专利名称:由重组体棒状病毒感染的昆虫细胞中的人类免疫缺陷病毒的壳膜基因得到的多肽的制作方法
获得性免疫缺陷综合症(爱滋病)是一种有全球重要性的病毒性疾病。这种疾病的病原因子是称为人类免疫缺陷病毒(HIV)的棒状病毒，也有人称之为淋巴结病病毒(LAV)(Barre-Sinoussi等，1983年)、人类T细胞白血病Ⅲ型病毒(HTLV-Ⅲ)(Popovic等，1984)或爱滋病相关病毒(ARV)(Levy等，1984)。根据分子克隆的完全核苷酸序列以及病毒蛋白的直接序列的分析，已阐明了几种爱滋病病毒的结构和基因组织。
在发展爱滋病疫苗和诊断技术中，壳膜蛋白是最有希望的候选物(Francis等，1985)。在爱滋病病人血清中通常检测到抗壳膜糖蛋白抗体(Robey等，1985)。此外，壳膜糖蛋白代表了爱滋病病毒的主要靶抗原(Barin等，1985)。
爱滋病有效的疫苗的生产取决于大量制造安全抗原的能力。这种安全抗原在注入人体时即可刺激机体的保护性免疫力，因为已发现DNA重组技术可以大量制造安全而经济的免疫原，故其代表了抗原生产的最佳选择。选择使用哪一种重组系统(细菌、酵母或其它真核细胞)将考虑以下方面可通过糖基化作用和裂解对HIV的壳膜糖蛋白进行特异性加工处理。该重组系统应能以预期的方式加工基因产物。
细菌和酵母细胞不能有效地糖基化它们的表达蛋白质。
虽然哺乳动物细胞似乎是适宜的表达载体，但它们却有包含许多不需要的免疫反应性抗原的缺点，而且还存在着掩匿外来因子的危险。
棒状病毒表达系统提供了生产有效的HIV壳膜免疫原的一个有吸引力和可行的机会。
棒状病毒可被用作在培养的昆虫细胞中生产重组蛋白的高效真核克隆和表达载体。
棒状病毒不止具有用作真核克隆和表达载体所必须的各种条件，它们由于狭窄的宿主范围-只限于节肢动物，所以很安全;它们能够容纳大量的外源DNA;它们的细胞培养物系统是安全的、非转化的和有效的;它们具有高度有效的多角体启动子(polyhedrin promoter)，它比病毒感染的真核细胞中任何其他已知启动子有更大的活性。
棒状病毒系统在生产用于诊断程序的多肽方面也有很大优越性。许多人体和动物一般都具有对细菌、酵母及外源组织相容性抗原起作用的抗体，由于这些抗体与各个表达系统中产生的制剂内的污染细胞、酵母和哺乳动物细胞蛋白质产生假阳性反应，所以它们的存在会降低诊断方法的可靠性。然而，人类和动物不大可能有与鳞翅动物细胞或棒状病毒抗原产生免疫接触的既往史。因此，在这种系统内生产重组蛋白质，使用鳞翅目动物细胞和棒状病毒很可能没有可被正常存在于人或动物体内的抗体识别的污染抗原问题。所以说，在诊断方法中使用由该系统生产的重组抗原时，不会因鳞翅目动物细胞源或棒状病毒源的污染物导致假阳性反应。
本发明的一个实施方案中使用了棒状病毒Autographa californica核多角体病毒(AcMNPV)。用于表达的启动子序列为得自该病毒的多角体(OCC)基因的启动子序列。AcMNPV和重组体病毒材料在Spodoptera frugiperda(草地贪夜蛾)细胞中维持。所构建的重组体应将Pn基因删除，这样就使得重组体病毒为OCC-。从而便能根据噬菌斑形态来容易地鉴定重组体病毒，一经分离了重组体棒状病毒，即可用于感染任何一个作为培养细胞系或一个完整昆虫的一部分而保留的受纳或半受纳细胞群体。
插入载体的构建外来蛋白质编码序列在棒状病毒载体中的克隆和表达，要求该编码序列与多角体启动子和上游序列连成一线，而且在另一侧与截短了的多角体编码序列连成一线，结果使得与棒状病毒基因组的同系重组导致与多角体启动子和失活的多角体基因连成一线的外来编码序列的转移。
因此，设计了各种用于爱滋病env基因构建的插入载体。下述的每种插入载体用来提供ATG转译起始密码子，外来序列向这些载体内的插入必须设计成能维持由起始密码子确定的转译读码正确地通过外来序列。
以下的参考附图对本发明的实施进行了详细描述。
图1为LAV-1a分离物之全长壳膜基因的核苷酸序列，同时给出了推定的氨基酸序列。序列资料得自于GENBANK。核苷酸的编号是由假定的ATG起始密码子的第一个核苷酸开始的。氨基酸是从ATG起始密码子编号的。图中显示了相应于信号肽细胞外糖蛋白(gp120)及跨膜糖蛋白(gp41)的区域，连同提出的肽裂解位点及天冬酰胺联系的糖基化位点。在核苷酸序列的下面列出了适当的限制性酶切点。
图2(包括图2A和2B)图解说明了重组质粒p1614和p1774的结构。质粒p1774包含LAV env基因完整的编码序列。该质粒是经下列两个步骤构建的(a)自p1614中分离LAV env基因的2686bp Kpn Ⅰ片段并克隆到pUC18的Kpn Ⅰ位点，从而使pUC18的SmaⅠ位点处于env基因序列的上游;(b)使121bp合成寡聚体成钝头连接到SmaⅠ位点。箭头指示编码序列的极性。显示了相关的限制性核酸内切酶切点。为本发明所使用的合成寡核苷酸序列是在Pharmacia基因装配仪(Gene Assembler)上，用多角体基因之优选密码子，并根据LAV的该区域推定的氨基酸序列来构建的。
图3(包括图3A、3B和3C)图解显示了插入载体的结构。与相关限制性核酸内切酶位点及核苷酸序列一起显示了插入载体MGS-3、MGS-3+2、MG-4及MGS-5。其启动子序列的极性为从左到右。
图4图解显示使用Chow和Fastman的程序(Biochemistry13，222;1974)由计算机分析得到的前体gp160的推测的二级结构和亲水性模型。
图5图解显示构建重组载体的路线。对所示的质粒作了描述或指定了相当于表1和2中所述构建物的一个字母(如A)。
插入载体MGS-1是由一噬菌斑纯化的AcMNPV分离物分离的DNA之EcoRI-I限制性片段克隆构建的。
插入载体MGS-1包括下列结构特征(见图3)多角体基因之ATG起始密码子上游的4000bp序列;一个通过位点引导的突变引入的多聚连接子(其包括一个ATG起始密码子)及Sma I和Kpn I限制性酶切点;从Kpn I限制性酶切点(其为多角体基因内部的)延伸到EcoRI-I克隆之末端EcoRI限制性酶切点的1700bp序列。
插入载体MGS-3与MGS-1大致相同，不同的只是多聚连接子包含SmaⅠ、KpnⅠ、Bg1Ⅱ限制性酶切点及一个通用的终止密码子片段。
插入载体MGS-3+2与MGS-3基本相同，只是它在MGS-3的位置+3上多两个胞嘧啶核苷残基，且在MGS-3的位置+4上少一个鸟嘌吟核苷残基。最终结果是因相对于MGS-3多一个核苷酸而产生密码子构架的位移。
插入载体MGS-4含有与MGS-3大致相同的结构，不同的是，它是用一合成的多聚连接子构建的，其包含多角体基因的编码N末端部分最初10个氨基酸的序列，之后有SmaⅠ、KpnⅠ、Bg1Ⅱ的限制性酶切点及一个通用的终止密码子片段。该载体是基于这样的研究构建的即如果多角体基因之N末端的前14个氨基酸密码子与外来基因的N末端相融合，便可以得到高水平表达(Smith等，1983)。
插入载体MGS-5含有与MGS-3大致相同的结构，不同的是用一合成的多聚连接子构建的，该连接子包含编码IL-2之可裂解信号肽的序列，后面接有EcoRI、KpnⅠ、Bg1Ⅱ的限制性酶切点及一个通用的终止密码子片段。该载体被用于提供带有肽信息序列的内部HIV env序列，已表明该序列在昆虫细胞内被有效地识别和除去(Smith等，1985)。
携带LAV编码序列之棒状病毒重组体的构建用命名为NA-2的重组质粒，该质粒含有已插入到pUC18的完整爱滋病前病毒的21.8Kb片段。据报导这一克隆是感染性的，因为它能在转染某些人类细胞后产生病毒。由HIV的LAV病毒株(Barre-Sinoussi等，1983)得到包含于NA-2中的完整的壳膜基因序列。
LAV的壳膜基因含有一个为以甲硫氨酸(met)密码子开始的861个氨基酸编码的开放读码(Wain-Hobson等，1985)，HTLV-ⅢBHIO病毒株含有856个密码子(Starich等，1986)。
信号肽序列由30个氨基酸组成(其中两个不同于BHIO);细胞外蛋白由486个氨基酸组成(其中14个不同于BHIO);跨膜区域由345个氨基酸组成(其中5个不同于BHIO)。图1显示了用于这些研究的LAV env基因的核苷酸及推测的氨基酸序列。氨基酸残基序号是由假定的甲硫氨酸起始密码子开始的。文中所指的氨基酸残基与图1中所示的序号相符。
除了决定完整的gp160多肽外，还决定表达HIV-enu基因的各个不同区域。这一决定是基于包括蛋白质结构及已报导的爱滋病还原病毒(retrovirus)分离物的异质性在内的几个因素作出的(Bem等，1985;Hahn等，1985)。使用了推断蛋白质二级结构连同给出亲水性数值的计算机程序(Chow和Fastman，1984)。图4中显示的分析结果揭示了含有β转角(Beta turns)的几个亲水区域。已表明这些区域与抗原决定部位及结构定位有关(Westhoff等，1984)。基于这些结果以及存在有方便的限制性切点，故决定表达图4中所指出的C末端截短了的各种壳膜蛋白。这些构建的优点在于可得到从C末端疏水区域起渐进的缺失。此外，还决定表达gp41编码序列所跨越的区域。至少有两个免疫优势抗原决定部位包括在要被表达的区域内。对于这些构建物，设计了包含IL-2之可裂解信号的载体。最近证明，当在感染的细胞内表达来自重组体棒状病毒基因组的IL-2基因时，IL-2信号肽导致了与IL-2基因有关的正确的细胞加工(Smith等，1985)。
图5中显示了为表达HIV-env序列而设计的克隆策略。
壳膜基因最初是作为3846bp EcoRI/SacI限制性片段自NA-2中被分离，并克隆到pUC19的EcoRI/SacI限制性位点。所得质粒被定名为p708。然后再分离作为2800bp KpnI限制性片段的壳膜基因并克隆到pUC18的KpnI限制性位点内，所得克隆被定名为p1614(见图2A)该KpnI限制性片段包括了壳膜基因被稍微截短的片段。结果缺失了相应序列N末端的121bp。通过插入双股的合成寡聚体(该寡聚体是利用优选的多角体基因密码子惯用法由LAV氨基酸序列设计的)取代基因中包括信号肽序列的这一缺失部分。为了利于进一步操作，随之引入一新的SmaI限制性序列，以代替ATG起始密码子。ATG起始密码子将由插入载体提供。所得质粒定名为p1774(见图2B)。
把从含爱滋病病毒壳膜蛋白不同区域的密码子序列之p1774质粒得到的限制性片段克隆到MGS载体中，从而使插入载体的ATG起始密码子进入壳膜基因密码子的读码内，制得下列构建物(见图5)。
A.将全长度gp160作为SmaI/部分KpnI酶切片段克隆到MGS-3中(在其SmaI位点)。该克隆含有gp160的所有编码序列，并使用它们可靠的翻译终止密码子。
A1.将全长度gp160作为Sma Ⅰ/部分Kpn Ⅰ酶切片段克隆到MGS-4中(在Sma Ⅰ/Kpn Ⅰ位点)。该克隆含有gp160的所有编码序列。并使用其用靠的翻译终止密码子。
B.将截短了的gp160作为Sma Ⅰ/BamHI限制性片段克隆到MGS-3的Sma Ⅰ/Bg1 Ⅱ限制性位点中。该克隆含有编码gp160的氨基酸1到757的序列，并使用由MGS-3载体提供的终止密码子。
B1.将截短了的gp160作为Sma Ⅰ/BamHI限制性片段克隆到MGS-4的Sma Ⅰ/Bg1 Ⅱ限制性位点内。该克隆含有为gp160之氨基酸1到757编码的序列，并使用由MGS-4载体提供的终止密码子。
C.将截短了的gp160作为Sma Ⅰ/填充了Hind Ⅱ切点的限制性片段，克隆到MGS-3的Sma Ⅰ位点，该克隆含有为gp160之氨基酸1至645编码的序列，并使用由MGS-3载体提供的终止密码子。
D.克隆了作为Sma Ⅰ/部分Bg1 Ⅱ限制性片段的全长度gp120，其中已向该片段的Bg1 Ⅱ位点加入了一合成的DNA连接子，以填充自该Bg1 Ⅱ位点(在氨基酸472密码子处)至gp120之最后C末端密码子的序列。该克隆含有自氨基酸1至516的序列，代表了完整的gp120编码序列。翻译终止密码子(在TAA密码子处)是由MGS-3载体提供的。
E.将截短了的gp120作为Sma Ⅰ/部分Bg1 Ⅱ限制性片段克隆到MGS-3的Sma Ⅰ/Bg1 Ⅱ限制性位点。
F.将截短了的gp120作为Sma Ⅰ/Bg1 Ⅱ限制性片段克隆到MGS-3的Sma/Bg1 Ⅱ位点。该克隆含有从氨基酸1至279编码的序列，并使用由MGS-3载体提供的终止密码子。
G.将截短了的gp120作Sma Ⅰ/Dra Ⅰ限制性片段克隆到MGS-3的Sma Ⅰ位点，该克隆包含从氨基酸1到129编码序列，并使用由MGS-3载体提供的终止密码子。
H.将编码HBsAg的序列作为BamHI片段引入到上述Sma Ⅰ/Dra Ⅰ构建物内，连接到位于载体之下游的Bg1 Ⅱ位点上。该克隆含有编码gp120之前129个N末端氨基酸的序列，之后是编码HBsAg的读码内序列。
I.将gp41作为一Bg1Ⅱ限制性片段克隆到MGS-3的Bg1Ⅱ位点。该克隆含有gp160之氨基酸472至C末端氨基酸的序列。
J.自P3156分离作为Sma Ⅰ/Kpn Ⅰ片段克隆的gp41，并于修剪的EroRI位点和Kpn位点克隆到MGS-5载体中，该克隆含有与编码gp160之氨基酸473至C末端的序列融合的编码IL-2之信号肽的序列。
K.将截短了的gp41作为Bg1 Ⅱ/BamHI片段克隆到MGS-3的Bg1 Ⅱ位点中。该克隆含有编码gp160之氨基酸472至757的序列，并使用由MGS-3载体提供的终止密码子。
L.自p3166分离作为Kpn Ⅰ/BamHI片段克隆的截短了的gp41，将它克隆到PMGS-5的Kpn Ⅰ/BamHI位点中。该克隆含有与编码gp160之氨基酸472至757的序列融合序列IL-2之信号肽的序列。
重组体棒状病毒的制备和分离将HIV env基因重组质粒与AcMNPV经磷酸钙沉淀，并加到未经感染的Spodoptera frugiperda细胞中。然后通过同种重组方法将嵌合基因插入AcMNPV中。根据OCC-噬斑形态鉴定重组体病毒。这样的噬斑表现出可鉴别的细胞病理效应，但没有核闭塞(nuclear occulusions)作用。进行另外两次接续的噬斑纯化过程以得到重组体病毒。将重组体病毒DNA的限制性酶切特性及杂交特征与野生型病毒DNA相比较，分析HIV env序列的位点特异性插入。
在感染的昆虫细胞内表达由重组体棒状病毒得到的HIV env序列得自重组体病毒的HIV-env序列在昆虫细胞内的表达，导致初级翻译产物的合成，产物为前蛋白原(pre-pro-protein)形式，其含有从多角体启动子下游之表达载体的ATG起动密码子起编码的所有氨基酸。该初级产物，包含由重组载体提供的密码子翻译得到的氨基酸。例如，构建物A的初级翻译产物在N末端应读出Met-pro-Gly-Arg-Val·Met-pvo-Gly密码子是作为克隆策略的结果得以提供的。
裂解env前体糖蛋白的两个潜在的加工位点首先除去N末端处信号肽的30个氨基酸残基，继之产生一个含345个氨基酸的大的跨膜蛋白，以及一个含486个氨基酸的细胞外蛋白。一般认为信号肽的识别和裂解是进行有效的细胞加工所必需的。
为了确定由重组体棒状病毒得到的HIV-env基因序列的表达，在感染后期于35S-甲硫氨酸、35S-胱氨酸或3H-甘露糖存在下，用各种重组体病毒感染昆虫细胞的培养物。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)和放射自显影显示这些标记的细胞提取物。
使用三种类型的血清来估计在用HIV重组体棒状病毒感染昆虫细胞中产生的重组体蛋白的可靠性。
1.以疾病控制中心(CDC，Atlanta，Goergia)提供的HIV阳性的人血清作为HIV阳性的参考标准。
2.以CDC提供的HIV阴性的人血清作为一个HIV阴性的参考标准。
3.在羊体内产生的抗gp120壳膜蛋白(其为由纯化的感染性HILV-Ⅲ病毒制备并用凝胶纯化的多克隆抗体)。
结果被总结在表1和2上。
表1分离物序号 种类 血清HIV HIV gp120对照组 阴性 阳性 阳性未感染的Sf′细胞 - - -感染的Sf细胞 - - -重组体A.2863 完整的gp160 1-861 - + +A1.3715 nd2nd ndB.3046 截短的gp160 1-757 - + +B1.3540 nd nd ndC.3774 截短的gp160 1-645 nd nd ndD.4646 gp120，1-516 nd nd ndE.2040 截短的gp120 1-472 - + +F.2165 截短的gp120 1-279 - - +/-G.2196 截短的gp120 1-129 - - -H.3076 与HBsAg融合的氨基酸1-129 nd nd ndI.3156 gp41，472-861 - + +J.4585 IL-2信号/gp41 nd nd ndK.3166 截短的gp41 - + +472-757L. IL-2信号/截短的 - - -gp41注1.Sf＝Spodoptera frugiperda 2.nd＝未检测。
表2对分离物、推测的和观察到结果的总结构建/分离物序号壳膜氨基酸1推测的分子量大小2未糖基化的 糖基化的 实验观察的分子量大小A.2863 完整的gp160 93，200 160，000 160，0001-861 56，000 120，000 120，00037，000 41，000 41，000A1.3715 同A 同A 同AB.3046 截短的gp160 82，000 150，000 150，0001-757 56，000 120，000 120，00026，000 30，000 30，000B1.3540 同B 同B 同BC.3774 截短的gp160 69，000 130，0001-645 56，000 120，00014，000 18，000D.4646 gp120，1-516 56，000 120，000 未检测E.2040 截短的gp120 51，000 110，000 110，0001-472 90，000F.2165 截短的gp120 30，000 60，000 60，0001-279G.2196 截短的gp120 12，000 15，000 15，0001-129
H.3076 与HBsAg融合的 35，000 40，000氨基酸1-129I.3156 gp41，472-861 42，000 46，000J.4585 IL2信号/gp41 42，000 46，000 未检测K.3166 截短的gp41 30，000 33，000 未检测472-757L. IL-2信号/截 30，000 33，000 未检测短的gp41
1.根据核苷酸序列所推测的存在于未加工的前期前基因产物中的氨基酸残基。
2.根据存在的氨基酸残基及推测的加工形式估计的。
3.主要的具有免疫反应活性的多肽。
重组体gp160蛋白除已成功地用于Western印迹分析外，还成功地用于酶联免疫吸附试验(ELISA)及放射免疫沉淀法等典型的诊断技术中。
HIV壳膜蛋白的纯化重组体HIV壳膜蛋白是HIV重组体AcNPV病毒感染后4-5天内，在S.frugperda细胞中产生的。大部分被表达的蛋白质均与被感染的细胞有关联。因为这里所述的所有壳膜HIV基因产物都具有类似的性质，即它们首先都是细胞相关的，并且都是糖蛋白，所以本申请所述的或其它相似构建方法得到的所有HIV壳膜基因产物均可使用同一种纯化方法。以下是如何提纯由载体Ac3046表达产生的重组gp160蛋白的一个例子。
用重组体Ac3046感染S.frugiperda细胞。于感染后的4-5天收集细胞并洗去细胞培养基。首先使用标准方法将细胞分离成核和胞浆膜部分。溶解含有gp160蛋白质的糖蛋白部分，并使用标准方法经小扁豆凝集素亲合层析纯化糖蛋白。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，证明糖蛋白部分含有gp160蛋白质，且在这个阶段gp160蛋白占总糖蛋白部分的25-50%。为进一步纯化gp160，将糖蛋白部分通过一个分子筛液相层析柱。由柱上洗脱gp160蛋白作为高分子量部分，且gp160蛋白约占高分子量部分中总蛋白的90%。
与本发明相关的资料是M.P.Kieny等人的题目为“AIDS virus Env protein Expressed from a Recombinant Vaccinia Virus”的文章(发表于Bio/Technology，Vol.4，September 1986，PP790-795)。该文公开了将LAV env蛋白的env编码序列引入痘苗病毒载体内，所得活的重组体病毒WTGeLAV然后就决定了在感染的哺乳动物细胞内产生的env蛋白。该重组体蛋白与爱滋病病人的血清反应，并显示出以与LAV还原病毒的确证的env蛋白完全相同的方式，被加工和糖基化。另外，用WTGeLAV接种小鼠，可诱导产生高滴度的识别痘苗抗原决定基的抗血清，但只产生低滴度的识别LAV env蛋白的抗体。用重组体病毒感染的细胞可迅速地向培养基中释放经过加工的env蛋白。然而，这一方法对于生产和利用(如在疫苗中)env蛋白本身以引起抗LAV或HIV病毒的免疫反应，则并不是完全令人满意的，尤其是由于使用了痘苗病毒作为载体。
与本发明相关的其它现有技术文献还有G.E.Smith等的题目为“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with Baculovirus Expression Vector”的文章(发表于Molecular and Cellular Biology，Vo13，NO12，PP.183-192，December，1983)及G.C.Pennock等人的题目为“Strong and Regulated Expression of Escherichia Coli Beta-Galactosidase in Insect Cells With a Baculovirus Vector”的文章(发表于Molecular andCellular Biology，VOI.4，NO，3PP.399-406，March，1984)。另外还有1985年12月8日递交的共同待批、共同转让的专利申请810938号以及1984年12月12日公开的欧洲专利公开0127839号和1985年9月25日公开的欧洲专利公开0155474号。这些文章、专利出版物和专利申请所公开的内容均被结合到本文中并组成本公开的一部分。
因为人类获得性免疫缺陷综合症(爱滋病，ADIS)在美国、中非、欧洲及世界上其他地区普遍流行，所以本发明具有很大的重要性。如上面所指出的，这种疾病(ADIS)的致病因子是一种称为人类免疫缺陷病毒(HIV)的还原病毒，另外这种因子还有淋巴结病病毒(LAV)，人类T细胞白血病Ⅲ型病毒(HTLV-Ⅲ)或爱滋病相关病毒(ARV)等各种不同的名称。已根据分子克隆的完整核苷酸序列及对病毒蛋白的直接序列分析，阐明了几种爱滋病病毒的结构和基因组织。HIV壳膜基因(env)编码了一种分子量为160，000的糖蛋白，被定名为gp160。在病毒感染的细胞中，gp160前体在基本氨基酸的保留序列上被切断，产生一个N末端糖蛋白gp120和一个相似的C末端蛋白gp41。HIV糖蛋白gp160，gp120和gp41分别含有大约833、488和345个氨基酸。
成熟的gp120与病毒壳膜相关，并被认为是细胞外蛋白，而gp41有两段长的疏水残基，并其中一条或两条可能穿越病毒壳膜。gp160前体和成熟的gp120及gp41蛋白都是用得自受感染之个体的抗血清检测的。另外，已证明gp120蛋白可与T辅助/诱导淋巴细胞表面上的T4分子结合，而HIVgp160蛋白能够诱导那些表达T4受体蛋白之细胞的合成细胞的生成。还了解到gp160上的104个羧基末端氨基酸对于T4+T淋巴细胞的融合不是必需的。
根据本发明，HIVgp160的爱滋病病毒壳膜糖蛋白，是由感染性HIV分离物克隆的爱滋病病毒env基因表达的。用于表达的HIV env基因只编码出现在固有HIV env基因中的序列。将这种HIV env基因插入重组体棒状病毒内，以使表达一个不含改变了的或附加的氨基酸的成熟蛋白质。所制得的重组体中，一个含有完整的HIV env基因，而另一个则有gp160C末端处约100个氨基酸序列的小部分缺失。这一缺失可有助于稳定所表达重组体gp160蛋白，且设有除去存在于gp41中的两个疏水区域。
如上文所述，在昆虫细胞表达系统中产生的HIVgp160不含污染的哺乳动物细胞蛋白质。gp160的表达和纯化是在保留天然蛋白结构及其生物学活性的条件下完成的。经免疫沉淀、Western印迹分析及酶联免疫吸附试验证明，所得表达的HIV env蛋白与爱滋病病人血清有高反应活性。
已经以各种不同的量，纯度和形式生产了本发明的HIVgp160蛋白，如在无菌缓冲液中生产了浓度为每毫升约100微克壳膜蛋白的HIVgp160蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺高压液相层析(HPLC)检测纯度为50%以上。已发现HIV gp160蛋白于4℃至少可稳定保存6周。已提供了作单一使用时所需量或体积的这种蛋白质并于-70℃得以满意地储存。应尽量避免反复冻融，并应使用含有适宜蛋白质或去污剂的溶液进行稀释，以防止蛋白质和生物活性的丢失。适用的稀释剂包括0.1%牛血清白蛋白(BSA)或等同物，溶于无菌水或培养基中的0.1%血清，以及0.1十二烷基磺酸钠或其他溶于水或缓冲液中的适当的去污剂。如上文所指出的，根据本发明的方法生产的HIVgp160蛋白可被有效地利用，并根据预期的用途制成不同剂量的包装，如有含25微克、50微克或100微克蛋白等各种包装。该蛋白可作体外使用以及用于进行与爱滋病的各个方面有关的其他研究，包括疫苗开发、Western吸印、ELISA试验、受体结合试验、免疫沉降、抗血清生产、合体细胞生成及包括物理学性质研究和作为一个参考基准在内的其他应用。
Western印迹分析是检测爱滋病抗体的最为特异而且敏感的方法之一，并常常用于爱滋病研究的各个方面;如上文所述，gp160前体、成熟的gp120及gp41蛋白则是用得自于爱滋病血清反应阳性个体的抗血清检测的。因此，在本发明的一个实施方案中，将爱滋病病毒壳膜或env蛋白加在陶瓷、玻璃、聚苯乙烯塑料板、小井或薄膜如硝酸纤维素薄膜等支持材料料上，用于检测爱滋病抗体。
具体地说，根据本发明的这一实施方案，将电泳分离的爱滋病病毒重组体壳膜蛋白(HIVgp160)浸渍在作为Western印迹或吸印条使用的硝酸纤维素薄膜条上。因为依据本发明的方法HIVenv糖蛋白(envgp)是在昆虫细胞表达系统中产生的，所以没有污染的哺乳动物细胞蛋白质。已发现沉积于硝酸纤维素薄膜条(其被用Western吸印条)上的这一材料，与爱滋病病人血清有很强的反应性;而且已成功地试验了沉积于硝酸纤维素薄膜条上的HIVgp160与作1/100至1/10，000稀释的人类爱滋病阳性血清的特异性反应。其上面的特异结合抗体可用酶联试剂，如结合了第二抗体或特异性抗抗体的碱性磷酸酶或过氧化物酶，或者放射性碘标记的蛋白A检测出来。本发明这些特定实施方案所使用的进行Western印迹分析的免疫学方法，即进行Western印迹分析所用的载体或HIV蛋白浸渍的印迹条都是已知。
在具有适当数目的用后即弃的浅盘内制备了本发明的HIVgp160印迹条或载体，如在8个分离的小井中制得8个印迹条。所有保温过程均可在浅盘中进行并加一个盖，以使浅盘能作为展开Western印迹或检测结果的方便的储存容器。按照本发明的方法提供的每个条均用重组体HIVgp160壳膜蛋白浸渍，其中所说的蛋白通过在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，之后电泳转移到硝酸纤维素薄膜或条或支持载体上。所得产品可用于体外检测爱滋病壳膜抗体，以进行与爱滋病研究的各方面有关的动物和细胞或组织培养物研究，包括检测爱滋病抗体的Western吸印试验、质量控制、爱滋病的血库筛选及诊断。已发现硝酸纤维素薄膜载体或条在室温下至少在六周内是稳定的，并适于在浅盘中于阴凉干燥处储存。
已根据本发明在有适当数目的一次性使用的盘(如有96个分隔的小井的盘)中制备了HIVgp160酶联免疫试验板。所有保温处理都是在盘中进行的。每个小井均加入适当量(如100μl)纯化的HIVgp160，其浓度为每微升含1μgHIV gp160。使HIVgp160蛋白在小井中与塑料表面上附着适当时间，如于4℃过夜。之后从ELISA板的每个小井中除去剩余溶液，并使ELISA板在室温下干燥。在制得的ELISA板上，吸附于小井内壁上的HIVgp160于室温下至少6周内保持稳定，并给予这些盘中在阴凉干燥处储存，所得产品可用于检测爱滋病壳膜抗体或抗原，以进行与爱滋病研究的各个方面有关的动物和细胞或组织培养物的研究，包括酶联免疫吸附试验，以及人血清爱滋病抗体或抗原的筛选和诊断。
下面列出的文献均为支持本发明的相关文献，文献所公开的内容均被结合到本文公开的内容中并作为本公开的一部分。
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权利要求
1.一种检测爱滋病病毒抗体的方法，其包括使所说的爱滋病病毒抗体与由重组体昆虫病毒表达的爱滋病env蛋白接触，并检测所说的爱滋病病毒抗体与所说的蛋白之间的固定或反应。
2.根据权利要求
1的方法，其中所说的爱滋病病毒env蛋白是被标记了的，以便于检测所说的蛋白与所说的爱滋病病毒抗体的固定或反应。
3.一种生产受滋病病毒env蛋白的方法，其包括将爱滋病病毒env蛋白基因或爱滋病病毒壳膜基因(env)插入到昆虫病毒的DNA中，用所得到的重组体病毒感染昆虫细胞或昆虫，并培养所得感染的昆虫或昆虫细胞，以表达或产生爱滋病病毒env蛋白。
4.根据权利要求
3的方法，其中所说的昆虫病毒是一种棒状病毒。
5.一种构建能在宿主昆虫细胞内表达选择的爱滋病病毒基因或其蛋白的重组体棒状病毒表达载体的方法，包括(a).通过将棒状病毒基因组的一部分插入克隆体内，之后将选择的爱滋病病毒基因或其部分插入到该修饰过的插入载体内以制得重组体插入载体，从而使经选择的爱滋病病毒基因或其部分在棒状病毒启动子的控制下被表达;(b).通过将上述经修饰的插入载体与棒状病毒DNA混合，将上述经修饰的爱滋病病毒基因或其部分转入棒状病毒表达载体内，转染适当的昆虫细胞，并分离含有选择的爱滋病基因或其部分的重组体病毒。
6.根据权利要求
5的方法，其中选择的爱滋病病毒基因或其部分是env基因或其部分。
7.根据权利要求
5的方法，其中选择的爱滋病病毒基因或其部分是gag基因或其部分。
8.根据权利要求
5的方法，其中选择的爱滋病病毒基因或其部分是Pol基因或其部分。
9.根据权利要求
5的方法，其中棒状病毒启动子是多角体基因启动子。
10.根据权利要求
5的方法，其中棒状病毒是Autographa Californica核多角体病毒。
11.根据权利要求
6的方法，其中来自爱滋病env基因的选择的爱滋病病毒基因或其部分是在参照附图所描述和图解说明的插入载体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、A-1或B-1中。
12.一种含成选择的爱滋病病毒多肽的方法，其包括用重组体棒状病毒载体感染敏感的宿主昆虫细胞-其中棒状病毒载体含有一个或多个爱滋病病毒蛋白基因或其部分，并培养感染的细胞以表达爱滋病病毒多肽。
13.根据权利要求
12的方法，其中敏感的昆虫细胞为衍生目昆虫Spodoptera frugiperda。
14.根据权利要求
12的方法，其中爱滋病基因或其部分是env基因或其部分。
15.根据权利要求
12的方法，其中爱滋病基因或其部分是gag基因或其部分。
16.根据权利要求
12的方法，其中爱滋病基因或其部分是Pol基因或其部分。
17.根据权利要求
12的方法，其中爱滋病病毒基因或其部分是在棒状病毒启动子的控制下被表达的。
18.根据权利要求
17的方法，其中棒状病毒启动子是多角体基因启动子。
19.根据权利要求
12的方法，其中棒状病毒是Autographa Californica核多角体病毒。
20.根据权利要求
12的方法，其中选择的爱滋病病毒蛋白基因或其部分是来自于爱滋病env基因，并在参照附图描述和图解说明的插入载体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、A-1或B-1中。
21.一种纯化爱滋病env基因多肽的方法，包括使所说的多肽通过小扁豆凝集素亲合层折柱以分离糖蛋白，之后使用分子筛层折按分子量大小分离糖蛋白。
22.根据权利要求
21的方法，其中爱滋病env基因多肽是依照权利要求
20生产的。
23.一种检测和测定人类爱滋病的方法，包括使所说的抗体与由重组体昆虫病毒表达的重组体爱滋病病毒蛋白的接触。
专利摘要
棒状病毒—昆虫细胞载体系统被用作为生产重组体蛋白质的一个高效率的真核克隆和表达的方法。本系统主要应用是开发各种各样人类和动物重要疾病的rDNA疫苗。本系统被用于表达由人类免疫缺陷病毒(HTV)的壳膜蛋白得到的各种各样候选的疫苗免疫基因。由这些重组体中的一些产生的HTV抗体已经成功地被用于包括ELTSA，Western印迹法和放射免疫沉降法的各种免疫诊断试验法中。
文档编号C12N15/86GK87107837SQ87107837
公开日1988年12月21日 申请日期1987年10月16日
发明者马克·艾·科克伦, 盖尔·埃·史密斯, 富兰克林·沃尔沃维斯 申请人:微基因系统公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan