专利名称：巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别涉及巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用。
背景技术：
肠道病毒71型(英文名为Human enterovirus 71),简称EV71,是引起婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease ；HFMD)主要病原体之一。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidney cell ；RhMK)及人胚二倍体细胞(human fetal diploid cell)中。若检体取自病人粪便及组织即以人胚肾二倍体细胞(diploidstrain of human fetal kidney cell ；HFDK)培养；若为咽喉拭子检体则选用人胚肺二倍体细胞细胞(diploid strain of human fetal lung cell)培养。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠病毒所致的细胞病变(cytopathetic effect ；CPE)现象，由电子显微镜下观察其形态(morphology)及物理化学(physicochemical)特性都与当时已知的其他肠病毒类似，但进行中和抗体试验(neutralization test)或免疫扩散试验(immunodiffusion test)后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象，因此推测当时所发现的病毒为一种新型的肠病毒，故将该病毒株命名为肠病毒71型。人肠道病毒71型(EV71)主要感染6岁以下婴幼儿，可引发手足口病和疱疹性咽峡炎等，重症包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、迟缓性麻痹等。发热是婴幼儿EV71感染的常见临床症状，患者绝大多数是小于6个月婴儿。急性呼吸道疾病是EV71感染的又一常见临床症状，在澳大利亚、加拿大和1998年我国台湾省的EV71流行中都有报道。它包括一些常见呼吸道症状，如咽炎、哮喘、细支气管炎和肺炎，发病年龄一般为I 3岁，需要住院治疗。急性咽喉炎也是EV71的一个临床症状，在中国香港特别行政区、中国台湾省和日本地区的EV71流行中都曾有报道。其中1998年我国台湾省EV71流行期间急性咽喉炎患者比例较大，达到10%以上。感染初期患者表现为低热、流涕、食欲下降、口痛、呕吐、腹泻等。口腔黏膜出现小疱疹，常分布于舌、颊黏膜、硬腭，也可以出现在扁桃体、牙龈及咽部等，疱疹破溃后形成溃疡。在口腔病变的同时皮肤可以出现斑丘疹，以手足为多见，皮疹主要分布于手背、指间，偶见于躯干、大腿、臀部、上臂等处，呈离心性分布，斑丘疹很快转为小疱疹，直径约3 7mm，质地稍硬，自几个至数十个不等，2 3日自行吸收，不留痂。大多数为良性过程，多自愈，但可复发，有时伴发无菌性脑膜炎、心肌炎等。EV71累及神经系统主要表现为无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪性疾病，多发生于5岁以下幼儿，I岁以下婴儿发病率最高。临床表现变化多样，病情轻重不一，一般表现为阵挛、呕吐、共济失调、意向性震颤、眼球震颤及情感淡漠等。头颅MRI及脑电图检查有助于明确疾病的严重性。大量尸检和组织病理学研究表明，EV71引起的肺水肿是神经源性的。EV71首先破坏脑干组织特定的具调节功能的结构，引起自主神经功能的紊乱，最终导致肺水肿。神经源性肺水肿、肺出血和心力衰竭是导致婴幼儿死亡的主要原因。目前，临床上尚无特效的治疗措施，针对疫情的主要控制方式包括公共卫生防控和对感染病人的对症治疗等，对于EV71感染尚没有公认的特效药物或疫苗。利用过继免疫细胞进行抗病毒治疗,是临床上已经采用的治疗病毒感染性疾病的方法之一，目前主要使用病毒特异性的T淋巴细胞。巨噬细胞在防微生物感染的宿主天然免疫系统中发挥重要作用，它可以通过吞噬或分泌调节性炎症因子来发挥抗感染作用。巨噬细胞过继治疗已经被应用于治疗癌症、再灌注损伤和肺炎等的研究或应用。然而利用巨噬细胞的抗病毒活性来治疗EV71感染性疾病的研究却未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用。本发明利用实验室所建立的EV71感染小鼠模型，对巨噬细胞过继治疗法抑制人肠道病毒71型复制和治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的效果进行了研究，证实其具有较好 的治疗效果。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用。作为优选，药物的作用方式为过继免疫。作为优选，药物为供体的单核细胞、供体活化的巨噬细胞或供体含有单核细胞或巨噬细胞的血液成分。本发明利用实验室所建立的EV71感染小鼠模型，对巨噬细胞过继治疗法抑制人肠道病毒71型复制和治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的效果进行了研究，证实其具有较好的治疗效果。
图I示成年小鼠体内分离的巨噬细胞(Macrophage)在体外具有吞噬和杀死EV71病毒的活性，通过RD细胞滴定巨噬细胞内EV71的TCID5tl ;线I示RD细胞，线II示巨噬细胞；图2示成年小鼠体内分离的巨噬细胞(Macrophage)在体外具有吞噬和杀死EV71病毒的活性，通过qRT-PCR法测定培养基中病毒的拷贝数；线I示RD细胞，线II示巨噬细胞；图3示液体石蜡刺激小鼠的巨噬细胞活性可提高小鼠遭EV71感染时的存活率；线II示安慰剂组，线I示液体石蜡组；图4示成年小鼠的巨噬细胞过继治疗可降低EV71感染小鼠的死亡率；线I示安慰剂组，线II示巨噬细胞过继组；图5示成年小鼠的巨噬细胞过继治疗临床症状严重程度；线I示安慰剂组，线II示巨噬细胞过继组；图6示成年小鼠的巨噬细胞过继治疗后骨骼肌内病毒复制曲线；线I示安慰剂组，线II示巨噬细胞过继组。
具体实施例方式本发明公开了巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用中，所用巨噬细胞可以通过石蜡刺激成年小鼠，收集并分离腹腔的巨噬细胞所得，也可通过分离成年小鼠的单核细胞刺激分化获得。在实际应用中，可通过分离纯化小鼠的单核细胞， 并在体外刺激其分化成巨噬细胞而获得。下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例I巨噬细胞体外抗病毒作用向成年ICR小鼠腹腔内注射I毫升无菌的液体石蜡，激活巨噬细胞。4天后将小鼠麻醉，注射10毫升无菌的冰预冷的DMEM培养基清洗小鼠腹腔，得到巨噬细胞悬液。随后将巨噬细胞用PBS洗涤3次，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37°C培养I小时。未贴壁的细胞用PBS冲洗掉，巨噬细胞继续用含10 %胎牛血清的DMEM培养基培养过夜。纯化的巨噬细胞接种于6孔细胞培养板中(2X IO5细胞/孔)，随后，每孔细胞接种 I X IO5TCID50 的 EV71 病毒(FY0805，GenBank 存储号HQ882182)。感染后的细胞继续用含含2%胎牛血清的DMEM培养基培养，每隔I小时取细胞培养上清和细胞分别测定EV71病毒RNA的拷贝数和病毒的TCID5tl,以可支持病毒复制的人横纹肌瘤细胞(RD)作为对照。EV71感染巨噬细胞后，每隔I小时移除培养基上清，巨噬细胞用PBS洗涤3次。随后，巨噬细胞重悬于I毫升PBS中，冻融三次破碎细胞，离心除去细胞碎片，利用RD细胞滴定巨噬细胞内EV71的TCID50 ；V71感染巨噬细胞后，每隔I小时取200微升培养基上清，qRT-PCR法测定培养基中病毒的拷贝数，实验结果重复3次。结果见图I、图2。结果表明EV71感染成年小鼠的巨噬细胞后，可以在巨噬细胞内检测到EV71病毒存在，但病毒的毒力随着时间的延长逐渐降低。同时细胞外培养基中的病毒拷贝数随着时间有逐渐下降的趋势，表明与可支持EV71复制的RD细胞相反，巨噬细胞可以在体外吞噬并缓慢地杀死EV71。实施例2感染病毒前激活巨噬细胞可降低小鼠的死亡率向6日龄的ICR小鼠腹腔内注射200微升无菌的液体石蜡，以激活幼鼠的巨噬细胞，以等体积PBS注射的小鼠作为对照。4天后，每只ICR幼鼠经腹腔注射感染IXIO7TCID5q的EV71小鼠适应株MPlO (GenBank存储号HQ712020),每组实验20只小鼠，该实验重复两次。记录小鼠的死亡率，结果见图3。结果发现，未经液体石蜡刺激的小鼠在经受EV71病毒感染后，10日内全部死亡。而感染病毒前给予液体石蜡刺激巨噬细胞的活性，可以提高小鼠面临病毒攻击时的存活率(达20%左右)，表明激活巨噬细胞活性可以降低小鼠在面临EV71病毒感染时的死亡率。实施例3巨噬细胞可降低EV71感染小鼠的死亡率
按照实施例I的方法分离纯化成年ICR小鼠的腹腔巨噬细胞待用。每只10日龄的ICR幼鼠经腹腔注射感染IX IO7TCID5tl的EV71小鼠适应株MP10。感染I天后，每只小鼠经腹腔注射给予I X IO7个分离自成年小鼠腹腔的巨噬细胞。随后，记录小鼠的存活率(每组实验用30只小鼠)、临床症状(每组实验用30只小鼠)，并用qRT-PCR测定小鼠骨骼肌内的病毒载量(每个时间点6只小鼠)，实验重复3次，结果见图4、5、6。结果发现未经巨噬细胞过继治疗的小鼠在EV71病毒感染后10日内全部死亡，而采用成年小鼠的腹腔巨噬细胞过继治疗EV71感染的小鼠，可以提高小鼠的存活率到35%，并且小鼠的症状明显减轻，瘫痪症状持续时间缩短，严重程度降低，骨骼肌内的病毒载量自第5日起显著降低。这表明成年小鼠的巨噬细胞过继治疗可以降低EV71感染幼鼠的死亡率。实施例4巨噬细胞可降低EV71感染小鼠的死亡率 分离纯化成年ICR小鼠的单核细胞，在体外刺激分化其分化成巨噬细胞待用。每只10日龄的ICR幼鼠经腹腔注射感染I X IO7TCID50的EV71小鼠适应株MP10。感染I天后，每只小鼠经腹腔注射给予IX IO7个分离自成年小鼠单核细胞活化后的巨噬细胞。随后，记录小鼠的存活率(每组实验用30只小鼠)、临床症状(每组实验用30只小鼠)，并用qRT-PCR测定小鼠骨骼肌内的病毒载量(每个时间点6只小鼠)，实验重复3次。结果发现未经巨噬细胞过继治疗的小鼠在EV71病毒感染后10日内全部死亡，而采用成年小鼠单核细胞体外刺激后获得的巨噬细胞过继注射EV71感染的小鼠，可以提高小鼠的存活率到35 %，并且小鼠的症状明显减轻，瘫痪症状持续时间缩短，严重程度降低，骨骼肌内的病毒载量自第5日起显著降低。这表明成年小鼠的巨噬细胞过继治疗可以降低EV71感染幼鼠的死亡率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述药物的作用方式为过继免疫。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述药物为供体的单核细胞、供体活化的巨噬细胞或供体含有单核细胞或巨噬细胞的血液成分。
全文摘要
本发明涉及医药领域，特别涉及巨噬细胞在制备治疗人肠道病毒71型感染疾病药物中的应用。本发明利用实验室所建立的EV71感染小鼠模型，对巨噬细胞过继治疗法抑制人肠道病毒71型复制和治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的效果进行了研究，证实其具有较好的治疗效果。
文档编号A61K35/12GK102670652SQ20121008672
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘江宁, 张连峰 申请人:中国医学科学院医学实验动物研究所