马力克氏病(mdv)－感染细胞上表达的宿主编码蛋白及其抗体的制作方法

专利名称：马力克氏病(mdv)－感染细胞上表达的宿主编码蛋白及其抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码与肿瘤特别是禽肿瘤尤其是与致癌病毒如马力克氏病病毒相关的禽肿瘤有关的抗原的核酸和氨基酸序列。本发明还涉及整合了上述序列的表达载体以及将这些载体和抗原在医药，特别是肿瘤的治疗和预防方面的用途。
马力克氏病病毒(MDV)是一种高度细胞相关的禽α疱疹病毒，它可产生一种淋巴增生疾病，即马力克氏病(MD)，这种病的表现形式是在易感禽类的内脏组织中产生神经病变和/或淋巴瘤[Payne，L.N.综述(编辑)，《马力克氏病》(1985)，Martinus Nijhoff Publishing，Boston]。MD对全世界的禽工业有重要的经济意义。MDV的菌株被分为3个血清型。1型病毒包括致癌菌株和它们的减毒株，不同的1型病毒的致病型各不相同，从仅在易感禽类中产生MD的温和致癌型病毒，直到能在已经免疫的禽类中产生MD的高致癌型(高毒性+)。2型MDV是感染性的但不致癌的天然菌株。血清型3型病毒包括密切相关的火鸡疱疹病毒(HVT)，这种病毒在火鸡和鸡中都没有致病性。目前，基于所有三种血清型病毒的疫苗都可以从商业途径获得，它们可单独或以不同方式组合使用。几乎所有的用于商业生产的家禽都接种了疫苗，但持续有临床疾病爆发的报道，并且发生率和严重性都在提高，因为MDV的高毒性致病型不断出现[Witter，R.L.(1997)《禽类研究》41149-163]。在MD的爆发特别严重的地区，家禽生产者采用的解决方法是转而使用更具侵袭力的疫苗，并求助于使用联合疫苗(双价或三价)来提高保护性。但疫苗生产者正在接受这样一种观点，即使用传统的MD疫苗将无法持续地控制MD。
本发明试图提供对肿瘤的鉴定、预防或治疗有用的方法和试剂。
在第一个方面，本发明提供一种纯化的多肽，该多肽能被杂交瘤AV37分泌的单克隆抗体识别，其中该杂交瘤根据布达佩斯条约于1998年3月3日保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，Centre forApplied Microbiology & Research，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，UK，保藏号为98030304。
用于此处，“纯化”的意思是，多肽不含它在自然界被发现时的一些生物物质，优选是多数生物物质，换而言之，多肽不以它以前的存在形式存在。因此，本发明的多肽包括，诸如一种组合物中的多肽，该组合物含有一种可药用载剂或赋形剂、或一种佐剂。
多肽优选是具有示于图5(SEQ ID NO.2)的序列的AV37多肽抗原以及该多肽的变异体和片段。
“片段”和“变异体”是指那些可用于制备能特异性结合所说的多肽或其突变体形式的抗体但缺少天然多肽的功能的多肽。这种变异体和片段通常包括至少一个含有至少5个连续氨基酸的区域，该区域与所说多肽的最同源的5个或更多的氨基酸区域具有至少90％的同源性。片段小于100％的整个多肽。例如，作为示于图5(SEQ ID NO.2)的AV37多肽的一个片段，氨基酸可制备成一个具有AV37多肽的序列NH2-CDTLKNWFYDETLGRC-COOH(SEQ ID NO.3)的合成多肽。据信该序列位于蛋白结构的外部，因而可以激发一种抗体应答。
示于图5(SEQ ID NO.2)的氨基酸也可分别制备成分别具有AV37多肽的序列NH2-DVMVPVEEEGKEFHHPTTATEK-COOH(SEQ ID NO.4)(C末端肽)和NH2-QPPFTSSHSCDTLKNWFYDETL-COOH(SEQ ID NO.5)(N末端肽)的合成肽。后面的序列来自C和N末端，这些肽已知是制备抗该肽抗体的优秀候选肽，即用作肽疫苗，因为它们比固定在蛋白三维结构中的肽具有更好的移动性(柔性)。更高柔性的结果是，肽的某些组成单位更容易采取天然构象，从而使针对它们产生的抗体更能识别天然抗原。
本领域的技术人员应当理解，本发明的多肽可通过已知的多肽修饰技术进行修饰。这些技术包括1981年11月24日授予Stevens的美国专利No 4,302,386中公开的技术，该专利在此引入作为参考。这种修饰可增加抗原的免疫原性，或者它们可对这样的免疫原性没有影响。例如，少数氨基酸可被改变。此外，本发明的抗原可含有一个或多个对其免疫原性不是必需的氨基酸序列。不想要的序列可通过本领域熟知的技术除去。例如，这些序列可使用酶如酪蛋白酶或木瓜蛋白酶或有关的蛋白水解酶通过限制性蛋白水解消化来除去。
此外，相当于多肽的抗原性部分的小多肽可通过本领域熟知的方法化学合成。这包括包括1981年12月22日授予Goldberg的美国专利No 4,290,944中公开的方法，该专利在此引入作为参考。
因此，本发明的多肽包括一类修饰的多肽，包括合成来源的多肽或原始多肽的片段，它们都具有起始、结构和免疫原性的共同元件，并都在本发明的范围内。
多肽也可通过固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式进行合成，如Lu等(1981)《J.Org.Chem》463433及其参考文献的公开。N-氨基基团的临时保护由9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团来提供。这种高碱不稳定性保护基团的重复切割在N、N-二甲基甲酰胺中使用20％的哌啶来进行。侧链功能可以它们的丁酯(丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸时)、丁酯(谷氨酸和天冬氨酸时)、丁基羰衍生物(赖氨酸和组氨酸时)、三甲苯基衍生物(半胱氨酸时)和4-甲氧-2、3、6-三甲苯砜衍生物(精氨酸时)形式进行保护。当谷氨酰胺或天冬酰胺为C末端残基时，使用4、4’-二甲氧苯甲基基团保护侧链氨基功能。固相支持以聚二甲基丙烯酰胺多聚体为基础，后者由三种单体---二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯酰胺二胺(交联剂)和丙烯基肌氨酸甲酯(功能试剂)组成。使用的肽-树脂连接试剂是酸不稳定的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物都以其同型酸酐衍生物的形式加入，除了谷氨酰胺或天冬酰胺，它们使用一种可逆的N，N-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶联方法。所有的偶联和脱保护反应都使用茚三酮、三硝基苯磺酸或同位素检测试验进行监测。合成结束后，用含有50％的清除剂的95％三氟乙酸处理，将肽从树脂支持物上切下，同时除去侧链保护基团。通常使用的清除剂为乙二醇、酚、苯甲醚和水。精确的选择依赖于所合成的肽的氨基酸组成。三氟乙酸通过真空挥发除去，随后用二乙酯研制，提供粗制的肽。任何存在的清除剂都通过一个简单的抽提过程除去，该过程通过液相冻干提供不含清除剂的初制肽。肽合成的试剂一般从Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd，Nottingham NG7 2QJ，UK获得。纯化可通过诸如分子大小排阻色谱、离子交换色谱和(主要)反相高效液相色谱技术的任何一种或其组合来进行。肽的分析可使用薄层色谱、反相高效液相色谱、酸水解后的氨基酸分析以及通过高速原子轰击(FAB)质谱分析来进行。
可与AV37单克隆抗体结合的本发明的合适肽配体可使用本领域熟知的方法来鉴定。
一种方法由Scott和Smith(1990)《科学》249386-390和Cwirla等(1990)《美国科学院院刊》876378-6382公开，它涉及丝状噬菌体如M13或fd的大文库的筛选，这种文库的每一成员都有一个不同的与噬菌体表面上的蛋白融合的肽。能够与AV37单克隆抗体结合的文库成员使用一种反复结合方法进行筛选，一旦纯化了能够最紧密结合的噬菌体，肽配体的序列可简单地通过对编码表面融合蛋白的DNA进行测序来测定。另一种可以使用的方法是NovaTope(TM)系统，该系统可从Novagen，Inc.，597 Science Drive，Madison，WI53711购买。该方法的基础是制备细菌克隆的文库，每个细菌克隆都稳定表达来自一种候选蛋白的小肽，所说的候选蛋白中被认为有配体存在。文库用标准的呈现方法进行筛选，使用抗体或其他结合试剂作为探针。阳性克隆可直接通过DNA测序分析来测定配体的精确氨基酸序列。
进一步的方法也可用来鉴定肽配体，如使用Lam等(1991)《自然》35482-84公开的微珠结合的单个种类的肽文库、Houghten等(1991)《自然》35484-86公开的合成肽组合文库或Pirrung等在美国专利5143854中公开的固相支持物上的单个合成肽序列的基质。
能够结合AV37多肽和其片段和变异体的单克隆抗体可使用标准的单克隆抗体技术制备。抗原结合部分可以是一种抗体的一部分(如Fab片段)或一种合成的抗体片段(如一种单链Fv片段[ScFv])。用于选择抗原的合适单克隆抗体可通过已知技术制备，例如在《单克隆抗体技术手册》，H Zola(CRC Press，1988)和《单克隆杂交瘤抗体技术和应用》，J G R Hurrel(CRC Press，1982)中公开的技术。
嵌合抗体已由Neuberger等(1988，第8届国际生物技术大会，2部分，792-799)讨论。
一种或多种氨基酸残基在肽合成前或合成后被化学修饰的肽可用来提供该肽的功能，即在体内产生特异性抗体的能力基本上保持不变。这种修饰包括与酸或碱形成盐，尤其是与生理上可接受的有机或无机的酸或碱，形成末端羧基基团的酯或酰胺，并结合上氨基酸保护基团如N-叔丁氧羰基。这种修饰可保护肽不在体内代谢。肽可以单拷贝或多拷贝如串联重复的形式存在。这种串联或多拷贝重复可使它们具有有效的抗原性，而避免使用一种载体。肽优选形成一种环即N末端和C末端连接在一起、或在一个末端添加一个或多个半胱氨酸以增加抗原性和/或形成二硫键。如果肽与一种载体优选是一种多肽共价结合，其排列方式优选使本发明的肽形成一个环。
根据当前的免疫学理论，载体的功能应是存在于任何免疫原性制剂中以刺激免疫系统或增强免疫系统的刺激。据认为最佳载体含有(或与抗原一起产生)一种T细胞表位。肽可与一种单独的载体如血清白蛋白、肌红蛋白、细菌类毒素和匙孔蓝蛋白通过诸如交联方法连接在一起。更近一些时候发展起来的能够诱导免疫应答的T细胞辅助的载体包括乙型肝炎B核心抗原(也称为核衣壳蛋白)、推定的T细胞表位如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys、β-半乳糖苷酶和白介-1的163-171肽。后一化合物可被认为是一种载体或一种佐剂或两者。此外，本发明的同一种或不同的多肽的几个拷贝可相互交联，在这种情况下就没有单独的载体，但载体的功能可通过这种交联来提供。合适的交联试剂包括列于Sigma和Pierce目录的试剂，例如戊二醛、碳二亚胺和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物，后一试剂利用C末端半胱氨酸残基的-SH基团(如果存在的话)。
如果多肽是通过在一种合适宿主中表达一种合适的核苷酸序列制备的，那就优选以融合产物的形式表达该肽，即与一种作为载体的多肽序列融合表达。Kabigen的“Ecosec”是这种安排的一个例子。
在第二个方面，本发明涉及本发明的多肽在制备医药用组合物中的用途。具体地说，用于生产疫苗，这种疫苗用于治疗或预防肿瘤，优选是禽类肿瘤，尤其是与致癌禽类病毒如MDV、ALV以及网状内皮细胞增殖病毒相关的禽类肿瘤。
优选进行受体的主动免疫。在这种方式中，一种或多种AV37多肽/蛋白在一种含有合适的佐剂和载体的免疫原性制剂中制备，并通过已知途径给药于受体。在禽类中，受精卵的卵内注射是一种方便的给药模式。合适的佐剂包括福氏完全或不完全佐剂、胞壁酰二肽、EP109 942、EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”、氢氧化铝、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(例如miglyol)、植物油(如花生油)、脂质体、Pluronic多元醇或Ribi佐剂系统(见诸如GB-A-2 189 141)。“Pluronic”是一种注册商标。
为提供更好的免疫效果，优选使用在不是将要处理的物种中制备的AV37多肽。另一种多肽可用来代替AV37多肽全分子，来在病人中产生抑制性抗体。这样的其他多肽包括AV37蛋白的片段和类似物。这样的多肽可按照上面的介绍进行筛选，来保证它们能够在受体中产生抑制性抗体。
本发明的第三个方面，提供一种示于图5(SEQ ID No.1)的分离AV37基因及其变异体用于此处，“分离”一词的意思是，该基因从它被发现的基因组的至少大部分中分离，换而言之，该基因不是以它以前存在的形式存在。因此，例如，本发明的基因包括这样的基因，它已被克隆进一种细菌载体例如质粒、或一种病毒载体如噬菌体，只要这样的克隆已从由有关基因组的DNA文库组成的克隆中分离。
“基因”可包含通常控制其表达的启动子和/或其他表达-调节序列，它可包含内含子，或者它可仅由编码序列组成，例如cDNA序列。
基因的“变异体”是这样的物质，(i)它可用来制备一种多肽或其一个片段，后者又可用来制备能够特异性地结合由所说基因编码的蛋白的抗体；或(ii)相应于该基因或一种上面定义的(i)型变异体的反义序列。例如，可以用与原来的密码子不同但编码相同氨基酸的密码子进行取代。此外，取代密码子可编码一种不同的氨基酸，但不影响蛋白的免疫活性，或提高其活性或免疫原性。例如，定点诱变或其他技术可用来产生单个或多重突变，例如取代、插入、删除和易位，如同Bostein和Shortle在“体外诱变的策略和应用”《科学》229193-1210(1985)中的介绍，该文在此引入作为参考。因为这样的修饰基因可根据这里的介绍应用熟知的技术获得，这样的修饰基因也包含在本发明的范围内。
而且，本领域的技术人员应当理解，本发明的基因序列(或其片段)可用于获得能在高度严谨条件下与其杂交的其他DNA序列。这种DNA包括任何基因组DNA。因此，本发明的基因包括显示与按本发明的方法鉴定的基因有55％、优选60％、最优选70％同源性的DNA，只要这种同源DNA编码一种能用于下面介绍的方法中的蛋白。另外，其他物种中的同源基因可通过证明预测的氨基酸序列与可获得的蛋白数据库中的氨基酸序列之间有至少约35％的同一性，优选35、40、50、60或更大的同一性，进行鉴定。
DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交可在含有0.1XSSC至6XSSC的液体溶液中、在55℃至65℃的温度下进行。本领域已经熟知，温度越高，SSC浓度越低，杂交条件就越严谨。“高度严谨”用来指2XSSC和65℃。1XSSC是0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。
基因的“变异体”包括这样的基因，在该基因相对较小的片段上(例如20至50个核苷酸)与本发明的基因的等位片段具有高度的同源性(至少50％，优选至少90或95％)，即使两种基因的整个同源性可能非常低。这是因为，即使蛋白的一般结构不同，但重要的活性或结合位点可能相同。
本发明还包括显示与本发明的基因编码的预测氨基酸序列具有至少30％同一性、优选35、40、50、60或更大％的同一性的氨基酸序列。
本发明的DNA序列优选在一种合适的宿主中表达来制备本发明的多肽。因此，编码本发明的多肽的DNA可根据已知技术并按照这里的介绍进行修改，用来构建表达载体，后者又可用来转化一种合适的宿主细胞，用来表达和制备本发明的多肽。这种技术包括1984年3月3日授予Rutter等的美国专利No.4,440,859、1985年7月23日授予Weissman等的美国专利No.4,530,901、1986年4月15日授予Crowl等的美国专利No.4,582,800、1987年6月30日授予Mark等的美国专利No.4,677,063、1987年7月7日授予Goeddel等的美国专利No.4,678,751、1987年11月3日授予Itakura等的美国专利No.4,704,362、1987年12月1日授予Murray等的美国专利No.4,710,463、1988年7月2日授予Toole，Jr.等的美国专利No.4,757,006、1988年8月23日授予Goeddel等的美国专利No.4,776,075以及1989年3月7日授予Stalker等的美国专利No.4,810,648中公开的技术，上述专利在此引入作为参考。
编码本发明的多肽的DNA可与多种其他DNA序列连接形成载体，用来导入合适的宿主。伴侣DNA依赖于宿主的本质、DNA导入宿主的方式以及是否需要游离体维持或整合。
DNA一般以适当的方向和正确的阅读框插入到一种表达载体例如质粒中用于表达。如果需要，DNA可与所需的宿主能够识别的合适转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，即使这种控制元件一般可由表达载体中获得。然后通过标准技术将载体导入宿主。一般来说，不是所有的宿主都被载体转化。因此，需要对转化的宿主细胞进行选择。一种选择技术涉及将在转化的宿主细胞中编码一种选择标记例如抗生素抗性的DNA序列以及任何必需的控制元件整合到表达载体中。此外，编码这种选择标记的基因可在另一种载体上，该载体被用来共转化所需的宿主细胞。
然后将本发明的重组DNA转化的宿主细胞在本领域的技术人员熟知的、根据这里的公开内容介绍的合适条件下培养足够的时间，使多肽表达，然后回收多肽。
多种表达系统已经知道，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(例如啤酒酵母)、丝状真菌(例如曲霉)、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
载体包含一种原核复制区域，例如ColE1 ori可用于在原核细胞中增殖，即使该载体被用于在其他非原核的细胞类型中表达。载体也可包含一种合适的启动子，例如一种能指导基因在被其转化的细菌宿主细胞如大肠杆菌中表达(转录和翻译)的原核启动子。
启动子是一种表达控制元件，它由能够允许RNA聚合酶结合并发生转录的DNA序列组成。与举例的细菌宿主匹配的启动子序列通常在质粒载体中提供，这种质粒含有方便的限制酶切位点，用于本发明的DNA片段插入。
典型的原核载体质粒为pUC18、pUC19、pBR322和可从BioradLaboratories(Richmond，CA，USA)获得的pBR329以及可从Pharmacia，Piscataway，NJ，USA获得的pTrc99A和pK223-3。
一种典型的哺乳动物细胞载体质粒为可从Pharmacia，Piscataway，NJ，USA获得的pSVL。该载体使用SV40晚期启动子驱动克隆基因的表达，最高表达水平出现在产生T抗原的细胞，例如COS-1细胞。
诱导型哺乳动物表达载体的一个例子是pMSG，它也可从Pharmacia获得。该载体使用小鼠乳腺瘤病毒长末端重复的糖皮质激素诱导型启动子驱动克隆基因的表达。
有用的酵母质粒载体为pRS403-406和pRS413-416，它们一般可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406为酵母整合型质粒(YIps)，并整合有酵母选择标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416为酵母着丝粒质粒(YCps)。
多种方法已被发展来将DNA与载体通过互补粘性末端操纵连接。例如，可以将互补的同源多聚体序列加入将要插入载体的DNA片段。然后使载体和DNA通过互补同源多聚体尾巴之间的氢键结合，形成重组DNA分子。
合成的、含有一种或多种限制酶切位点的接头可为DNA片段与载体连接提供另一种方法。按早期的介绍用限制酶切消化制备的DNA片段用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这两种酶能通过其3’-5’外切核酸酶活性除去突出的3’单链末端，并通过其聚合酶活性将凹进的3’末端补平。
因此这些活性的组合产生了平末端的DNA片段。然后将平末端片段与摩尔数大大过量的接头分子在酶的存在下温育，其中酶是能够催化平末端DNA分子连接的酶，例如噬菌体T4连接酶。这样，反应的产物就是在末端带有聚合物接头序列的DNA片段。然后用合适的限制内切酶切割这些DNA片段，并与已经用能够产生与DNA片段的末端相匹配的末端的酶切割的表达载体连接。
含有各种限制酶切位点的合成接头可从多种来源购买，包括International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USA。
修饰编码本发明的多肽的DNA的一种理想方法是按照Saiki等(1988)《科学》239487-491公开的方法使用聚合酶链反应。
在这种方法中，酶扩增DNA的两翼为两种特异性的引物，它们自身将整合进扩增的DNA。所说的特异性引物可含有限制酶识别位点，用于使用本领域熟知的方法克隆进表达载体。
在第4个方面，本发明涉及用本发明的多核苷酸载体结构物转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。细菌细胞是优选的原核细胞，并且通常为大肠杆菌，例如可从Bethesda ReserchLaboratories Inc.，Bethesda，MD，USA获得的DH5，以及可从Rockville，MD，USA的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的RR1。优选的真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，优选来自小鼠、大鼠、猴或人成纤维细胞系的脊椎动物细胞。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，它们一般可从Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA获得。优选的哺乳动物宿主细胞包括可从ATCC获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CCL61、可从ATCC获得的NIH Swiss小鼠胚细胞NIH/3T3细胞CRL1658以及可从ATCC获得的猴肾衍生的COS-1细胞CRL1650。
在第5个方面，本发明涉及本发明的多核苷酸载体结构物在制备医药用组合物中的用途。具体地说，制备疫苗，用于治疗或预防肿瘤，优选是禽肿瘤，尤其是那些与致癌禽病毒如MDV、ALV、劳氏相关病毒和网状内皮细胞增殖病毒有关的肿瘤。
在禽类中，用本发明的多核苷酸载体结构物的溶液对受精卵进行卵内注射是一种方便的给药模式。
用本发明的DNA结构物转化合适的宿主细胞通过熟知的方法来完成，并通常根据所用载体的类型。对原核宿主细胞的转化来说，见诸如Cohen等(1972)《美国科学院院刊》692110和Sambrook等(1989)《分子克隆实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY。酵母细胞的转化在Sherman等(1986)《酵母遗传学方法，实验室手册》Cold Spring Harbor，NY中介绍。Beggs(1978)《自然》275104-109的方法也有用。对于脊椎动物细胞，对这些细胞的转染有用的试剂如磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体制剂可从Stratagene Cloning Systems或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD，20877，USA获得。
电转化也可用于转化细胞，而且用其来转化酵母细胞、细菌细胞和脊椎动物细胞在本领域是熟知的。
例如，多种细菌可用Luehansky等(1988)《分子微生物学》2637-646中介绍的方法转化，该文在此引入作为参考。在25 uFD使用6250V每cm对悬浮于2.5X PEB的DNA-细胞混合物进行电转化，一般能得到最大数量的转化子。
电转化酵母的方法在Becker & Grarente(1990)《酶学方法》194182中介绍。
转化成功的细胞，即含有本发明的DNA结构物的细胞，可用熟知的技术进行鉴定。例如，由导入本发明的一种表达结构物而产生的细胞可进行培养来产生本发明的多肽。可收集细胞并裂解，并使用诸如Southern(1975)《分子生物学杂志》98503或Berent等(1985)《生物技术》3208中的方法检测其DNA中目标DNA的存在。此外，可使用抗体按这里的介绍检测上清中目标蛋白的存在。
除了直接检测重组DNA的存在，在重组DNA能指导蛋白表达时，成功的转化可通过熟知的免疫学方法进行证明。例如，用一种表达载体成功转化的细胞能产生显示合适抗原性的蛋白。收集可能转化了的细胞样品，使用合适的抗体检测目标蛋白。
因此，除了转化宿主细胞本身，本发明还包括一种营养培养基中这些细胞的培养物，优选是一种单克隆的培养物(克隆均一)，或由单克隆培养物衍生的培养物。
包含本发明的各个方面的非限制性实施例将参考

图1至7进行介绍。
图1质粒PI.18的表达，该质粒含有一个AV37抗原的开放阅读框(ORF)可以插入的EcoRV位点。
图2禽痘病毒转移质粒(pEFL929)，它含有一个AV37 ORF可以插入的SmaI位点。
图3HVT转移质粒(pVECo4)，它含有一个AV37 ORF可以插入的EcoRV位点。
图4杆状病毒转移质粒(pACYM1)，它在多克隆位点(mcs)中含有一个AV37 ORF可以插入的SmaI位点图5(a)编码AV37抗原以及成熟AV37抗原的氨基酸序列的DNA序列。
图5(b)成熟AV37抗原的氨基酸序列。
图6显示DELFIA的结果。沙门氏菌Ab用作阳性对照来表示DELFIA正常。参考数字1566、1568和1571为具有淋巴瘤的毒性MDV感染的禽的环数(2)；391V和PK/2365为已用毒性MDV超免疫的禽。
图7显示预先吸收AV37蛋白后的DELFIA结果。参考数字391V和1599表示带有淋巴瘤的毒性MDV感染的禽。
表1-遗传密码和单字母氨基酸命名(摘自Old & Primrose，《基因操作原理》，第三版，1985，附录7，346页，Blackwell ScientificPublications，Oxford，UK。)
a如果在起始位置编码Met丙氨酸 A 亮氨酸 L精氨酸 R 赖氨酸 K天冬酰胺N 甲硫氨酸M天冬氨酸D 苯丙氨酸F半胱氨酸C 脯氨酸 P胱氨酸 C 丝氨酸 S甘氨酸 G 苏氨酸 T谷氨酸 E 色氨酸 W谷氨酰胺Q 酪氨酸 Y组氨酸 H 缬氨酸 V异亮氨酸I针对马力克氏病病毒转化细胞系上表达的一种宿主抗原的单克隆抗体AV37的制备分泌mAb AV37的杂交瘤的制备从MD肿瘤分离细胞，体外培养，制备永生化的细胞系[Powell，L.N.，Payne，L.N.，Frazier，J.A.和Rennie，M.C.(1975)《致癌和疱疹病毒II》，de-Thé，G.Epstein，M.A.和zurHausen，H.(编辑)IARC Scientific Publications no.11，Lyon]。从MDV转化的细胞系HP9[Payne，L.N.(1981)《国际癌症杂志》28757-766]取107细胞，与Quli A一起经腹膜内途径注射给一只成年BALB/c小鼠。4周后，从MDV转化的细胞系MDCC-HP89[Payne，L.N.(1981)《国际癌症杂志》28757-766]取107细胞，经相同途径在无佐剂的条件下注射给该鼠。8周后用107MDCC-HP89细胞重复此步骤。6周后，通过静脉途径注射107MDCC-HP89细胞，并在1天后经腹膜途径注射107MDCC-HP89细胞，以加强小鼠的免疫应答。3天后处死小鼠，取出脾脏，制备脾细胞。使用聚乙二醇使脾细胞与NS1骨髓瘤细胞融合来制备杂交瘤细胞[Kohler，G和Milstein，C.(1975)《自然》256495-497]。克隆杂交瘤，一个孔---349(AD4a)中的细胞分泌一株抗体，该抗体在用于流式细胞仪分析时，能够与至少90％的MDCC-HP9或-HP89细胞系产生阳性的免疫反应，而识别少于10％的胸腺细胞。选择此克隆，并进行下一轮的克隆，筛选对MDV转化细胞系细胞的阳性反应。所选择的杂交瘤对HP9和HP89细胞系细胞产生阳性应答，但对来自未感染的禽的淋巴细胞不应答。此两次克隆的杂交瘤被命名为AV37，并于1998年3月3日根据布达佩斯条约保藏于ECACC，保藏号为98030304。使用mAb AV37鉴定表达AV37抗原的细胞AV37克隆分泌的单克隆抗体(mAb AV37)能够识别基本上所有MD肿瘤衍生的细胞系细胞上存在的一种抗原，除了细胞系MDCC-MSB-1[Yamada M.，Matsuda，H.和Hii，S.(1983)GANN，74502-508]。AV37抗原在来自未感染禽的淋巴细胞上不显示表达(脾、胸腺、法氏囊或骨髓)。但该单克隆抗体似乎能对少数外周血淋巴细胞产生弱的阳性应答(＜0.1％的群体)。用植物凝集素伴刀豆球蛋白A刺激淋巴细胞并加入来自活化的淋巴母细胞的条件培养基可增加表达AV37抗原的细胞比例(最大达6％)。MDV感染后，在感染后的第3天和第7天，抗原在2％的外周血淋巴细胞上检测到。在感染后第5天在脾细胞上和在感染后第12天在胸腺细胞上也检测到该抗原。
AV37抗原在不同MD肿瘤的不同细胞部分(2-70％)中存在。这些AV37+细胞分散于肿瘤组织，但趋向于在不同的区域聚集。流式细胞仪分析显示，多数AV37+肿瘤细胞为CD4+，并表达高水平的MDV基因产物meq，它是一种具有转录因子活性的碱性亮氨酸拉链蛋白，但不存在参与裂解性感染的病毒蛋白---pp38和gB。高比例的CD4+AV37+细胞显示于细胞周期的S-G2M期，但只有少部分具有微二倍体DNA，这表明该细胞群体正在活跃增殖，而不是经历活化诱导的细胞程序性死亡。meq在体外与阻断细胞程序性死亡有关，这说明肿瘤中的AV37+细胞是永生化的，因此很可能是赘生性转化细胞。一个进一步的重要发现是，AV37单克隆抗体识别的抗原在其他禽致癌病毒转化的细胞系上表达，这包括逆转录病毒如禽白血病病毒和网状内皮细胞增殖病毒(见表2)。这表明，AV37抗原是一种禽肿瘤特异性抗原。
表2-mAbs AV37对禽细胞系MATSAs的反应性
表2的关键词1 ALV＝禽白血病病毒；MDV＝马立克氏病病毒；MNNG＝甲基硝基亚硝基胍；RAV＝劳氏相关病毒；REV＝网状内皮细胞增殖病毒。2 HL SC＝Hyline Poultry Farms，Dallas Centre，IA，USA；RIR-RhodeIsland Red；RPRL-区域家禽研究实验室，East Lansing，MI，USA.3 Oghura，H.et al.(1984)GANN，75，410-414；Hihara，H.et al.(1974)Natl.Inst.Animal Health Quart.14，163-173；Baba，T.W.(1985)《病毒学》144，139-151；Nazerian，K.et al.(1977)禽疾病21，69-76；Okazaki，W.et al.(1980)禽类病理学9，311-329；Powell，P.C.et al.(1974)《自然》251，79-80；Payne，L.N.et al.(1981)《国际癌症杂志》28，757-766；Nazerian，K.(1987)禽类病理学16，527-544；Akiyama，Y.and Kato，S.(1974)Biken，17，105-116；Shaw，I.(1997)PhD thesis，University of London.AV37抗原的鉴定AV37抗原的纯化AV37抗原从HP9细胞纯化，该细胞的表面蛋白已按照Vainio，O.，Riwar，B.，Brown，M.H.和Lassila，O.(1991)《免疫学杂志》1471593-1599介绍的方法使用乳过氧化氢酶用Na125I进行了标记。细胞表面蛋白用含有蛋白酶抑制剂的2％NP40裂解缓冲液溶解。与AV37抗体组成一种可溶性免疫复合物的放射性标记的抗原用已经结合了链球菌蛋白G的兔抗鼠免疫球蛋白抗体免疫沉淀。将免疫沉淀用含有或不含有巯基乙醇的缓冲液解离[Laemmli，U.K.(1990)《自然》227680-685]。当用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时，在还原和非还原条件下，放射性标记的抗原都显示具有75kDa的相对分子量。AV37基因的克隆和测序(i)表达被AV37单克隆抗体识别的抗原的基因从一个互补DNA(cDNA)文库中克隆，该文库从一种MDV转化细胞系的细胞制备。使用Chirgwin等的方法从HP9细胞制备信使RNA[Chirgwin，J.M.Przbyla，A.E.，MacDonald，R.J.和Rutter，W.J.(1979)《生物化学》185294-5299]，并用寡聚(dT)色谱纯化。将双链DNA与非自身互补的BstX1接头连接，用琼脂糖凝胶电泳进行分子量大小分离，并插入质粒pCDM8[Seed，B.(1987)《自然》329840-842]。将连接的DNA电转化进大肠杆菌MC1061/p3[Dower，W.J.，Miller，J.F.和Ragsdale，C.W.(1988)《核酸探索》166127-6145]。质粒由混合的转化克隆用标准方法制备[Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)《分子克隆实验室手册》，Cold SpringHarbor，New York]。COS-7细胞转染在悬液中或在粘附细胞上进行[Metzelaar，M，Winjgaard，P.L.J.，Peters，P.，Sixma，J.J.，Nieuwenhuis，H.K.和Clevers，H.C.(1991)《生物化学杂志》2663239-3245].用单克隆抗体AV37筛选丙酮固定的转染细胞以及从阳性染色的细胞回收质粒按Horst的介绍进行[Horst，M.，Wijngaard，P.L.J.，Metzelaar，M.，Bast，E.J.E.G.和Clevers，H.C.(1991)《核酸探索》194556]。该AV37+克隆被命名为pMAT1。一种对照单克隆抗体AV7不能检测到用pMAT1转染的染色细胞，即使这些转染细胞能用单克隆抗体AV37强烈地染色。使用PRISMTMReady ReactionDye DeoxyTMTerminator cycle测序试剂盒(Applied Biosystems)对pMAT1克隆进行测序。测定该克隆每条链的全部序列。序列数据用Wisconsin Package软件(Genetics Computer Group)分析[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]。完整的核酸和氨基酸序列示于图5(a)。UW-GCG软件包[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]被用来搜寻各种DNA数据。
意外的是，使用Southern印迹分析在MDV DNA上没有检测到编码AV37抗原的基因，这表明它不是一种病毒基因。但使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从未感染的鸡淋巴细胞和孵育5天的鸡蛋细胞的总RNA抽提物中扩增到了该基因。这表明AV37是癌胚抗原，类似哺乳动物中介绍的癌胚抗原[综述Boon，T.和Old，L.J.《当代免疫学评论》(1997)9681-683；Van den Eyde，B.和vand der Bruggen，P.《当代免疫学评论》(1997)9684-693]。
AV37单克隆抗体还能识别用其他致癌病毒转化制备的淋巴母细胞系。用细胞系获得的阳性应答见表2(上文)的介绍。这表明，AV37抗原是转化的一种标记，并存在于由其他致癌病毒产生的肿瘤细胞。
(ii)表达被AV37单克隆抗体识别的抗原的基因从一个互补DNA(cDNA)文库中克隆，该文库从马力克氏病病毒转化的淋巴母细胞系MDCC-HP9制备。所有的MDCC-HP9细胞都表达非常高水平的AV37抗原。使用Chirgwin等的方法从HP9细胞制备信使RNA[Chirgwin，J.M.Przbyla，A.E.，MacDonald，R.J.和Rutter，W.J.(1979)《生物化学》185294-5299]，并用寡聚(dT)色谱纯化。将双链DNA与非自身互补的BstX1接头连接，用琼脂糖凝胶电泳进行分子量大小分离，并插入质粒载体pCI-nx，该质粒由IAH，Compton的J.Young博士赠送。pCI-nx是商业化质粒pCI-neo(Promega，Madison，Wisconsin)的一个变异体。将该文库电转化进大肠杆菌MC1061/p3[Dower，W.J.，Miller，J.F.和Ragsdale，C.W.(1988)《核酸探索》166127-6145]。质粒由混合的转化克隆用标准方法制备[Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)《分子克隆实验室手册》，Cold Spring Harbor，New York]。COS-7细胞转染在悬液中进行[Metzelaar，M，Winjgaard，P.L.J.，Peters，P.，Sixma，J.J.，Nieuwenhuis，H.K.和Clevers，H.C.(1991)《生物化学杂志》2663239-3245]。将包被了羊抗鼠免疫球蛋白的Dynabeads M280(Dynal，Oslo，Norway)与AV37抗体温育，洗涤并与转染了HP9文库的COS-7细胞温育。然后将它们按O’Regan等的介绍进行磁分选[O’Regan，M.N.，Parsons，K.R.，Tregaskes，C.A.和Young，J.R.(1999)《免疫遗传学》4968-71]。进行3轮这样的选择和富集。分离了24个阳性克隆。对能够在转染进COS-7细胞或鸡胚成纤维细胞时表达AV37抗原的克隆进行测序。AV37基因由MWG-Bicotech(Milton Keynes，UK)使用LICOR 4200系统进行测序。对克隆进行两条链的完整测序。
UW-GCG软件包[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]被用来搜寻各种DNA数据。这些搜寻表明，AV37是肿瘤坏死因子受体超家族的一个成员。
成熟的AV37抗原是一种446aa的1型膜蛋白，与(1)人和小鼠CD30最为相似，它与人和小鼠CD30的全部氨基酸的同一性大约为32％。AV37抗原的氨基酸序列为直接测定氨基酸序列，从MDCC HP9细胞系直接分离AV37抗原。在对HP9细胞的膜蛋白裂解物进行免疫印迹(Western印迹)后，AV37抗体与一个70kDa的条带反应。AV37单克隆通过在含有无免疫球蛋白血清的培养基中培养杂交瘤细胞进行制备。AV37免疫球蛋白用蛋白A(Pharmacia)纯化，接着与CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia)使用标准的技术偶联[Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Marulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W(1999)《当代免疫学方法》第2版第8章，suppl.29，John Wiley和Sons Inc.]。膜蛋白裂解物从1010HP细胞制备，将裂解物通过AV37-Sepharose柱，洗脱含有AV37抗原的级份。对级份样品进行免疫印迹来鉴定含有AV37抗原的级份。(在对HP9细胞的膜蛋白裂解物进行免疫印迹(Western印迹)后，AV37抗体与一个70kDa的条带反应。)。将阳性级份混合，用丙酮沉淀，并制备来用于使用Edman降解进行N-末端测序[见Niall，HD(1973)《酶学方法》2卷，942-1010页]。测定7个N-末端氨基酸，这证明了成熟AV37蛋白的预测起始位点(氨基酸22)。编码AV37抗原的核酸在载体构建和免疫方法及组合物中的用途1.AV37 ORF的来源编码AV37抗原的开放阅读框(ORF)可使用PCR扩增一种cDNA克隆(pMAT1.AV37)来获得，使用如下引物。
适用于获得AV37基因的ORF的引物对举例正向5’-TGG AAA GGA ACT GGA GTG-3’(SEQ ID No.6)反向5’-GCA AGC TGT GAA TTA GCC-3’(SEQ ID No.7)正向5’-CTG CTG CTT CTC CAG GAC ATT C-3’ (SEQ ID No.8)
反向5’-ATT CCT TTC CCT CCT CTT CCA C-3’ (SEQ ID No.9)正向5’-AGA CTT CAG GAG GAG CAA C-3’ (SEQ ID No.10)反向5’-GCT TCA CAC ACC TTC TCA G-3’ (SEQ ID No.11)这些引物被设计来扩增两翼含有EcoRV位点的AV37的ORF。
应当理解，每种引物也可单独用作杂交探针(如放射标记探针)，根据标准技术检测图5(a)(SEQ ID No.1)的AV37核苷酸序列的变异体。2.表达质粒的构建上面获得的PCR产物可用EcoRV消化，并将片段克隆进表达质粒PI.18(图1)的EcoRV位点。PI.18质粒获自J.S.Robertson博士，National Institute of Biological Standards and Control，SouthMimms，EN6 3QG，UK。它由pUC质粒[Sambrook等(1989)《分子克隆实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY]衍生，并且是非活动性的。它已被用来通过遗传工程在哺乳动物和禽细胞中表达外源基因。表达由HCMV的即时早期启动子驱动，并通过在启动子和克隆位点间含有一个内含子来优化。转录由CMV polyA信号终止。AV37片段的方向可用限制酶分析来检测，并用测序来证明正确的方向。获得的重组质粒(PI.18-AV37)可转染进鸡胚成纤维细胞，并且AV37抗原在CMV I.E.启动子控制下的表达可使用mAb AV37进行免疫荧光方法来检测。该质粒可直接用于对鸡免疫接种。它优选首先在QiagenTM阴离子交换树脂上纯化。免疫接种方法鸡可以用各种剂量的重组质粒DNA(30-100ug)在腿和胸的多个位点进行免疫接种。加强免疫可在适当间隔后(例如15天)进行，并用一种MDV的毒性株(RB1B)对鸡进行攻击。仅用质粒PI.18免疫的鸡用作对照。3.禽痘病毒重组体的构建在本实施例中，通过插入本发明的一种编码AV37的核苷酸序列来对一种已知禽疫苗进行修饰。所产生的试剂因而含有本发明的一种核苷酸序列/多肽和一种已知禽疫苗的组合物。
含有AV37 ORF的EcoRV片段可从PI.18-AV37通过EcoRV消化获得，并克隆进禽痘病毒转移质粒pEFL29(图2)的SmaI位点。AV37基因的正确方向可按照上面的介绍进行检测。将该结构物转染进鸡胚成纤维细胞，该细胞已按照Yu等人(1994)[《疫苗》12227-237]和Li等人(1994)[《病毒学方法杂志》50185-196]的介绍预先转染了禽痘病毒的FP9株。重组病毒子代可通过在存在Bluogal(Sigma)时形成兰色空斑来鉴定，Bluogal是β-半乳糖苷酶的一种底物。可空斑纯化一定数量的重组病毒，并使用单克隆抗体AV37通过免疫荧光技术检测AV37的表达。免疫接种方法鸡可通过i/m或皮内接种，通常使用翅膀上划痕，并可使用不同接种剂量(例如106-107空斑形成单位)的重组病毒。它们可在14天后使用相同的剂量和相同途径进行第2次免疫来进行加强免疫。接种的鸡和用FP9载体免疫的对照在6天后可用RB1B病毒攻击。4.火鸡疱疹病毒(HVT)重组体的构建在本实施例中，通过插入本发明的一种编码AV37的核苷酸序列来对一种已知禽疫苗进行修饰。所产生的试剂因而含有本发明的一种核苷酸序列/多肽和一种已知禽疫苗的组合物。
按上面的介绍获得的含有AV37 ORF的EcoRV片段可克隆进HVT转移质粒pVECo4(图3)[Sondermeijer等(1993)《疫苗》11349-358]的EcoRV位点。AV37基因的正确方向可按照上面的介绍进行检测。将该结构物和感染性HVT DNA按介绍共转染进CEF(Morgan等(1992)《禽类疾病》36858-870；Ross等(1993)《普通病毒学杂志》，74371-377)。可挑取一定数量病毒空斑，并按照上面的介绍，通过筛选表达AV37的感染CEF对重组病毒进行鉴定。免疫接种方法鸡可通过i/m接种1000至5000空斑形成单位的重组HVT或亲本HVT，并可在6天后用RB1B病毒攻击。5.杆状病毒重组体含有AV37 ORF的EcoRV片段可克隆进杆状病毒转移质粒PACYMI(图4)的多克隆位点(mcs)中的SmaI位点[Matsuura，Y.等(1987)《普通病毒学杂志》681233-1250]。重组质粒和线形化的杆状病毒DNA可按照Matsuura，Y.等(1987)的介绍共转染进SF9昆虫细胞。空斑纯化子代病毒，并通过上面介绍的免疫荧光方法检测它们在SF9细胞中表达AV37抗原的能力。免疫接种方法感染SF9细胞的抽提物或用亲和色谱纯化的AV37抗原可用于免疫接种。对于初次接种，抗原可在福氏完全佐剂中乳化。在合适的间隔后(如3周)，使用不完全佐剂进行进一步的接种，最后一次接种不使用佐剂。在最后一次接种1周后，用RB1B病毒攻击接种的鸡。用感染了野生型杆状病毒的昆虫细胞抽提物免疫的鸡作为对照。
在所有的接种策略中，提供的保护程度可以通过观察受体禽的MD的临床症状和肿瘤形成来测定。可在合适的间隔时间后收集血样品，筛选抗AV37抗原的抗体的存在。所有的受体禽可在例如15-26周后处死，并进行尸检，检测肿瘤的征兆。6.进一步免疫接种的方法鸡可通过卵内途径进行接种。在孵化18天的受精卵的壳上钻孔，将高达0.1ml的含有HVT、禽痘病毒载体或杆状病毒载体中的重组AV37抗原或质粒DNA形式注射进正在发育的鸡胚的尿囊腔或羊膜腔。非常有用的自动化卵注射装置可从Embrex Inc.，USA获得。
无佐剂的进一步接种可在合适的间隔后(例如2-3周)经适当途径给予孵化的鸡。接种的鸡在最后一次接种1周后用RB1B病毒攻击。将HVT、禽痘病毒或用野生型杆状病毒感染的昆虫细胞的抽提物免疫的鸡用作各自的对照。7.在MDV感染的鸡中诱导了一种针对AV37的明显免疫应答从下列途径获得血清(1)已用一种毒性MDV超感染的遗传抗性鸡和(2)已用毒性MDV感染并产生淋巴瘤的易感鸡。这些血清在免疫吸附试验中与纯化的AV37抗原阳性反应(图6)。相反，来自无病鸡的对照血清在免疫吸附试验中不与纯化的AV37抗原反应。这说明MDV感染的鸡和免疫的鸡产生了针对AV37抗原的抗体。另外，当这些血清与纯化的AV37抗原预温育时，抗体从血清中排除，阳性读数消失(图7)。实验简述品系6的鸡对MD具有遗传抗性，他们通过重复注射一种MDV致癌株(HPRS-16株)进行超免疫。收集血清，并贮存于-20℃以备分析。此外，对MD易感的罗德岛红鸡用MDV(HPRS-16株)感染，并在产生马力克氏病淋巴瘤后收集血清。对照血清从处于无病环境的相同品系的鸡中收集。
AV37单克隆通过在含有无免疫球蛋白血清的培养基中培养杂交瘤细胞制备。免疫球蛋白用蛋白A(Pharmacia)纯化，接着与CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia)使用标准的技术偶联[Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Marulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W(1999)《当代免疫学方法》第2版第8章，suppl.29，John Wiley和Sons Inc.]。膜蛋白裂解物从1010HP细胞制备，将裂解物通过AV37-Sepharose柱，洗脱含有AV37抗原的级份。对级份样品进行免疫印迹来鉴定含有AV37抗原的级份。
通过在4℃温育含有纯化的AV37抗原的裂解物过夜，将AV37抗原包被到塑料微滴定板的孔中。洗涤板并用含有牛血清白蛋白作为封闭试剂的封闭缓冲液进行封闭。稀释来自MDV免疫鸡的超免疫血清、来自带有肿瘤的MDV感染鸡血清或来自未感染鸡的对照血清，并在AV37包被的孔中温育。将板洗涤3次，然后与已经接合了Europium的抗鸡免疫球蛋白温育，并用于解离增强的镧荧光试验(DELFIA)[Wood，P.& Barnard，G.(1997)《免疫试验的原理和实践》PriceDavid C.P.编辑，17章，Newman Macmillan，London]。与来自来感染的鸡的血清相比，超免疫血清和来自带有肿瘤的MDV感染鸡的血清反应为阳性(镧荧光较强)(见图6)。
为检测该应答是否为特异性的，将相同的血清在已经包被了纯化的AV37抗原或马血清的孔中预温育。然后将样品用于DELFIA。超免疫血清和来自带有肿瘤的MDV感染鸡的血清在DELFIA中不能反应(图7)，这表明，血清中的AV37特异性抗体已被除去。
序列表<110>Institute of Animal Health<120>生物物质及其使用<130>INST-P20757PC<140><141><150>GB 9809070.7<151>1998-04-29<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1956<212>DNA<213>Gallus sp.<220><221>成熟肽<222>(205)..(1605)<400>1tcgagaattc acgcgtggta cctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgctgga 60aaggaactgg agtggccctg gacttggtga gcggacactg agcgaggctg gactggacgc 120tgggagggtc ccagacttca ggaggagcaa cctggctgtc agacctgcaa tgctgggaga 180tcaggaaagc taacgccact gcagatggct tcctgcagcc tgagactggg actgtggctc 240ctgctgcttc tccaggacat tcagggagcc ccacagccac cgttcacctc atctcattcc 300tgtgacacac tcaagaattg gttctatgat gaaacattag ggaggtgctg ttaccagtgc 360ccttcaggct atgctaaaaa gaaatcatgt cccatggatc cagatgaaga ctgcatgaga 420tgtggacctg agcaatacct gaatcagtcc ccaaagccac gatgtgatgc ttgtgtgtta 480tgcaccaaag aatttgacct tgtggagaag gccccctgct ccttcaattc cagccgggtg 540tgtgagtgtc gaccagggat gttttgccag actgctgcta agaacacctg catgcgatgc 600cagcggcaca ctgcttgcaa gcctggtttt ggggtcaaaa tcagaggcac ttcagagact 660gatgtttcat gtgaggaatg ccctcctggg accttctctg accaaagctc cagcactgac 720gtctgcaagc cccacacgga ctgtgccaag ttgaacaaag tagcacaagg caaaggaaat 780gccacccatg atcaggtttg cacggaccaa ttgccctcct acctcacccc agacacctcc 840tccatcagaa tcaccaatga gacagatgac tctgacgtac tgaagcgtaa tgcaaacccg 900gtgacccttg ctagcatcct ttcaagtgcc acaaccgaaa ttcccggttc aactcccgag 960gaggaagctc tggctggcac ttctcccacc ttagccaagg gggaaacaac aacgagaggt 1020cttgttttct gggcagtggt tctctctgtg atggtgctac ctgtgggcat gctgtcattt 1080tggcaatgga aggtctgcaa gaaacggatc ttcatcctca aacaaaagcg ttctgatcta 1140gtggacaaat atgcaaagat cacactgacc actgacaaat gtccagaaga ggaggagtta 1200actgacagga gcctcccttt ggaaaccaac aacaacaact tgatctccag tgctgaaaaa 1260gcaggtagtc ctgttctgag tctgactgaa gtgacgcaga gcaatggaaa agcgccagat 1320ggccccattg attctcaagt gagagaccac acaaataatc agattggaaa aatattcatc 1380atgaacgccg ataccgttat tgtggggtct tcaaaaacgc ctggtatcaa gagctgcact 1440gctaggggat atgaaactga tgttgatctc caggaaaaga tggaagagga gctgtcaatg 1500cactatccag agcaggagac agaggttttt ccagggaatg atgtcatggt tcctgtggaa 1560gaggagggaa aggaattcca tcaccccacc acggccactg agaagtgatc gcctgctgag 1620aaggtgtgtg aagctacagc aacatccagt gacactaagc ctgaacccac actgagggag 1680gtaaacccag agtgtcttac acgacctgaa aactcacgta aagcaccaaa aacattcagc 1740ttatttcatc cagctaattg agaggatcat ccagaccact ggttcacatc aaacactttt 1800ccttgccctc ccagaatcat gctggaaaca aactggaatc aaagttacag aattcagagg 1860acttctggag gctaattcac agcttgcttt gtctgcatga agggatggaa ttaaaatggt 1920tactcctatt agctctgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa1956<210>2<211>467<212>PRT<213>Gallus sp.<400>2Met Ala Ser Cys Ser Leu Arg Leu Gly Leu Trp Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gln Asp Ile Gln Gly Ala Pro Gln Pro Pro Phe Thr Ser Ser His Ser20 25 30Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp Phe Tyr Asp Glu Thr Leu Gly Arg Cys35 40 45Cys Tyr Gln Cys Pro Ser Gly Tyr Ala Lys Lys Lys Ser Cys Pro Met50 55 60Asp Pro Asp Glu Asp Cys Met Arg Cys Gly Pro Glu Gln Tyr Leu Asn65 70 75 80Gln Ser Pro Lys Pro Arg Cys Asp Ala Cys Val Leu Cys Thr Lys Glu85 90 95Phe Asp Leu Val Glu Lys Ala Pro Cys Ser Phe Asn Ser Ser Arg Val100 105 110Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Phe Cys Gln Thr Ala Ala Lys Asn Thr115 120 125Cys Met Arg Cys Gln Arg His Thr Ala Cys Lys Pro Gly Phe Gly Val130 135 140Lys Ile Arg Gly Thr Ser Glu Thr Asp Val Ser Cys Glu Glu Cys Pro145 150 155 160Pro Gly Thr Phe Ser Asp Gln Ser Ser Ser Thr Asp Val Cys Lys Pro165 170 175His Thr Asp Cys Ala Lys Leu Asn Lys Val Ala Gln Gly Lys Gly Asn180 185 190Ala Thr His Asp Gln Val Cys Thr Asp Gln Leu Pro Ser Tyr Leu Thr195 200 205Pro Asp Thr Ser Ser Ile Arg Ile Thr Asn Glu Thr Asp Asp Ser Asp210 215 220Val Leu Lys Arg Asn Ala Asn Pro Val Thr Leu Ala Ser Ile Leu Ser225 230 235 240Ser Ala Thr Thr Glu Ile Pro Gly Ser Thr Pro Glu Glu Glu Ala Leu245 250 255Ala Gly Thr Ser Pro Thr Leu Ala Lys Gly Glu Thr Thr Thr Arg Gly260 265 270Leu Val Phe Trp Ala Val Val Leu Ser Val Met Val Leu Pro Val Gly275 280 285Met Leu Ser Phe Trp Gln Trp Lys Val Cys Lys Lys Arg Ile Phe Ile290 295 300Leu Lys Gln Lys Arg Ser Asp Leu Val Asp Lys Tyr Ala Lys Ile Thr305 310 315 320Leu Thr Thr Asp Lys Cys Pro Glu Glu Glu Glu Leu Thr Asp Arg Ser325 330 335Leu Pro Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asn Leu Ile Ser Ser Ala Glu Lys340 345 350Ala Gly Ser Pro Val Leu Ser Leu Thr Glu Val Thr Gln Ser Asn Gly355 360 365Lys Ala Pro Asp Gly Pro Ile Asp Ser Gln Val Arg Asp His Thr Asn370 375 380Asn Gln Ile Gly Lys Ile Phe Ile Met Asn Ala Asp Thr Val Ile Val385 390 395 400Gly Ser Ser Lys Thr Pro Gly Ile Lys Ser Cys Thr Ala Arg Gly Tyr
405 410 415Glu Thr Asp Val Asp Leu Gln Glu Lys Met Glu Glu Glu Leu Ser Met420 425 430His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Val Phe Pro Gly Asn Asp Val Met435 440 445Val Pro Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Phe His His Pro Thr Thr Ala450 455 460Thr Glu Lys465<210>3<211>16<212>PRT<213>Gallus sp.<400>3Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp Phe Tyr Asp Glu Thr Leu Gly Arg Cys1 5 10 15<210>4<211>22<212>PRT<213>Gallus sp.<400>4Asp Val Met Val Pro Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Phe His His Pro1 5 10 15Thr Thr Ala Thr Glu Lys20<210>5<211>22<212>PRT<213>Gallus sp.<400>5Gln Pro Pro Phe Thr Ser Ser His Ser Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp1 5 10 15Phe Tyr Asp Glu Thr Leu
20<210>6<211>18<212>DNA<213>Gallus sp.<400>6tggaaaggaa ctggagtg 18<210>7<211>18<212>DNA<213>Gallus sp.<400>7gcaagctgtg aattagcc 18<210>8<211>22<212>DNA<213>Gallus sp.<400>8ctgctgcttc tccaggacat tc 22<210>9<211>22<212>DNA<213>Gallus sp.<400>9attcctttcc ctcctcttcc ac 22<210>10<211>19<212>DNA<213>Gallus sp.<400>10agacttcagg aggagcaac 19<210>11<211>19<212>DNA<213>Gallus sp.<400>11gcttcacaca ccttctcag19
权利要求
1.一种能被杂交瘤AV37分泌的单克隆抗体识别的纯化多肽，其中该杂交瘤根据布达佩斯条约于1998年3月3日保藏在位于英国的欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，保藏号为98030304。
2.权利要求1的多肽，其中多肽表达在被一种致癌禽病毒转化的细胞系上。
3.权利要求2的多肽，其中致癌性禽病毒选自马力克氏病病毒、禽白血病病毒、劳氏相关病毒或网状内皮细胞增殖病毒。
4.权利要求3的多肽，其中病毒是马力克氏病病毒。
5.一种多肽，优选是权利要求1-4任一项的多肽，其中该多肽含有图5(b)(SEQ ID No.2)的氨基酸序列的全部或一个片段或变异体。
6.权利要求5的多肽，它具有选自如下的AV37多肽的氨基酸序列(a)NH2-QPPFTSSHSCDTLKNWFYDETL-COOH(SEQ ID No.5)；和(b)NH2-DVMVPVEEEGKEFHHPTTATEK-COOH(SEQ ID No.4)；和/或(c)NH2-CDTLKNWFYDETLGRC-COOH(SEQ ID No.3)。
7.针对权利要求1-6任一项的多肽制备的单克隆抗体。
8.能被权利要求7的单克隆抗体识别的纯化多肽。
9.编码权利要求1至6任一项或8的多肽的分离核苷酸序列或其变异体。
10.编码权利要求1至6任一项或8的多肽的分离DNA序列或其变异体。
11.权利要求10的DNA序列，它包含示于图5(a)(SEQ ID No.1)的核苷酸序列的全部或部分。
12.含有权利要求9至11任一项的核苷酸序列的多核苷酸载体结构物。
13.含有权利要求10或11的DNA序列的表达载体，其中DNA序列被安排在载体中，使该DNA序列在一种合适的宿主细胞中表达。
14.权利要求13的表达载体，其中载体包括质粒。
15.权利要求13的表达载体，其中载体包括病毒DNA。
16.权利要求15的表达载体，其中病毒DNA来自禽痘病毒、火鸡疱疹病毒和/或杆状病毒。
17.权利要求12至16任一项的载体或权利要求1至6任一项或8的多肽在制备一种医药用组合物中的用途。
18.权利要求12至16任一项的载体或权利要求1至6任一项或8的多肽在制备一种疫苗用组合物中的用途。
19.权利要求17或18的用途，用于制备治疗或预防禽肿瘤的组合物。
20.权利要求18的用途，其中疫苗是针对一种或多种致癌禽病毒。
21.权利要求20的用途，其中致癌性禽病毒选自马力克氏病病毒、禽白血病病毒、劳氏相关病毒或网状内皮细胞增殖病毒中的一种或多种。
22.权利要求17至21任一项的用途，与另一种疫苗组合使用。
23.权利要求22的用途，其中另一种疫苗选自HVT和禽痘病毒。
24.含有权利要求1至6任一项或8的多肽以及一种可药用赋形剂的组合物。
25.含有权利要求1至6任一项或8的多肽以及一种佐剂的组合物。
26.一种制备多肽的方法，包括在一种合适细胞中表达权利要求8至10任一项的核苷酸序列或其变异体，并纯化多肽。
27.根据布达佩斯条约于1998年3月3日保藏在ECACC，UK的杂交瘤AV37，其保藏号为98030304。
28.权利要求27的杂交瘤分泌的单克隆抗体。
29.权利要求7或28的单克隆抗体在一种鉴定多肽或其片段的方法中的用途。
30.用权利要求12至16任一项的多核苷酸载体结构物转化的宿主细胞。
31.选自如下序列的核苷酸序列5’-TGG AAA GGA ACT GGA GTG-3’(SEQ ID No.6)5’-GCA AGC TGT GAA TTA GCC-3’(SEQ ID No.7)5’-CTG CTG CTT CTC CAG GAC ATT C-3’ (SEQ ID No.8)5’-ATT CCT TTC CCT CCT CTT CCA C-3’ (SEQ ID No.9)5’-AGA CTT CAG GAG GAG CAA C-3’ (SEQ ID No.10)5’-GCT TCA CAC ACC TTC TCA G-3’ (SEQ ID No.11)
32.权利要求31的一种或多种核苷酸序列作为引物在核酸扩增反应中的用途。
33.权利要求31的一种或多种核苷酸序列作为杂交探针在检测权利要求9至11的核苷酸序列的变异体中的用途。
34.一种制备抗体的方法，包括提供权利要求1至6任一项或8的多肽或其片段或变异体；将该多肽或其片段或变异体给药于一种哺乳动物来产生抗体应答，并从该哺乳动物获得抗体。
35.一种制备能产生一种单克隆的杂交瘤的方法，包括提供权利要求1至6任一项或8的多肽或其片段或变异体；将该多肽或其片段或变异体给药于一种哺乳动物来产生抗体应答，从该哺乳动物中获得一种抗体产生细胞，并将它与一种永生细胞融合，形成一种能分泌单克隆抗体的杂交瘤。
36.通过权利要求34的方法获得的抗体。
37.用权利要求35的杂交瘤制备的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及编码与禽肿瘤特别是马力克氏病病毒相关的禽肿瘤有关的抗原的核酸和氨基酸序列。本发明还涉及这些序列在医药,特别是用于治疗和预防禽肿瘤的组合物的制备中的用途。
文档编号C12N15/12GK1307638SQ99808080
公开日2001年8月8日 申请日期1999年3月22日 优先权日1998年4月29日
发明者S·C·布格斯, T·F·达维森, L·J·N·罗斯 申请人:动物健康研究所有限公司