磺酸酯/盐(AOS)去污剂。将标准物置于4℃备用。使用前将标准脂酶在MC缓冲液中1∶40稀释。肉汤样品在含有0.02％AOS去污剂的MC缓冲液中稀释，并将20μl等份加入96孔板的孔中，随后加入200μl稀释的底物。利用孔板读数仪，在405nm处记录吸光度，记录间隔大约1分钟的两次读数的差异。相对于脂酶标准计算脂酶单位/毫升(LU/毫升)。
经96孔板筛选及随后的24孔板筛选的结果鉴定了用于进一步评价的pSO 122转化的转化子360个，pDSY81或pDSY82 REMI转化的转化子44个。这些经鉴定的转化子与对照菌株米曲霉HowB427和米曲霉HowB430相比，产生更高水平的脂酶。实施例5摇瓶、发酵及脂酶基因拷贝数评价将实施例4中所述脂酶产量最高的突变株铺板于COVE平板，以产生用于摇瓶及发酵评估的孢子。
通过将300-500毫升的孢子悬浮液(0.02％Tween-80加COVE平板的孢子)接种入125毫升摇瓶中25毫升的MY25培养基(pH 6.5)内，进行摇瓶评估。以200转/分在34℃下培养摇瓶3天。于第2天和第3天取样，如实施例4中所述测定脂酶活性。
将相同突变株在含有由Nutriose、酵母提取物、(NH4)2HPO4，MgSO47H2O、柠檬酸、K2SO4、CaCl2H2O及微量金属元素构成的培养基之2升实验室发酵罐中，34℃ pH7下以1000-1200转/分生长8天。如实施例4中所述测定脂酶活性。
米曲霉突变株中的脂酶拷贝数通过实时PCR分析测定，PCR分析采用Applied Biosystems Prism Model 7700序列测定仪(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)依照制造商指示进行。对脂酶及单拷贝基因对照oliC的每个基因组DNA制品进行实时PCR反应。在小培养皿平板上于34℃将突变株的孢子在5毫升YEG培养基上生长24小时。通过经Whatman 1号滤纸(Whatman，Springfield Mill，英国)过滤从各个培养物中收集菌丝体，转移入1.7毫升的离心管。在液氮中冷冻菌丝体，于SpeedVac(Savant Instruments.，Inc.，Famiingdale.，NY)中室温下干燥过夜。利用DNeasy Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)依照制造商指示获得基因组DNA。通过比照脂酶复制子数量与oli C复制子数量的比例，计算各个菌株的平均脂酶拷贝数。利用米曲霉HowB430的基因组DNA产生用于分析的标准曲线。使用下列引物及探针组进行实时脂酶基因的扩增脂酶基因探针6FAM-5′-TGGCCAGTCCTATTCGTCGAGAGGTC-3′-TAMRA脂酶基因正向引物(lipo 9F)5′-CTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCT-3′脂酶基因反向引物(lipo 111R)5′-CTGTGCAAAGAGATTGAACTGGTTA-3′使用下列引物及探针组进行oliC实时扩增oliC探针6FAM-5′-TGGGTATGGGTTCCGCCGCC-3′-TAMRAoliC正向引物(oliC4F)5′-GATGGTCCAGGTCTCCCAGAA-3′oliC反向引物(oliCl22R)5′-CAGGGTTGCGGGAGACA-3′6FAM是荧光报道分子6-羧基荧光素的缩写，其与探针的5’端共价连接，TAMRA是6-羧基四甲基罗丹明的缩写，其是通过连接臂与探针3’端结合的湮灭剂。
为了标准曲线，用1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000系列稀释米曲霉HowB430基因组DNA，且对引物组和探针组均进行实时PCR。为了分析其它菌株，以1∶50及1∶100或者以1∶100及1∶200稀释基因组DNA，且对引物组和探针组均进行实时PCR。依照制造商指示利用TaqMan PCR试剂试剂盒(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时PCR反应。反应含有1X TaqMan缓冲液A，3.5mM MgCl2，dATP、dCTP、dGTP及dUTP各200μM，0.025U/ml AmpliTaq Gold，0.01U/ml AmpErase，以及100nM的脂酶基因或oliC探针。以终浓度0.9μM加入各个脂酶引物。以终浓度0.3μM加入各个oliC引物。利用如下的循环条件在AppliedBiosystems Prism Model 7700序列检测仪上进行反应，即50℃2分钟1个循环，95℃10分钟1个循环，以及40个循环95℃15秒，60℃1分钟。利用Sequence Detector v 1.6分析原始数据。
获得的结果示于如下表1，其中将作为对照的米曲霉HowB427或米曲霉HowB430之脂酶产量标准化为1.0，将米曲霉HowB430的平均脂酶基因拷贝数标准化为1.0。
表1脂酶表达及突变株的脂酶基因拷贝数菌株 构建物 文库 摇瓶结果 平均相对拷贝HowB430 HowB425+pBANe8NA 1.0 1.0HowL371.3 pSO122h2.5 1.56HowL500.1 pSO122h2.7 1.25HowL795.4 pSO122h3.8 1.75HINL981 pDSY81hIII 5.9 5.62HINL949 pDSY81hIII 5.7 5.81HINL917 pDSY81hIII 5.6 5.38HINL980 pDSY81hIII 4.6 3.81SALL678 pDSY81s3.7 2.19SALL714 pDSY81s3.4 2.56BAML5 pDSY82b3.0 1.62HINL985 pDSY81hIII 2.9 1.56ECOL56 pDSY82e2.7 1.50HINL990 pDSY81hIII 2.4 1.62HINL955 pDSY81hIII 2.4 2.37HINL933 pDSY81hIII 2.3 1.75
如表1所示，当在摇瓶中生长时，与对照菌株米曲霉HowB430相比，突变株产生约多2-6倍的脂酶。当在发酵罐中(未对所有菌株测试)时，发酵罐中测试的突变株比对照菌株米曲霉HowB427产生约多2-5倍的脂酶。实施例6 pMTI936的构建利用下列依照制造商指示由Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成仪合成的引物，构建pMT1936，使之含有示于WO 98/11203中的米曲霉1560之palB基因。1007525-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3′1007535′-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3′1007545′-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3′1007555-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3′从利用述于实施例1中的方法获得的米曲霉1560之基因组DNA，利用PCR扩增米曲霉palB 5′侧翼序列及编码palB产物的N-末端部分的序列。大约使用了0.05μgDNA模板及两个引物(引物100755和100754)各5pmol。如制造商所述使用聚合酶Pwo进行扩增(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。扩增经过了40个循环。部分反应产物用苯酚提取、乙醇沉淀、用限制性酶EcoRI和XhoI消化，用琼脂糖凝胶电泳分离约1.05kb的片段。
如上述获得米曲霉palB 3′侧翼序列及编码palB基因产物C-末端部分的序列，除了采用引物100753和100752进行扩增以及在用凝胶电泳回收约1.5kb片段之前用限制性酶XhoI和XbaI消化PCR产物。
将如上所述消化及纯化的PCR片段以三方连接的方法与载体pJaL400(图9)纯化的2.7kb EcoRI-XbaI片段连接，得到pMT1935(图10)。通过由PCR引物100754和100753引入的BssHII、SpeI和XhoI位点分离pMT1935的palB之5’侧翼和3’侧翼。
为了在pMT1935的palB之5’侧翼和3’侧翼之间插入米曲霉pyrG基因，将含有重复的pyrG基因侧翼的pJaL394(图11)之3.5kb HindIII片段克隆入经HindIII酶切、去磷酸化的、纯化的pBluescript II SK-中。获得了具有任一方向的插入片段之质粒。选择了一个质粒pMT1931(图12)，其中pBluescript多接头的SpeI位点位于pyrG基因下游，XhoI位点位于pyrG基因上游。pyrG基因以3.5kb的SpeI-XhoI片段分离，并插入经SpeI和XhoI消化的、纯化的pMT1935中，产生破坏质粒pMT1936(图13)。
pyrG可选择性palB破坏盒可以以5.5kb AseI-PuvI片段(AseI与PuvI在实际的palB之5’和3’侧翼序列内切割)的形式从pMT1936中分离。实施例7用pMT1936的AseI/PvuI palB破坏盒转化米曲霉及脂酶筛选用获自pMT1936的5.5kb之AseI/PvuI片段以如实施例3中所述的相同转化方法转化米曲霉HowB430。用于转化的线性片段通过如下方法分离用AseI和PvuI消化pMT1936，利用QiAquick凝胶提取试剂盒依照制造商指示将分离的片段在1％琼脂糖凝胶上分离。然后通过在基本培养基平板(pH 6.5或pH 8.0)上生长测试转化子。如实施例5所述测定平均脂酶基因拷贝数。
结果显示，测试的128个转化子中有13个含有palB-表型，如其不能在pH 8.0下生长所示。将13个palB-表型的菌株与13个能在pH 8.0下生长的转化子经孢子纯化，在摇瓶中培养进行评估，分别采用实施例4和5中所述测定摇瓶培养物中脂酶产生。如实施例5中所述测定平均脂酶基因拷贝数。
结果示于下面的表2，其中米曲霉HowB430的脂酶产生与平均脂酶基因拷贝数被标准化为1.0。5个不能比米曲霉HowB430产生更多脂酶的palB-菌株均损失了50％或更多的脂酶表达盒。
表2菌株 palB表型摇瓶结果平均相对拷贝数HowB430 + 1.0 1.0
DEBYIO.3- 2.2 1.0palB24-l- 1.7 0.38palB29-I- 1.0 0.31palB46-l- 0.6 0.31palB78-l- 1.6 0.44palB91-I- 1.3 0.38实施例8用NdeI线性化的pDSY138转化米曲霉及脂酶表达筛选用来自米曲霉DEBY932(WO 98/11203)的NdeI线性化pDSY138之分离物转化米曲霉HowB430，利用实施例3中所述的方法回收转化子。一共将180个回收的转化子在24孔微量滴定板上于1/100强度的MY25培养基中培养，于第4天和第6天取样，用于如实施例4所述分析脂酶。产生脂酶最高的前11个转化子及1个平均脂酶产量的转化子经孢子纯化，在24孔微量滴定板培养基上重新测试。这些纯化的转化子也同样在完全强度的MY25中于摇瓶内依实施例5所述进行评估。将产量最高的两株如实施例5所述于2升发酵罐中培养。同样如实施例4所述测量脂酶活性。如实施例5所述测定平均脂酶基因拷贝数。
所得结果示于下面的表3，其中米曲霉HowB430的脂酶产生与平均脂酶基因拷贝数被标准化为1.0。最高的两个脂酶产生菌产生与米曲霉DEBY932基本上相同量的脂酶活性，但是其脂酶基因的拷贝数也已增加。
表3菌株 发酵结果 平均相对拷贝数HowB430 1.01.0138T83.l.l 2.21.81138T102.l.1 1.91.81实施例9米曲霉HowB432的构建通过用含有NA2-tpi启动子、柔毛腐质霉(CAREZYMETM基因，NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)的纤维素酶基因和质粒pGAG3(图14)的AMG终止子的线性片段转化米曲霉JaL250，得到米曲霉HowB432。
通过删去中性蛋白酶I基因(npI)从米曲霉JaL 142(Christensen等，1988，生物/技术(Bio/Technology)61419-1422)构建米曲霉JaL250。通过将编码质粒pJaL389(图15)中npI基因之中央部分的1.1kb的BalI片段与pJaL335(图16)的3.5kb之HindHI片段交换，构建npI缺失的质粒，其中所述质粒pJaL389含有编码npI基因的5.5kb之SacI基因组片段，所述3.5kb之HindHI片段含有侧翼为重复序列的pyrG基因。由此，得到质粒pJaL399(图17)。用7.9kb的SacI片段转化米曲霉JaLI42。利用如实施例7所述Southern分析以及依照标准方法通过IEF蛋白酶曲线分析来分析转化子。
35个转化子中有两个具有与亲本菌株相比改变了的Southern图谱，由IEF显示无中性蛋白酶I活性。此外，Southern分析显示，两个转化子之一具有npI基因的完整缺失，称为米曲霉JaL228。
一共将2.3×107米曲霉JaL228的分生孢子铺板于补加0.1％5-氟-乳清酸(FOA)和10mM尿苷的基本培养基平板上。获得8个FOA抗性菌落。利用401bp pyrG重复区域探查的8个菌落之基因组DNA的Southern印迹证实，通过在重复区域的重组已将pyrG基因切除。米曲霉JaL228显示出来自两个重复区域之预期大小的2.7kb和3.1kb的两条带。如果pyrG基因已通过重复区域之间的重组而丧失，则3.1kb带会消失，仅保留2.7kb带。所有8个FOA抗性菌落显示此种条带模式。涵盖了npI基因与保留在8个菌落中401bp重复拷贝之间的连接之PCR片段的测序证实，通过重复序列间的重组已切除了pyrG基因。其中的一个菌落称为米曲霉JaL250。
通过从pDM176(图18)从分离含有柔毛腐质霉纤维素酶基因的SwaI/PacI片段，并将片段连接入SwaI/PacI消化的pBANe6，构建pGAG3。将pDM176的SwaI/PacI片段及SwaI/PacI消化的pBANe6在1％琼脂糖凝胶上分离，并在连接前用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)按照制造商指示进行分离。连接产物用于转化大肠杆菌DH5α细胞，然后通过利用QIAwell-8质粒试剂盒依照制造商指示从转化子中提取质粒DNA，限制性消化质粒DNA以证实正确大小的片段存在与否，以及以实施例1中所述的方法测定DNA序列，筛选转化子。
然后用PmeI消化pGAG3，通过使用TAE缓冲液由制备型琼脂糖电泳分离线性表达盒。然后使用线性表达盒转化米曲霉JaL250。
如实施例1中所述用浓度为每毫升2×107个原生质体的原生质体进行用amdS选择的米曲霉JaL250转化。将上述10μg线性片段加入1Oμl原生质体。然后加入体积为250μl的PEG(60％PEG4000-10mM CaCl2-10mMTris-HCl pH 8.0)，将混合物置于37℃30分钟。加入3毫升STC培养基，将混合物铺板于补加了用于amdS选择的10mM尿苷之COVE平板。在34℃培养平板7-10天。然后将转化子转移至相同培养基的平板，于37℃温育3-5天。通过孢子划线法及利用不含蔗糖的相同培养基之平板挑取分离的菌落，纯化转化子。实施例10用NdeI线性化的pDSY138转化米曲霉以及纤维素酶表达筛选利用实施例3所述方法用NdeI消化的pDSY 138(WO 98/11203)转化米曲霉HowB432。总共回收了240个转化子，其如实施例4所述生长于1/4强度的MY25培养基之24孔微量滴定板上，除了是在第3天和第5天取样，并如下分析纤维素酶活性。
根据下面的方法测定纤维素酶活性。通过在100mM MOPS(pH 7.0)的缓冲液中于80℃中溶解物质10分钟，制备含有2％偶氮羧甲基纤维素的底物溶液。使用CAREZYMETM(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)作为标准。制备2.5-25ECU/毫升的贮藏原液，以通过在100mM MOPS(pH7.0)缓冲液中相应地稀释CAREZYMETM构建标准曲线。将5μl等份的标准品与样品(从摇瓶及发酵罐中稀释)加入96孔板上的独立的孔。将体积为65μl的2％偶氮羧甲基纤维素溶液移入每个孔并混合。反应在45℃温育30分钟，通过加入215μl终止剂随后混合，终止反应。首先将0.2gZnCl2悬浮于20ml 250mM MOPS(pH 7.0)中，再将悬浮液加入80毫升酸化乙醇(每升乙醇含有1.1毫升浓盐酸)，制备终止剂。将含有终止剂的平板于3000转份离心10分钟。每个悬浮液之100μl等份移入96孔板中，于600nm测定吸光度。利用线性回归，测定标准品和样品的斜率、截距及相关系数。
将20个纤维素酶产量最高的转化子经孢子纯化，并在24孔微量滴定板中重新测试。将产量最高的8个产纤维素酶纯化转化子又一次经孢子纯化，如实施例5中所述，在完全强度的MY25中于摇瓶中测试。最高的2个产纤维素酶转化子也利用如实施例5中所述的相同培养基和条件在2升发酵罐中生长。如上述测定纤维素酶活性。利用实施例5中所述的相同方法测定纤维素酶拷贝数，所用引物如下，并使用米曲霉HowB432基因组DNA为标准。通过纤维素酶复制子数量与oliC复制子数量的比例计算每一菌株的纤维素酶基因拷贝数。纤维素酶基因探针6FAM-CAGCCTGTCTTTTCCTGCAACGCC-TAMRA纤维素酶基因正向引物(CARE119F)CCAAGAAGGCTCCCGTGAA纤维素酶基因反向引物(CARE186R)GAAGTCCGTGATACGCTGGAA所得结果示于下面的表4，其中米曲霉HowB432的纤维素酶产量及平均纤维素酶基因拷贝数被标准化为1.0，结果表明，米曲霉C 138T205.1.1比米曲霉HowB432具有多出50％的纤维素酶基因拷贝，这与发酵中纤维素酶产量增加50％相一致。
表4菌株 发酵结果 平均相对拷贝数HowB432 1.0 1.0C138T205.l.l1.5 1.56C138T21.l.l 1.151.0实施例11葡萄糖转运子基因过量表达质粒pHB218和pDSY153以及终止对照质粒pDSY152和pDSY155的构建构建过量表达米曲霉DEBY599.3 (WO 98/11203)的葡萄糖转运子基因的质粒，以测定如果葡萄糖转运子过量表达是否会导致柔毛腐质霉脂酶纤维素酶的产量增加。通过PCR扩增葡萄糖转运子开放阅读框，以分别将SwaI和PacI位点置于ORF的5’和3’末端。依照制造商指示利用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成仪合成的下列引物与0.2毫克pDSY112(WO98/11203)一起用于扩增9611765′-ATTTAAATGGTCCTCGGTGGATCAAGC-3′9611775′-TTAATTAATTAGTCCTGTCTGCGCTGGT-3′用于扩增的条件及参数述于实施例1。在琼脂糖凝胶上电泳10毫升PCR反应产物，获得预期的1.5kb片段。依照制造商指示利用pPCR-ScriptTM试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)克隆PCR产物。采用连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，用QIAWell-8质粒试剂盒从数个转化子中分离质粒DNA。用NotI和EcoRI消化质粒以确定哪一个克隆含有1.5kb的插入片段。如琼脂糖凝胶电泳所示，分析的11个克隆中6个具有正确大小的插入片段。其中一个克隆pDSY119被PacI和SwaI消化，将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切下1.5kb的SwaI/PacI带，使用QIAQuick凝胶提取试剂盒从凝胶切块中纯化DNA。用标准方法(Sambrook等，1989，出处同前)将此1.5kb片段与Swal/PacI切割的pBANe13(图3)连接。连接产物用于转化大肠杆菌DH5α细胞，从数个转化子中分离质粒DNA。用Swal/PacI消化质粒以确定哪一个克隆含有预期的1.5kb的插入片段。所得质粒称为pHB218(图19)。
构建了一款其中选择标记为bar基因的pHB218，用来转化pyrG+菌株。通过限制性消化、琼脂糖凝胶电泳及利用QIAQuick凝胶提取试剂盒纯化，从pHB218中分离SwaI/PacI插入片段。将插入片段连接入pSE39(图20)并利用SwaI/PacI消化。连接产物用于转化大肠杆菌DH5α细胞，如上述从数个菌落中分离质粒DNA。用SwaI/PaeI消化质粒以确定哪一个克隆含有预期的1.5kb的插入片段。如实施例1所述测定质粒的序列，以证实在氨基酸9 pDSY153(图21)缺失了终止密码子。实施例12用pHB218转化米曲霉HowB430及脂酶筛选用pHB218转化米曲霉HowB430，利用实施例3所述方法回收转化子。回收了120个带有pHB218的转化子，如实施例5所述生长于摇瓶内的MY25培养基中，如实施例4所述于2-3天后鉴定脂酶活性。如实施例5所述测定脂酶基因拷贝数。
结果示于表5，其中米曲霉HowB430的脂酶产量与平均脂酶基因拷贝数标准化为1.0。由表5可知，在摇瓶中，具有增加的脂酶基因拷贝数之转化子产生较多的脂酶，丢失了脂酶基因拷贝的米曲霉218T95产生较少的脂酶。
表5菌株 摇瓶结果平均相对拷贝数HowB4301.01.0218T56 1.85.33218T87 1.74.00218T18 1.82.87218T43 1.62.53218T95 0.90.47实施例13用pDSY153转化米曲霉DEBY10.3及脂酶筛选用pDSY153转化米曲霉DEBY10.3，利用实施例3所述方法回收转化子。回收了216个带有pDSY153的转化子，如实施例5所述生长于摇瓶内的MY25培养基中，如实施例4所述于2-3天后鉴定脂酶活性。如实施例5所述测定脂酶基因拷贝数。
结果示于表6，其中米曲霉DEBY10.3的脂酶产量与平均脂酶基因拷贝数标准化为1.0。结果显示，在摇瓶中，具有增加的脂酶基因拷贝数之转化子产生较多的脂酶，脂酶基因拷贝降低的转化子产生的脂酶减少。
表6菌株 摇瓶结果 平均相对拷贝数DEBYIO.3 1.0 1.0153T208 1.43 2.87153T214 1.35 2.93153T171 1.25 1.19153T90 0.4 0.56153T11 0.2 0.44
利用下面的寡核苷酸从米曲霉基因组DNA扩增palB基因的基因组片段5′-CATATGCACAATACTCACACCAGTAGGCGACCAC-Y5′-CATATGCTGGTTGTGATCACAGCGACTGGGATGG-3′利用米曲霉How B430基因组DNA作为模板，依照制造商指示使用Clontech高级基因组PCR试剂盒(Clontech.Palo Alto.，CA)扩增产物。反应条件为94℃1分钟；35次如下循环94℃30秒，68℃6分钟；以及1个循环的68℃6分钟。获得预期的约4.7kb之产物，依照制造商指示使用TA克隆试剂盒在72℃下10分钟用Taq DNA聚合酶将3’A加入产物。
利用Invitrogen Topo TA克隆试剂盒将产物亚克隆入pCR2.1，筛选大肠杆菌转化子中的插入片段。来自三个亚克隆pLRF1的palB片段之核苷酸序列通过引物步移(primr walking)测定。所有三个亚克隆均具有3个碱基改变位置1910的T变为C(摆动位置，故其为沉默的)，距终止密码子约110bp的终止子中的A变为G，以及可能改变氨基酸残基的3885位置中A变为T。为了校正3885位置中的A变为T，使用下面的寡核苷酸利用Morph定点突变试剂盒(Five Prime-Three Prime，Inc.，Boulder，CO)依照制造商指示进行定点突变，从5’至3’5′-CCTGGCGACTTCGGAAGATGGAACTCACAG-3′用于定点突变的模板为pLRF2。pLRF2是这样构建的用NdeI消化pLRF1，分离4.6kb palB片段，将其亚克隆入已被NdeI消化并经虾碱性磷酸酶磷酸酶化(phosphatased)的pMT1612(WO 98/11203)中。突变后，测定数个大肠杆菌克隆的核苷酸序列，鉴定其中3385位置的T已经被改变为A的克隆。此外，通过引物步移，测定了含有期望的T被改变为A之pLRF2的定点突变克隆之一的核苷酸序列，以证实未引入其它改变。实施例15palB-表型的互补及用于脂酶产生的转化子的筛选通过在米曲霉菌株DEBY10.3以及在分别如实施例5与7中所述的米曲霉HowB430 palB破坏转化子之一中用野生型palB基因与palB-表型互补，证实了palB-表型与脂酶产生增加的关系。此互补将导致脂酶产生减少。
用如实施例3所述方法选择BASTA抗性的pLRF2转化米曲霉DEBY10.3或pal B破坏的米曲霉HowB430菌株之一米曲霉pal B76-1-1。也用BASTA抗性的pMT1612作为对照转化菌株。米曲霉DEBY10.3中，分别用pLRF2和pMT1612获得26和11个转化子。在米曲霉HowB430 palB76-1-1中，分别用pLRF2和pMT1612获得28和14个转化子。
所有转化子经孢子纯化并于pH6.5和pH8.0的基本培养基平板上测定palB表型。对于米曲霉DEBY10.3及米曲霉HowB430 palB76-1-1，结果分别示于下面的表7和表8。所有pLRF2米曲霉DEBY 10.3的转化子为palB+，而所有pMT1612米曲霉DEBY 10.3转化子为palB-。在米曲霉palB76-1-1群落中，28个pLRF2转化子中有27个为palB+，而14个pMT1612转化子中有13个为palB-。
通过如实施例4所述，将各个转化子接种入含有1/100强度MY25培养基(pH6.5)的24孔微量滴定板中，测定转化子产生脂酶的能力。每一转化子各接种入3个孔中，将平板于34℃以150转/分摇动下培养。于第3天和第5天取样，并如实施例4所述分析。如实施例5所述测定平均脂酶基因拷贝。
对于米曲霉DEBY10.3及米曲霉palB76-1-1，结果分别示于下面的表7和表8。对于这些菌株将结果标准化为1.0。
表7菌株 palB表型相对LU/ml微滴定平均相对拷贝数DEBY10.3 - 1 1pLRF2-1 + 0.9 1.17pLRF2-2 + 0.8 1.19pLRF2-3 + 1.3 3.5pLRF2-4 + 0.5 0.61pLRF2-5 + 0.7 0.94pLRF2-6 + 1.1 1.61pLRF2-7 + 0.69 0.67pLRF2-8 + 0.85 0.89pLRF2-9 + 0.63 0.56pLRF2-10 + 1.1 1.44pLRF2-11 + 0.8 0.83pLRF2-12 + 0.6 0.56pLRF2-13 + 1.1 1.21pLRF2-14 + 0.5 0.39pLRF2-15 + 0.6 0.67pLRF2-16 + 0.5 0.39pLRF2-17 + 0.8 1pLRF2-18 + 0.8 0.89pLRF2-19 + 0.7 0.78pLRF2-20 + 0.7 1.06pLRF2-21 + 0.8 0.9pLRF2-22 + 1 1.17pLRF2-23 + 0.9 0.89pLRF2-24 + 0.8 0.89pLRF2-25 + 0.5 0.56pLRF2-26 + 0.6 0.67pMT1612-1 - 1.3 1.05pMT1612-2 - 1.3 1.05pMT1612-3 - 0.73 0.39pMT1612-4 - 1.11pMT1612-5-1.10.94pMT1612-7-1.21.5pMT1612-8-1.10.94pMT1612-9-1 0.94pMT1612-10-1.31.39pMT1612-11-1.31.44pMT1612-12-1.11.05表8菌株 palB表型 相对LU/ml平均相对拷贝数HowB430+1 1pLRF2-1+0.951pLRF2-2+1.42.13pLRF2-3+1.21.53pLRF2-4+1.4 2pLRF2-5+1.21.2pLRF2-6-1.71.47pLRF2-7+0.9 1pLRF2-8+1.21.47pLRF2-9+1.11.2pLRF2-10 +1 1.13pLRF2-11 +0.90.87pLRF2-12 +1.31.53pLRF2-13 +0.70.5pLRF2-14 +0.90.87pLRF2-16 +0.70.6pLRF2-17 +1.11.53pLRF2-18 +1.292pLRF2-19 +1.11.27pLRF2-20 +0.60.6pLRF2-21 +0.90.87pLRF2-22 +1.21.33pLRF2-24 +0.80.87pLRF2-25+1.21.67pLRF2-26+0.81.07pLRF2-27+0.70.87pLRF2-28+1.41.33pLRF2-29+1.32.27pLRF2-32+0.80.93pMT1612-1-1.40.93pMT1612-2-1.61.27pMT1612-3-1.30.93pMT1612-4+1.31.2pMT1612-5-1.62.2pMT1612-6-1.5 1pMT1612-8-1.61.27pMT1612-10 -1.61.2pMT1612-11 -1.81.13pMT1612-12 -1.20.73pMT1612-13 -1.41.1376-1-1 -1.4 1有数个菌株丧失或获得了脂酶基因的拷贝。在所有4个群落中拷贝数改变的频率相当高，从45％-66％。拷贝数的丧失或获得分别与脂酶表达的降低或升高符合得很好。
在此表述及要求保护的本发明不局限于有此处公开的具体实施方案，因为这些实施方案意在阐明本发明的几个方面。任何等同的实施方案均落入本发明的范围。事实上，除了此处所示及描述的之外，对于本领域普通技术人员而言由前述说明可知对本发明的修改是显而易见的。这类修改也认为落入所附权利要求书的范围。
所有此处提及的用于描述和公开所引公开文本之特定信息的公开文本在此引用作为参考。上面讨论的公开文本仅仅为了其在本申请提交日之前的公开。不应认为此间所述内容是发明人承认无资格享有因在先发明而具有比这种公开在先的申请日。
应当理解，本发明不限于此处所述的特定方法及组合物或其变体。也应当理解此处所用的术语仅仅意在描述特定的实施方案，而不意在限制，因为本发明的范围仅应由所附的权利要求书限定。
除非另有定义，所有此处所用的技术和科学术语具有本发明所述技术领域中普通技术人员通常知晓的相同含义。尽管在实施或测试本发明中可使用任何与此处公开的那些类似或等同的材料或方法，描述了优选地方法和材料。
权利要求
1.一种用于制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的拷贝之外的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
2.权利要求1的方法，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽。
3.权利要求1的方法，其中于基因座中导入核酸构建体降低了核酸序列的拷贝数，且当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽。
4.一种用于制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列的一个拷贝之中的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中于基因座中导入核酸构建体改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
5.权利要求4的方法，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽。
6.权利要求4的方法，其中于基因座中导入核酸构建体降低了核酸序列的拷贝数，且当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更少的多肽。
7.一种用于制备多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞，其中(i)通过将一个核酸构建体在核酸序列之外的基因座处导入亲本细胞的基因组产生突变细胞，使突变细胞与亲本细胞相关联，该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，所述核酸序列在该核酸序列之5’和3’端含有重复序列，其中于基因座中导入核酸构建体增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不是选择压力的结果；(ii)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)从培养液中回收多肽。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中核酸构建体与核酸序列具有小于40％的同源性。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中基因座与核酸序列位于不同的染色体或者与核酸序列位于相同的染色体。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中核酸构建体包含于载体中。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中核酸构建体是一种环状分子。
12.权利要求1-9中任一项的方法，其中核酸构建体是一种线性片段。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中核酸构建体包含选择标记。
14.权利要求13的方法，其中所述选择标记是dal，amp，kan，cam，tet，dfhr)，hygB，ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，URA3，amdS，argB，bar，hygB，niaD，pyrG，sC或trpC。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中亲本细胞是原核细胞或真核细胞。
16.权利要求15的方法，其中原核细胞是细菌细胞。
17.权利要求16的方法，其中细菌细胞选自芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属细胞。
18.权利要求15的方法，其中真核细胞是哺乳动物细胞。
19.权利要求15的方法，其中真核细胞是真菌细胞。
20.权利要求19的方法，其中真核细胞是丝状真菌细胞。
21.权利要求20的方法，其中丝状真菌细胞选自支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、柱霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属细胞。
22.权利要求19的方法，其中真菌细胞是酵母细胞。
23.权利要求22的方法，其中酵母细胞选自假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia属。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中多肽是重组多肽。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中多肽是异源多肽。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中多肽是抗体或其部分、抗原、凝集因子、酶、激素或其变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报道分子或转运蛋白质。
27.权利要求26的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。
28.权利要求27的方法，其中酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶或木聚糖酶。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中核酸构建体是pDSY82、pDSY112、pMT1612、pMT1936、pLRF2、pDSY153或pHB218。
30.一种用于制备多肽的方法，包括(a)通过将一个核酸构建体在核酸序列的拷贝之外或在核酸序列拷贝之一的序列之内的基因座处，导入亲本细胞的基因组，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不受选择压力；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，分离比亲本细胞产生更多或更少的多肽的突变细胞；(c)鉴定其中已整合有核酸构建体的基因座；(d)产生其中相应基因座已经被破坏的细胞；(e)在有助于多肽生产的条件下培养该细胞；(f)从培养液中回收多肽。
31.一种用于制备多肽的方法，包括(a)通过将一个核酸构建体在核酸序列之外的基因座处，导入亲本细胞的基因组，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，所述核酸序列在该核酸序列之5’和3’端含有重复序列，其中将核酸构建体整合入基因座中增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不受选择压力；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，分离比亲本细胞产生更多的多肽的突变细胞；(c)鉴定其中已整合有核酸构建体的基因座；(d)产生其中相应基因座已经被破坏的细胞；(e)在有助于多肽生产的条件下培养该细胞；(f)从培养液中回收多肽。
32.一种用于获得突变细胞的方法，包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列拷贝之外的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不受选择压力；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)鉴定当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，比亲本细胞产生更多或更少的多肽的突变细胞。
33.一种由权利要求32的方法产生的突变细胞。
34.一种用于获得突变细胞的方法，包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体于核酸序列的一个拷贝之中的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝，其中将核酸构建体整合入基因座中改变了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的改变不受选择压力；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽；(b)鉴定当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，比亲本细胞产生更多或更少的多肽的突变细胞。
35.一种由权利要求34的方法产生的突变细胞。
36.一种用于获得突变细胞的方法，包括(a)将一个核酸构建体在其中核酸构建体在核酸序列之外的基因座处整合入亲本细胞的基因组之条件下导入亲本细胞，形成突变细胞，其中该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列，所述核酸序列在该核酸序列之5’和3’端含有重复序列，其中将核酸构建体整合入基因座中增加了核酸序列的拷贝数，且拷贝数的增加不受选择压力；当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；(b)鉴定当在同一有助于多肽生产的条件下培养亲本细胞和突变细胞时，比亲本细胞产生更多的多肽的突变细胞。
37.一种由权利要求36的方法产生的突变细胞。
全文摘要
本发明涉及制备多肽的方法,包括(a)在有助于多肽生产的条件下培养突变细胞,其中(ⅰ)通过将一个核酸构建体在核酸序列之内的基因座或在核酸序列之外的基因座处导入亲本细胞的基因组,使突变细胞与亲本细胞相关联,该亲本细胞含有编码多肽的核酸序列之至少两个串联的拷贝,或一个编码多肽的核酸序列,该核酸序列在核酸序列之5’和3’端含有重复序列,其中于基因座中导入核酸构建体改变了核酸序列的拷贝数,且拷贝数的改变不是选择压力的结果;(ⅱ)当在同一条件下培养亲本细胞和突变细胞时,突变细胞比亲本细胞产生更多或更少的多肽;(b)从培养液中回收多肽。本发明还涉及获得突变细胞的方法以及突变细胞。
文档编号C12N15/09GK1307642SQ99808098
公开日2001年8月8日 申请日期1999年5月27日 优先权日1998年5月27日
发明者D·S·耶弗 申请人:诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司