专利名称：多核苷酸序列及其在生产具有较多气孔的植物的方法中的应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及遗传工程植物。具体地讲，本发明涉及多核苷酸序列及其在生产相对非转化(现有的)类似植物而言具有较多气孔的植物的方法中的应用。在合适的条件下，本发明的植物可以表现出比现有植物较高的产量。本发明还提供了新的调控序列。
在英国，很多商业种植者使用天然气、煤油炉或液态二氧化碳增加其温室中二氧化碳的含量。温室作物的优点包括提高品质、产量和在冬季较低的外部光照条件下增强生长。不过，在较长期的栽培中，通过这种方法不能获得产量方面的完全的潜能。包括光合驯化在内的很多生理学和生物化学因素被认为会导致上述现象。不过，受到较少关注的一种重要因素是较高的二氧化碳含量对气孔保卫细胞的影响。二氧化碳不仅能降低气孔的直径，而且还能影响保卫细胞的发育，而且，特别是能降低在较高二氧化碳浓度下生长的叶片上形成的气孔的数量。上述因素预计会导致扩散阻力的增加和二氧化碳摄取的减弱。在温室种植莴苣、茄子、甜椒、黄瓜和番茄的情况下情况就是这样。反过来，二氧化碳摄取减少预计会表现为产量的降低。
对于温室种植者来说，另一个同样重要的问题是由高湿度导致的作物损害，这种高湿度通常是由于现代节能技术的使用和/或保持较高的二氧化碳环境所导致的。为了说明这一问题的严重性，有人做过估算，在高湿度下种植的番茄作物，通常其果实产量的降低高达10-15％，并且，在持续的高湿度条件下记录到过的产量降低为35％。对于在高湿度下黄瓜和长季番茄来说，蒸腾作用受到抑制，因此减少了养分(特别是钙)的摄入，导致叶焦病症状并且降低了有效的实际叶面积。在钙缺乏的情况下，相关的组织坏死使得所述作物特别易感病原体的侵害，导致作物潜力的进一步降低。对番茄来说，在高湿度下栽培会导致较低的果实产量和质量。高于平均湿度还会提供一种有利于某些病虫害发生的环境，这些病虫害可以影响作物的质量。因此，控制所述病虫害以及由于较高的二氧化碳含量所导致的有害作用将是有利的。当然，由于与在较高二氧化碳含量下生长相关的气孔抗性的同时增强，上述所有问题都有可能得到克服。
本发明通过提供能特别针对较高的二氧化碳浓度以增加其叶面上的气孔数量形式作出反应的植物，缓解了上述问题。在缺乏其他制约因素的情况下，这样预计会增强用于光合作用的二氧化碳的摄取，并提供较大的有效表面积，用于导致增强的蒸腾作用的水损失，并因此抵消钙的缺乏。来自在小麦、大麦、稻和菜豆上进行的碳同位素判别研究的数据表明，具有较低气孔抗性的基因型意味着较高的产量。
本发明还涉及能够调节基因表达，特别是在气孔保卫细胞中调节基因表达的多核苷酸序列及其变体。
基因在植物中的表达受多种调控因子的控制，包括核酸和蛋白因子。当植物基因以双链DNA形式存在时，表达的起始步骤包括通过聚合酶产生信使RNA。所述表达过程的这一部分的启动是由通常被称为“启动子”的区域控制的。启动子位于蛋白编码区的上游(5’)，并可以是组成型或组织特异性的发育-调节和/或诱导型的。
在启动子区内存在启动子的全部功能所必须的若干结构域。所述结构域中的第一个位于紧挨着结构基因的上游，并形成含有共有序列的“核心启动子区”，通常紧挨着该基因的上游有70个碱基对。所述核心启动子区含有特有的CAAT和TATA框，和旁侧序列，并具有一个转录起始序列，它形成所述结构基因的转录起始点。所述核心启动子区的精确长度是不确定的，通常容易了解。在所有启动子中，上述区域中通常存在某些变异。存在于各种已经研究的较清楚的“框”之间的碱基序列似乎不太重要。
核心启动子区的存在决定了一种序列是启动子如果缺乏该序列，该启动子是无功能的。并且，所述核心启动子区足于提供完全的启动子活性。通常位于所述核心上游的一系列调控序列构成该启动子的其余部分。调控序列决定表达水平、表达的空间和时间方式，对于一类重要启动子来说，决定在诱导条件下的表达(通过诸如光照、温度、化合物、激素的外部因素进行调节)。
对作物进行操作以便改变和/或改善表型特征(如生产质量或产量)可能需要在植物组织中表达外源基因。因此，所述遗传操作取决于根据需要启动并控制基因表达的方式的存在；例如，取决于合适启动子的存在和应用，所述启动子在植物中是有效的，并且能调节基因表达，以便在转基因植物中产生需要的效果。有利的是可以对多种不同启动子进行选择，以便选择具体基因、结构、细胞、组织、植物或环境的最合适的启动子。
源于细菌、病毒、真菌和植物的启动子(以及其他调控因子)业已被用于在植物细胞中控制基因表达。用包含与各种外源基因(例如，细菌标记基因)融合的各种启动子序列的DNA结构进行的多次植物转化实验业已导致了有用的启动子序列的鉴定。业已证实，在大多数情况下多达500-1000个碱基的序列足于进行外源基因的调控表达。不过，业已证实，大于1kb的序列可能具有有用的特征，它能够在转基因植物中进行基因的高水平表达。已知有多种天然存在的启动子能在植物中起作用，并且业已被用于在植物中启动异源(外源和内源)基因的表达例如，组成型35S花椰菜花叶病毒启动子、成熟强化番茄聚半乳糖醛酸酶启动子(Bird等，1988，植物分子生物学，11651-662)，E8启动子(Diekman & Fischer，1988，EMBO，73315-3320)和果实专一性2A11启动子(Pear等，1989，植物分子生物学，13639-651)以及很多其他启动子。
根据本发明，提供了一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制植物材料中能促进14-3-3型转录因子合成的脂肪酸的产生，或者抑制所述脂肪酸促进所述因子的合成；(ii)选择上述受到抑制的材料；和(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
本发明还提供了一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制含有序列1或序列2或序列8所示多核苷酸序列的内源基因的功能或破坏其活性；(ii)选择上述受到抑制的材料；(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
在实施本发明的上述方法时，所述内源基因可以包括互补于这样一种序列的多核苷酸序列，该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2或序列8所示序列杂交。
还提供了一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)用含有序列1或序列2或序列8所示序列的多核苷酸转化植物材料；(ii)选择所转化的材料；(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
用于上述方法的多核苷酸可以包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2或序列8所示序列杂交。特别优选的是，用于该方法的多核苷酸为反义取向。可以根据非转化对照植物和由此转化的植物之间的差别选择具有较多气孔的植物，在选择时对以上两种植物进行至少下列一种发芽后处理(i)较高的二氧化碳浓度；(ii)较高的钙；(iii)温度或压力极限；(iv)减少水的供应；(v)较高的环境污染气体，如臭氧、氮或硫的氧化物，和(vi)较高的光照条件。二氧化碳的浓度优选大于大约450ppm。更优选二氧化碳的浓度大于大约500ppm，最优选二氧化碳的浓度大于大约650ppm。
本发明还提供了由上述材料再生的形态上正常的可育全植株及其种子和后代，相对类似的对照植物而言它具有较多气孔。用本发明方法转化的植物可以包括大豆、棉花、烟草、甜菜、油用油菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草坪草、牧草、甘蔗、豌豆、蚕豆、稻、松、杨树、苹果、葡萄、藤本植物、黄瓜、辣椒、柑橘和坚果类植物。
本发明还提供了将含有序列1或序列2或序列8所示序列的多核苷酸用于生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法中的用途。可用于该方法的其他多核苷酸可以包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2或序列8所示序列杂交。用于该方法的多核苷酸可以由植物可操纵的启动子进行表达控制，并且还可以包括位于所述多核苷酸的蛋白编码区下游的转录终止区。具体地讲，可以使用下列启动子CaMV35S、FMV35S、NOS、OCS和E9。更优选的启动子可以是气孔保卫细胞专一性启动子。更优选的启动子可以包括在序列2或序列8所示的多核苷酸序列中。
还提供了一种包含序列2或序列8所示序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种包含序列2或序列8所示序列的表达调控序列。另人惊奇的是，业已发现该序列能够在气孔保卫细胞中进行异源基因的表达。本发明所提供的调控序列可以与上述本发明的多核苷酸组合使用。不过，本领域技术人员可以理解的是，所述调控序列可以与任何其他多种核苷酸组合应用于特别需要在气孔保卫细胞中转录的任何方法中。根据本发明，进一步提供了一种多核苷酸，它包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交，但当所述温度在60-70℃之间时不能杂交。所述多核苷酸可用于生产在遇到较高二氧化碳浓度时能增加其气孔指数(如下文所述)而不是降低该指数的植物。
所述多核苷酸可以包括序列2或序列8所示序列。所述多核苷酸所包含的蛋白编码区的旁侧可以是植物可操纵的启动子和终止子。所述启动子和终止子本身与本发明没有密切关系，这些启动子和终止子为本领域技术人员所公知，并且包括，例如，CaMV35S、FMV35S、NOS、OCS和E9(源于RUBISCO的小亚基)启动子和终止子。不过，特别优选的是，本发明多核苷酸的蛋白编码区的表达受气孔保卫细胞专一性启动子的控制。技术人员理解术语“专一性”并不一定意味着仅仅“局限于”，因此，在由转化过的材料(以便包括所述区)再生的植物中的其他部分不存在所述序列的表达。
本发明还包括含有本发明多核苷酸的植物转化载体。
在所述载体中，蛋白编码区(或其主要部分)与序列1、2和8所示序列相比为反义方向，因此该区的RNA产物能够导致-在含有它的植物材料中-与所述蛋白编码区具有明显相同性的内源基因的抑制。“明显”是指与所述序列的相同性至少为70％。
本发明还提供了由本发明的多核苷酸编码的翻译产物，特别是在它具有脂肪酸延伸酶活性的情况下。
本发明还提供了用本发明的多核苷酸或载体转化的植物材料，该核苷酸包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交。
所述植物材料可以用包含编码能够赋予植物对除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染抗性或耐性的蛋白的区域的多核苷酸转化过或者可以随后用它做进一步的转化。
能够赋予除草剂抗性的蛋白可选自下列一组草甘膦氧化还原酶(GOX)，5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)，膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，谷胱苷肽S转移酶(GST)，细胞色素P450，乙酰-COA羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合成酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PROTOX)，dihydropteroate合成酶，多胺转运蛋白，超氧化物歧化酶(SOD)，bromoxynil腈化酶，八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)，获自真养产碱菌的tfdA基因产物，以及所述蛋白的已知诱变或其他改进的变体。
可以转化植物材料的多核苷酸可以包括蛋白编码区的5’末端，它编码(i)能够将该区的翻译产物定向转运到诸如叶绿体、线粒体的质体，其他细胞器或植物细胞壁的肽和/或(ii)非翻译翻译增强序列。
所述多核苷酸可以是密码子优化型的，或者以其他方式改变，以便一旦其整合到植物材料中能至少增强转录。因此，用于转化所述材料的多核苷酸可以进行修饰，即可以去掉mRNA不稳定性编码基序和/或偶然剪接区，或者可以使用植物优选的密码子，以便所述修饰过的多核苷酸在植物中的表达能产生与通过在生物中表达未修饰过的核苷酸所获得的蛋白具有基本上相同的活性/功能的基本上相同的蛋白，其中，所述未修饰过的多核苷酸的蛋白编码区是内源的，其前提是，如果-就除草剂抗性赋予区而言-由此修饰过的多核苷酸包括植物优选的密码子的话，在所述修饰过的多核苷酸上的蛋白编码区和所述植物中所含有的编码大体上相同的蛋白的类似的蛋白编码区之间的相同性低于大约70％。
转化技术是众所周知的，并且包括粒子介导的biolistic转化，农杆菌属介导的转化，原生质体转化(可选地在有聚乙二醇的条件下)；在含有所述多核苷酸或载体的介质中对植物组织、细胞或原生质体进行超声处理；将所述多核苷酸或载体显微插入全能植物材料(可选地采用已知的碳化硅“晶须”技术，电穿孔等)。
本发明还提供了由上一段中提到的材料再生的形态上正常的可育全植株，以及所述植株的后代，所述植株和后代的种子，以及所述植株和后代的部分。本发明的转化植物包括小型谷类作物，油用作物、纤维作物、水果、蔬菜、种植园作物和树木。特别优选的上述植物包括大豆、棉花、烟草、甜菜、油用油菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草坪草、牧草、甘蔗、豌豆、蚕豆、稻、松、杨树、苹果、葡萄、黄瓜、辣椒、柑橘和坚果类植物。特别优选的部分包括切花。
本发明还提供了一种生产相对对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制植物材料中能促进14-3-3型转录因子合成的脂肪酸的产生，或者抑制所述脂肪酸促进所述因子的合成；(ii)选择上述受到抑制的材料；(iii)将所选择的材料再生成植株。
在所述方法的一种优选实施方案中，能促进或以其他方式增强所述转录因子合成的脂肪酸受到编码参与所述脂肪酸的生物合成途径的蛋白的内源植物基因的有义共抑制的抑制，或者受到同一个基因表达的反义抑制。反义抑制技术是众所周知的、完善的并且被本领域技术人员通常使用。通常，所述抑制技术通过产生反义mRNA在所述植物中起作用，所述mRNA互补于由所述内源基因产生的有义mRNA，并能与它杂交。
本发明的方法可以包括以下步骤(i)抑制或以其他方式破坏一种内源植物基因的活性，该基因包括互补于这样一个序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交；
(ii)选择上述受到抑制的材料；(iii)将所选择的材料再生成植株。
本发明的植物所含有的气孔数通常比现有的类似植物多至少10％。优选含有至少多出15％的气孔，更优选含有至少多出20％的气孔，更含有至少多出25％的气孔，更优选含有至少多出30％的气孔。
本领域技术人员可以理解的是，存在多种抑制或破坏基因功能的方法。尽管有义共抑制或反义抑制是特别优选的技术，但还可以使用所谓的内源基因原位诱变的嵌合质粒技术。对于本发明来说，该技术本身并不重要，不过，简单地讲，它包括将含有一个互补于所述内源基因上的所述目标序列的片段(通常其长度小于100个核苷酸)的混合的核糖-脱氧核糖核酸导入植物材料，其前提是在所述互补区域内存在一个“错配”，它可以通过DNA修复和复制酶出现在所述内源基因上，所述错配通常出现在所述基因的编码一种酶的活性位点的片段上，因此，这种酶的活性受到破坏或者至少被严重削弱。总而言之，一旦鉴定到变得沉默的内源基因，就可以使用任何基因抑制技术。另外，本领域技术人员还可以自由使用本领域现有的用于增强抑制目标基因的效力的技术。这样一种方法涉及使用反向重复序列，并披露于被收作本文参考文献的国际申请PCT公开文件WO98/53083中。
不过，本领域技术人员在实施本发明的方法时，优选用一种多核苷酸转化植物材料，这种多核苷酸包括互补于这样一个序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交。另外，所述植物材料可以用一种多核苷酸转化，这种多核苷酸包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交，但当所述温度为65-70℃时不能杂交。用于该方法的特别优选的多核苷酸包括序列2或序列8所示序列。
可以根据非转化对照植物和由此转化的植物之间的差别选择具有较多气孔的植物，对以上两种植物进行至少一种下列发芽后处理(i)较高的二氧化碳浓度；(ii)较高的钙；(iii)温度或压力极限；(iv)减少水的供应；(v)较高的环境污染气体，如臭氧、氮或硫的氧化物；(vi)较高的光照条件。所述差别可以选自下列一组(i)推迟了的开花；(ii)改变了的生长特征；和(iii)较高的气孔指数。另外，所述植物还可以根据对抗生素的抗性进行选择，所述抗性是由与能够增加气孔数的基因一起共同转入植物材料中的抗生素抗性赋予基因产生的。本领域技术人员理解术语“气孔”指数，它实际上是在叶片(举例而言)特定面积上的气孔数量，以占该面积上所含细胞总数的百分比形式表达。气孔指数可以定义如下SI＝气孔频率/表皮细胞频率+气孔频率×100。
本发明还包括植物-及其后代-它最终是由本发明的植物与对照非转化杂交亲合植物杂交产生的。所述植物或后代在所述转基因上可以是纯合的。
本发明还包括用上述方法得到的植物，所述植物的后代，所述植物和后代的种子，以及所述植物和后代的部分。特别优选的部分是果实、花和种子。
本发明还包括将本发明的多核苷酸或载体用于生产相对非转化对照植物而言具有较多气孔的植物的方法中。
通过结合相关的附图和序列表阅读下面的说明，可以更好地理解本发明。
序列1表示在种子中表达的被称为FAE-1的脂肪酸延伸酶基因的序列。序列1可以从“植物细胞”，7卷，1995的316页上查到。
序列2表示与序列1所示序列相关的，但又显然不是由该序列延伸而来的基因序列。
序列3和4表示用于提供载体pFL30和pFL44的PCR引物。
序列5和6表示GUS基因引物。
序列7表示与pfu聚合酶一起使用的引物。
序列8表示与序列2所示序列相关的，但又显然不是由该序列延伸而来的基因序列。
图1表示拟南芥属C24品系590的校正PCR DNA克隆，它被克隆在pGEMT载体(Promega)上。
图2表示载体pMOG553。
图3示意性表示克隆pFL44和pFL30之间的关系。
图4表示pFL13的示意图。
图5表示pMOO1017的克隆方案。
图6表示在对保卫细胞中的GUS活性进行组织化学染色之后的用结构pMOG1017转化过的拟南芥属的叶片。在该图中，“黑色斑点”表示天然状态下呈兰色的染色。
图7是图6所示叶片的放大示意图，更清楚地显示所述染色出现在气孔上，特别是在保卫细胞中。
实施例该实施例说明了参与控制气孔数量的基因的制备。所述基因最初是通过在拟南芥属生态型C24中进行启动子捕获筛选分离到的。捕获结构pMOG553是由连接于潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)上的β葡糖醛酸苷酶合成基因(GUS)的转录序列组成的，这两者均源于大肠杆菌。该结构通过内源捕获启动子的表达，使得能够通过GUS活性染色和抗生素选择标记对基因表达进行定位，以便分离突变体。根据所述GUS报导基因，鉴定了表现出保卫细胞特异性表达的一级突变体(M1)植株(它及它的后代随后在下文中被称为Tag590)，表示保卫细胞专一性基因已经被破坏。
制备Tag590植物Goddijon等(植物杂志4(5)，863-873，1993)披露了标记结构pMOG553(位于T-DNA上的无启动子的GUS)的生产。pMOG553示意性地表示在图2中。所述文献还披露了用该结构转化拟南芥，并提供了一种用于GUS分析的组织化学测定。对于GUS分析来说，将全叶片(包括子叶)或叶片的切片浸泡在测定培养基(0.1M磷酸缓冲液pH7，10mM EDTA，0.5mM铁氰化钾，0.5mM亚铁氰化钾，2.0mM X-Gluc(Gold生物技术)，0.1％Triton X-100)(Stomp1992)进行GUS活性分析。大的组织样品在微型离心管中分析，而小的幼苗或子叶被放在微量滴定板的孔中。在进行15分钟连续的真空过滤之后，在37℃下温育样品22小时。通过安装载玻片或者将样品浸泡在氯醛乙酰苯酚(CLP)(2∶1∶1水合氯醛、乳酸和苯酚晶体混合物(Sigma)，Beckman和Engler，1994)中进行组织澄清，以便除去叶绿素和氧化酚类化合物。结果以照片形式记录在Fujichrome Sensia200幻灯胶片上。
GUS基因的时间和空间表达在Tag590系中的GUS表达现象主要出现在气孔保卫细胞(或排水器)中，这表明一种保卫细胞专一性基因业已受到破坏。这种标记过的系提供了一种用于分离使得转基因只能在保卫细胞中表达的专一性启动子的机会。特别是，可以将保卫细胞用作活体模型，分析推测的信号传导基因产物在植物中的作用，并且能够操纵气孔细胞基因表达，以便工程改造气孔细胞行为。
根据在潮霉素上进行的选择一共鉴定了12个Tag 590 S2系(系5/1-5/12)。然后将系5用于证实上面提到的GUS表达结果。根据组织化学染色的强度，表达在两周龄植物的头两片真叶中的表达最强。GUS表达局限在气孔保卫细胞中。在较老的叶片中，GUS染色强度较弱，并且需要在底物中温育过夜以便检测。这一结果可能表明所述表达在幼小的发育中的植物的保卫细胞中最强，而所述基因在成熟植物中的表达较弱。另外，它还可以反应这样一个事实，在成熟植物中，GUS蛋白较不稳定或者保卫细胞更不容易接触所述底物。在较老叶片的排水器和微管组织中也观察到了染色。随后对所有12个系进行的实验证实系3、9和11具有最高的GUS表达水平。
在Tag590植物中分离破坏的基因从Tag590植物材料(花结叶片)中分离基因组DNA(gDNA)。通过用EcoRV、MscI进行限制性酶切分析，将GUS基因的5’部分用作探针，测定T-DNA插入片段的拷贝数。该限制性分析在合适的电泳时产生单一带。用以下GUS基因引物对Tag590的gDNA进行反向PCR(按照Barthels披露的方法进行，参见有关文献的2131页图7)。
引物75’-GTA.ATG.CTC.TAC.ACC.ACG.CCG-3’(序列5)。
引物55’-CTT.TCC.CAC.CAA.CGC.TGA.TC-3’(序列6)。
对于EcoRV片段来说，获得了一个大约1.8kb的带，在该片段上所述标记的大小为1.6kb。在MscI片段上获得了相同的结果。将该片段克隆在来自PROMEGA的pGEMT载体上，得到了被称为pFL13的质粒，参见图4。对该克隆进行部分测序，并分离一个1.4kb的Pst1片段，并用作探针(参见图4)筛选由Barthels等在1997年植物细胞，9卷，2119-2134页中披露的方法构建的野生型C24拟南芥属基因组DNA文库。在经过3轮集落纯化之后，分离了5个克隆，其中的两个相同，另外3个相同。将5.5kb的片段克隆到pUC28的BglII位点上(它是修饰过的pUC18载体，使其含有额外的BglII限制酶识别位点)，以便产生被称为pFL30的质粒。
将下列引物用于生产PCR片段，该片段是用pfu聚合酶(校正能力)由源于原始TAG590的基因组DNA制备的。然后将该片段克隆到pGEMT上，使得该结构标记为pFL44。
GUS95’-CAG.AAA.CTT.ACG.TAC.ACT.TTT.C-3’(序列7)590-5’5’-CAT.CTT.CTT.CTA.TGC.CTA.CTC-3’(序列3)尽管pFL44不含有任何可识别的启动子序列，但业已证实，在将其转入植物之后，它能产生专一性表达，这表明它包含某种组织专一性调控因子。
业已对所述PCR片段(pFL44)的两股链进行完全测序。似乎GUS标记业已插入一个基因中，它与早先通过转座子标记实验鉴定的被称为FAE I的拟南芥属基因十分相似，但又明显不同。序列2所示序列包含至少两个外显子，并具有推测的翻译起始位点和终止位点，但似乎编码一种明显短于FAE I的肽(在N-和C-末端分别缺少110和12个氨基酸)。因此，有可能存在不在该克隆片段上的其他编码区。业已将GUS标记插入第二个外显子的3’末端(距离推测的翻译终止密码子的3’180bp)，可能靠近转录序列的末端或者可能位于一个内含子内。在该距离上不大可能存在源于Fae样编码序列的另一个基因。
业已用相同的内部引物对所述基因组克隆(pFL30)的相应区域进行了测序。对该较长的克隆进行测序，以便达到以下目的(i)鉴定其他外显子，如果存在这样的外显子的话，(ii)鉴定有可能位于鉴定的编码序列上游的潜在基因启动子。FAE I被认为编码一种产生极长链脂肪酸所需的脂肪酸延伸酶。一种转座子标记的FAE I突变体不能在其种子中积累长于C18的脂肪酸(即200，201和221)。FAE I被认为编码一种种子专一性酮酰基合酶，它能催化与丙二酸单酰辅酶A的缩合反应。业已鉴定了FAE I上的具有大约50个氨基酸的一段蛋白，它与其他植物丙二酸单酰辅酶A缩合酶(例如CHS和STS)上的区有某些序列相似性。在DNA水平上与四种拟南芥属ESTS，T6700，T44939，T44368和ATTS1282具有某些相似性。上述同源性完全存在于序列2的序列上所给出的编码区内。这意味着包括FAE I在内存在至少四种其他序列，与拟南芥属基因组中的Tag590编码区有相似性。这六个基因有可能与种子专一性和Tag590保卫细胞专一性的FAE I具有不同的表达方式。以上结果表明，Tag590基因编码一种能在发育中的保卫细胞中专一性表达的推测的脂肪酸延伸酶。这种酶在根据改变了的二氧化碳浓度而决定气孔密度方面起作用(如下文所述)。
用FAE序列作为气孔保卫细胞启动子设计该实验是为了说明FAE序列能起到气孔保卫细胞专一性启动子的作用。用SnaBI消化质粒pFL44(位于GUS基因的5’末端)，得到1.8kb的片段。将该片段克隆到pFL7(它是具有无启动子GUS基因和35S终止子的多拷贝结构)的SnaBI/SmaI位点上，取代GUS的5’末端，产生被标记为“新的多拷贝结构”的结构。将具有下列因子的源于上述“新的多拷贝结构”的EcoRI/BamHI片段克隆到pMOG800上Tag590“启动子”；GUS基因和35S终止子。将最终的结构pMOG1017用于拟南芥属C24转化，随后产生了40个转基因品系，对其叶片进行组织化学测定，测定GUS表达。参见照片1或2，有14个系清楚地表明仅在气孔中具有GUS基因的专一性表达。其余的26个系没有表现出明确的表达，并被视为低表达子或非表达子。
植物和生长条件通过自交得到单一M1植株的12个保卫细胞专一性GUS表达M2系。将所述M2系用于所有鉴定分析。在播种之前，在滤纸上对种子进行表面消毒(用10％v/v漂白剂洗涤1次(5分钟)，然后用无菌蒸馏水洗涤(5×1ml))。将所述种子放在添加了1％w/v蔗糖和0.6％w/v组织培养级琼脂的0.5×MS基础培养基(pH5.8(KOH))上发芽。制备标准10厘米的培养平板，或者不添加抗生素用于野生型种子发芽或者添加10毫克/升潮霉素B(Calbiochem)用于选择突变型幼苗。对播种过的平板进行48小时的春化作用(0-4℃)，然后转移到生长条件下，并保持整个生长周期(白天22℃，夜间17℃；10/14小时的昼/夜方案；R/H大于60％；400w Osram金属卤化物250-300微摩尔/米2/秒)，在选择之后将植株转移到土壤中(3∶1混合的SHL通用组合物(William Sinclair园艺有限公司)细‘银’沙)。
形态学鉴定使用受控制的环境箱在环境(350-450ppm)和较高的(环境+650ppm)二氧化碳浓度下生长植物。在上述条件下记录花和叶的出现，植物发育以及开花时间。将野生型C24用作未转化过的对照，并将35S组成型GUS表达子用作GUS阳性对照。在开始光照(dal)第16或35天将植物转移到所述箱中。在16日龄的组中，在结束实验之前让植物生长到35天，而较老的植株生长到结实。记录单个植株的始花时间，一直到67天。在收获之后对所有植株进行拍照。用Xantopren齿模材料(Dental Links Products)对每个植株的2-3个叶片的远轴表皮进行模压(Weyers和Johansen1985)，叶片的选择根据比较大小而不是叶片数量。将光学上透明的丙酮基光亮剂用于从Xantopren压模上取型。在200倍的光学显微镜下从每一个阳性植株上的3个不同部位计数每单位面积上的气孔和表皮细胞数(9.2-2毫米2)。将上述数据用于计算每一个系在环境和较高二氧化碳下的平均气孔指数(SI)值(SI＝气孔频率/表皮细胞频率+气孔频率×100)。以上结果表明，在环境二氧化碳条件下，在C24和Tag590植株之间的气孔频率或气孔指数没有差别。与C24植物在较高二氧化碳条件下气孔指数降低明显不同的是，Tag590植物表现出增加了的气孔指数。在35和67dal植物中均观察到这一结果。
对所有品系进行GUS表达的组织化学测定，以便证实突变TAG590的存在与否。用C24和35S/GUS(组成型GUS表达)植物作为对照。
Tag590系的表型根据GUS表达数据，一种保卫细胞专一性基因业已被破坏。已知保卫细胞对较高的二氧化碳有两种不同的反应。其中的一种反应是温室作物的商业种植者所熟知的气孔变小，它阻止了将在较高二氧化碳下生长的好处转化成产量。另一种反应是在某些物种中证实的发育反应，表现为生长在较高二氧化碳下的植物的气孔数量较少。下面所述的结果来自实验，其中在较高的二氧化碳和环境二氧化碳下比较了Tag590植株和C24对照的表型。
实验1在该实验中使用三个品系(i)C24对照(见上文)(四个植株/处理)；(ii)品系5/10(七个植株/处理；这是一种GUS基因表达很低的品系)；(iii)品系5/5(二个植株/处理的该GUS表达系)。当所述植物被转移到温室中时为4周龄，并在环境或高于环境的250ppm二氧化碳下保持17天。在该实验结束时测定气孔数。
实验1的结是最突出的结果是，在Tag590 5/5品系上的开花时间的改变。与C24或5/10品系对照相比，5/5品系的开花时间明显推迟。在统计气孔数量时(表1)发现，对于C24或5/10植物来说在环境和较高二氧化碳条件下没有差别。不过，形成鲜明对比的是，在GUS强表达系(5/5)中的气孔数量增加。
表1.在环境和较高二氧化碳条件下生长对气孔数量的影响
实验2该实验的目的是用更仔细控制的生长条件更精确地研究TAG590表型。在该实验中使用两个匹配的环境控制的生长室，其中，在整个实验中用计算机控制并记录二氧化碳的浓度。在第一个培养箱中，实验过程中维持环境水平的CO2。在第二个培养箱中，CO2水平维持在高于环境水平的650ppm。这是在实验1中使用的较高浓度，但选择该浓度是因为它更准确地反应了商业种植者使用的CO2方案。
实验2结果将种子在培养室中萌发，盆栽，并在45天时转移到培养箱中。在生长22天，实验结束是记录开花时间和气孔数。重要的是注意到仅对实验处理条件下生长的页记录了气孔数。在该实验中再一次观察到标记过的植物在较高的二氧化碳下开花的推迟。在较高的和环境处理中所有的标记品系的开花期都比对照晚(推迟大约7天)，气孔数量测定结果归纳在表2中，其中，生长在较高二氧化碳下的对照植物上的气孔数量明显减少，但在标记过的品系上气孔数增加，由此证实了前面的实验，它表明气孔数量会因为较高的二氧化碳而增加。
表2.在较高的和环境二氧化碳下生长对气孔数量的影响
以上结果表明，标记过的突变品系不能对改变了的二氧化碳浓度作出正常反应。它们在高的二氧化碳浓度下不表现出气孔密度的减少，而表现出气孔密度的增加。因此，似乎参与针对二氧化碳形成气孔的基因业已被破坏。业已鉴定了推测的受到破坏的基因序列，并且在序列2中示出。该基因的启动子区具有很大价值，因为据推测它包括(i)指导保卫细胞专一性基因表达的因子；和(ii)二氧化碳效应因子。业已鉴定了突变型590表型和突变的基因。我们的结果使我们有理由相信该基因和/或其产物是(i)参与气孔密度的控制；(ii)对二氧化碳有反应；和(iii)所述基因产物是参与长链脂肪酸合成的脂肪酸延伸酶(FAE)或与脂肪酸延伸酶相关。总而言之，以上结果表明一种长链脂肪酸或其代谢物在控制气孔形成方面起着重要作用，并且该基因的非编码区包括保卫细胞专一性和二氧化碳诱导型启动子。除了对商业植物的兴趣之外，生物技术学家希望工程改造气孔行为，所述基因及其启动子在温室作物中可能具有价值。在这种情况下，为了增加二氧化碳的获取(因此提高产量)，商业种植者通常在高的二氧化碳浓度下栽培作物。不过，已经认识到潜在的优点被较高的二氧化碳诱导的气孔传导能力的降低所减弱。气孔细胞数量的增加至少在一定程度上弥补了上述作用。在标记过的突变型品系上观察到的开花的推迟，可能由于基因破坏的次级效应而产生。就是说，在所述植物上改变了的气孔密度导致了碳同化率的改变，这反过来又影响花分生组织的形成。
本领域技术人员可以理解，本发明并非局限于以上说明，很多变化都包括在其范围内，希望得到保护的方案由权利要求书限定。例如，尽管以上实施例中披露启动序列2所示序列表达的气孔细胞专一性启动子源于拟南芥属，但印迹实验业已证实，该启动子序列存在于除拟南芥属之外的其他植物中。所述植物包括，例如，马铃薯、番茄、和胡萝卜。另外，尽管没有具体说明，将序列1和/或2所示的序列转入植物材料以便破坏具有类似序列的内源基因的活性可以得到由所述转化材料再生的植物，该植物与类似的非转化对照植物相比在较高的二氧化碳浓度下具有较多气孔。除此之外，没有理由怀疑序列8所示序列在对气孔专一性启动子活性方面与序列2具有相同的作用。
参考文献(除上文具体提到过的文献以外的文献)Beckman，A.A.和Engler，A.A.(1994)一种澄清组织化学染色的植物组织的简便技术。植物分子生物学报导，12(1)，37-42。
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tgcagcgccg 2040gcgcaatttc cctcgacctc gccacaaatc tac 207权利要求
1.一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制植物材料中能促进14-3-3型转录因子合成的脂肪酸的产生，或者抑制所述脂肪酸促进所述因子的合成；(ii)选择上述受到抑制的材料；和(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
2.一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制含有序列1或序列2所示多核苷酸序列的内源基因的功能或破坏其活性；(ii)选择上述受到抑制的材料；(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
3.如权利要求2的方法，其中，所述内源基因包括互补于这样一种序列的多核苷酸序列，该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2所示序列杂交。
4.一种生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)用含有序列1或序列2所示序列的多核苷酸转化植物材料；(ii)选择所转化的材料；(iii)由所选择的材料再生成植株，并从再生群体中选择相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物。
5.如权利要求4的方法，其中，所述多核苷酸包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2所示序列杂交。
6.如权利要求4或权利要求5的方法，其中，所述多核苷酸呈反义取向。
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其中，可以根据非转化对照植物和由此转化的植物之间的差别选择具有较多气孔的植物，以上两种植物均进行至少下列一种发芽后处理(i)较高的二氧化碳浓度；(ii)较高的钙；(iii)温度或压力极限；(iv)减少水的供应；(v)较高的环境污染气体，如臭氧、氮或硫的氧化物，和(vi)较高的光照条件。
8.如权利要求7的方法，其中，所述二氧化碳浓度大于大约450ppm。
9.如权利要求8的方法，其中，所述二氧化碳浓度大于大约650ppm。
10.由如权利要求1-9中任一项所述材料再生的形态正常的可育全植株及其种子和后代，所述植株及后代相对类似的对照植物和后代而言具有较多气孔。
11.如权利要求10的形态正常的可育全植株，选自下列一组大豆、棉花、烟草、甜菜、油用油菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草坪草、牧草、甘蔗、豌豆、蚕豆、稻、松、杨树、苹果、葡萄、藤本植物、黄瓜、辣椒、柑橘和坚果类植物。
12.将包括序列1或序列2所示序列的多核苷酸用于生长相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法中的用途。
13.如权利要求12的用途，其中，所述多核苷酸包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1或序列2所示序列杂交。
14.如权利要求12或13的用途，其中，所述多核苷酸的表达受植物可操纵的启动子的控制，并且还包括一个位于所述多核苷酸的蛋白编码区下游的转录终止区。
15.如权利要求12-14中任一项的用途，其中，所述启动子选自下列一组CaMV35S；FMV35S；NOS；OCS和E9。
16.如权利要求14的用途，其中，所述启动子是气孔保卫细胞专一性的。
17.如权利要求16的用途，其中，所述启动子包括序列2所示序列的启动子活性区。
18.将权利要求12-17中任一项的多核苷酸用于生产相对类似的对照植物而言具有较多气孔的植物的方法中的用途，其中，所述方法是权利要求1-9中任一项所述方法。
19.一种多核苷酸，所述多核苷酸包括互补于这样一种序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交，但当所述温度为65-70℃时不能杂交。
20.如权利要求19的多核苷酸，包括序列2所示序列。
21.如权利要求19或20的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括的蛋白编码区的旁侧是植物可操纵的启动子和终止子。
22.一种植物转化载体，包括权利要求19-21中任一项的多核苷酸。
23.一种包括从5’到3’方向的序列的植物转化载体，该序列包括权利要求19-21中任一项所述的多核苷酸的互补物。
24.如权利要求22或23中任一项的植物转化载体，其中，所述多核苷酸的蛋白编码区的表达受气孔保卫细胞专一性启动子的控制。
25.如权利要求19-21中任一项的多核苷酸编码的翻译产物。
26.如权利要求25的产物，具有脂肪酸延伸酶的活性。
27.用权利要求19-21中任一项的多核苷酸、如权利要求22-24中任一项的载体、或包括这样一种序列的多核苷酸转化过的植物材料所述序列互补于这样一种序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交。
28.如权利要求27的植物材料，它还用一种多核苷酸转化过，该多核苷酸包括一个编码能赋予植物材料对除草剂、昆虫、脱水和/或真菌、细菌或病毒感染的抗性或耐受性的蛋白的区域。
29.如权利要求28的植物材料，其中，所述能够赋予除草剂抗性的蛋白选自下列一组草甘膦氧化还原酶(GOX)，5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)，膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，谷胱苷肽S转移酶(GST)，细胞色素P450，乙酰-COA羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合成酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PROTOX)，dihydropteroate合成酶，多胺转运蛋白，超氧化物歧化酶(SOD)，bromoxynil腈化酶，八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)，获自真养产碱菌的tfdA基因产物，以及所述蛋白的已知诱变或其他改进的变体。
30.如权利要求27-29中任一项的植物材料，其中，所述蛋白编码序列包括5’区，它编码(i)能够将该区的翻译产物定向转运到诸如叶绿体、线粒体的质体，其他细胞器或植物细胞壁的肽和/或(ii)非翻译翻译增强序列。
31.如权利要求27-30中任一项的植物材料，其中，用于转化所述材料的多核苷酸作过修饰，即去掉mRNA不稳定性编码基序和/或偶然剪接区，或者可以使用植物优选的密码子，以便所述修饰过的多核苷酸在植物中的表达能产生与通过在生物中表达未修饰过的核苷酸所获得的蛋白具有基本上相同的活性/功能的基本上相同的蛋白，其中，所述未修饰过的多核苷酸的蛋白编码区是内源的，其前提是，如果-就除草剂抗性赋予区而言-由此修饰过的多核苷酸包括植物优选的密码子的话，在所述修饰过的多核苷酸上的蛋白编码区和所述植物中所含有的编码大体上相同的蛋白的类似的蛋白编码区之间的相同性低于大约70％。
32.一种由权利要求27-31中任一项的材料再生的形态正常的可育全植株，所述植株的后代，所述植株和后代的种子以及所述植株和后代的部分。
33.如权利要求32的植物，选自下列一组大豆、棉花、烟草、甜菜、油用油菜、canola、亚麻、向日葵、马铃薯、番茄、苜蓿、莴苣、玉米、小麦、高粱、黑麦、香蕉、大麦、燕麦、草坪草、牧草、甘蔗、豌豆、蚕豆、稻、松、杨树、苹果、葡萄、藤本植物、黄瓜、辣椒、柑橘和坚果类植物。
34.一种生产相对对照植物而言具有较多气孔的植物的方法，包括以下步骤(i)抑制一种内源基因的功能或以其他方式破坏其活性，该基因包括互补于这样一个序列的序列该序列在60-65℃的温度下在含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育，然后在相同温度下用含有0.1％SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后仍然能够与序列1所示序列杂交；(ii)选择上述受到抑制的材料；(iii)将所选择的材料再生成植株。
35.如权利要求34的方法，其中，所述植物材料是用 19-21中任一项的多核苷酸或权利要求22-24中任一项的载体转化过的。
36.如权利要求34或35的方法，其中，可以根据非转化对照植物和由此转化的植物之间的差别选择具有较多气孔的植物，以上两种植物均进行至少下列一种发芽后处理(i)较高的二氧化碳浓度；(ii)较高的钙；(iii)温度或压力极限；(iv)减少水的供应；(v)较高的环境污染气体，如臭氧、氮或硫的氧化物，和(vi)较高的光照条件。
37.如权利要求36的方法，其中，所述差别选自下列一组(i)推迟了的开花；(ii)改变了的生长特征；和(iii)较高的气孔指数。
38.如权利要求34-37中任一项的方法，包括让由此选择的植物或其后代与非转化的类似植物杂交的其他步骤。
39.如权利要求38的方法，其中，所述由杂交最终得到的植物在所述转基因上是纯合的。
40.由权利要求34-39中任一项的方法得到的植物，所述植物的后代，所述植物和后代的种子，所述植物和后代的部分。
41.如权利要求40的植物的部分，选自下列一组果实、切花和种子。
42.将权利要求19-21中任一项的多核苷酸或权利要求22-24中任一项的载体用于生产相对非转化对照植物而言具有较多气孔的植物的方法中的用途。
43.由序列2所示序列包含的表达调控序列。
44.一种分离的多核苷酸，含有序列2所示序列。
45.一种分离的多核苷酸，含有序列8所示序列。
46.由序列8所示序列包含的表达调控序列。
全文摘要
一种生产相对对照植物而言具有较多气孔的植物的方法,包括以下步骤:(i)抑制植物材料中能促进14－3－3型转录因子合成的脂肪酸的产生,或者抑制所述脂肪酸促进所述因子的合成;(ii)选择上述受到抑制的材料;(iii)将所选择的材料再生成植株。所述抑制作用可以通过一种内源基因的有义共抑制或反义抑制而实现。所述基因包括互补于这样一种序列的序列:该序列在60－65℃的温度下在含有0.1%SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液中温育,然后在相同温度下用含有0.1%SDS的0.3×柠檬酸缓冲的盐溶液洗涤之后,仍然能够与序列1所示序列杂交。用于该方法的优选序列如序列1和2所示。
文档编号C12N9/10GK1376198SQ9980763
公开日2002年10月23日 申请日期1999年4月19日 优先权日1998年4月20日
发明者F·M·范德李, P·C·西蒙斯, A·M·赫特林顿, G·H·霍尔洛伊德, J·E·格雷 申请人:曾尼卡有限公司