专利名称：用于产生高多样性文库的方法
背景技术：
本发明总体上涉及到产生和变换重组文库的方法。
分离一个目的核酸或氨基酸序列需要一个数量庞大的高多样性重组文库，该库可代表一个特定的类型，并可用一种或多种检测技术鉴定出该种类。这样的文库有助于分离出有用的化合物和其编码序列，这些化合物包括治疗剂、研究诊断剂和农用试剂。
另外，目的文库可专门设计成包含某一化合物的数目众多的可能的变体。此类文库可用于检测化合物的改进型，例如检出一具最佳疗效的化合物。
增加文库多样性的方法对于这些或其它应用十分有益，它代表了蛋白设计产业的一个重要焦点。
发明概要本发明总体上的特点在于一种生成核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一批单链核酸模板，每个模板包括一编码序列和一可操作地连接的启动子序列；(b)用同所述模板基本互补的单链核酸片段混合物与所述模板群杂交，这些片段短于模板；(c)让步骤(b)的每一种杂交体产物与缺失链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶接触，以这些片段为引物合成基本同模板互补的第二条核酸链；和(d)让步骤(c)的产物与RNA聚合酶接触，以产生RNA文库，该库由第二条链转录而成。
在优选的方案中，将该方法用于向文库引入一个或多个突变；通过切割双链核酸分子产生基本互补的单链核酸片段混合物；通过合成随机寡核苷酸产生基本互补的单链核酸片段混合物；单链核酸模板来自携带核酸的M13噬菌体，通过基因Ⅵ外切酶或λ外切酶消化双链中的一条，通过链亲合素结合生物素化的单链核酸，或通过对RNA反转录而获得；基本互补的单链核酸片段混合物至少包括100个不同种类的片段；步骤(b)在每单链模板用1到约1000个片段条件下进行，用步骤(c)产物的一条链作模板，并对步骤(b)和(c)进行重复；在每一轮中，用步骤(c)的产物作核酸模板重复步骤(b)和(c)；该方法进一步涉及一个或多个单链核酸的片段，它们同单链核酸模板形成同源双螺旋，步骤(b)在可形成同源双螺旋片段存在的情况下进行；启动子为T7启动子；DNA聚合酶是T4DNA聚合酶；本方法还涉及在接触步骤(d)之前对步骤(c)产物进行扩增；本方法还涉及到步骤(e)将RNA文库翻译成为蛋白质文库；该方法还涉及到步骤(e)将一氨基酸受体分子连接到基本上每一RNA库成员的编码序列的3′端；本方法还涉及步骤(f)翻译RNA文库而产生一个RNA-蛋白质融合文库。
在第二个方面，本发明的特点还在于一种减少一群核酸分子中序列的变异的方法。该方法包括(a)产生第一群具变化的序列的单链核酸模板，基本上每一模板包括一编码序列和一可操作地连接的启动子序列；(b)用基本同第一群模板互补的第二群单链核酸片段与第一群杂交，这些片段均短于模板且属于基本上相同的序列；(c)令步骤(b)的杂交产物同缺乏链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶相接触，以这些片段为引物合成基本与模板互补的第二核酸链；和(d)令步骤(c)的产物同RNA聚合酶相接触以产生一群RNA分子，这些RNA分子由第二条核酸链转录而成，且相对于第一群单链核酸模板序列变异减少。
在优选方案中，本方法被用于从第一组单链核酸模板中去除一个或多个突变；步骤(b)涉及到用两群或更多群不同的基本互补单链片断同第一群单链模板进行杂交；通过切开双链核酸分子产生第二群基本互补的核酸片段；通过合成随机寡核苷酸来产生第二群基本互补的核酸片段；单链核酸模板产自携带该核酸的M13噬菌体，或用基因Ⅵ外切酶或λ外切酶降消化双链核酸中的一条，或用链亲合素俘获生物素化的单核酸链，或通过反转录RNA来获得。步骤(b)在每个单链模板用1到约1000单链核酸片段的条件下进行；步骤(c)产物的单链被用作模板，并对步骤(b)和(c)进行重复；在每一轮中，用步骤(c)的产物作核酸模板重复步骤(b)和(c)；启动子为T7启动子；DNA聚合酶为T4DNA聚合酶；本方法还涉及在接触步骤(d)之前对核酸步骤(c)产物进行扩增；本方法还涉及步骤(e)将RNA文库翻译成为蛋白质文库；该方法还涉及到步骤(e)将一氨基酸受体分子连接到RNA库基本上每一成员的编码序列的3′端；本方法进一步涉及步骤(f)翻译该群RNA分子而产生一个RNA-蛋白质融合文库。
在第三个方面，本发明的特点还在于一种产生核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一群单链核酸模板，每模板包括一编码序列；(b)产生一群具有不同序列的单链核酸分子，它们同单链模板基本互补；(c)在足以形成双聚体的情况下，令这些具有不同序列的单链核酸分子同单链核酸模板群杂交；和(d)让双螺旋与一种或多种切割/修复酶接触，在可令这些酶修复双螺旋中错配碱基对的条件下作用。
在一优选方案中，本方法进一步涉及到产生一群来自步骤(d)产物的单链模板并重复步骤(c)和(d)；在每一轮中，用步骤(d)产物作单链模板重复步骤(c)和(d)。
在第四个方面，本发明的特点还在于产生了一种产核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一群单链核酸模板，每模板包括一编码序列；(b)利用同单链核酸模板基本互补的核酸片段混合物与这一群单链核酸模板杂交，这些片段的长度短于模板；(c)令步骤(b)的每一种杂交产物与缺乏链置换活性的DNA聚合酶及DNA连接酶相接触，以片段为引物来合成同核酸模板基本互补的第二核酸链；(d)以一种或多种切割/修复酶作用于步骤(c)的产物，作用在可使这些酶修复产物中的错配碱基的条件下进行。
在优选方案中，本方法还涉及产生一群来自于步骤(d)的单链模板并对步骤(b)-(d)进行重复；重复(b)-(d)时，每一轮使用来自于步骤(d)的产物的一群单链模板。
在本发明第三和第四方面的优选方案中，与切割/修复酶的接触在生物体内完成(如在细菌细胞中)；与切割/修复酶的接触在体外完成；单链核酸模板产自携带该核酸的M13噬菌体，或用基因Ⅵ外切酶或λ外切酶消化双链核酸模板的一条链，或用链亲合素俘获生物素化的单核酸链或反转录RNA来获得。步骤(b)每个单链核酸模板使用1到约1000具有不同序列的单链核酸分子或单链核酸片段的条件下进行；本方法进一步涉及步骤(e)扩增步骤(d)的产物；每一编码序列均与启动子序列可操作地连接；本方法还进一步涉及步骤(e)将步骤(d)的产物转录以产生一RNA文库；本方法还进一步涉及步骤(f)翻译该RNA文库以产生一蛋白质文库；本方法还涉及步骤(f)将一氨基酸受体分子连接于RNA文库基本上每一成员的编码序列的3′末端；本方法进一步涉及步骤(g)翻译该RNA文库以产生一RNA-蛋白质融合文库。
在这里使用的“文库”指的至少108个含核酸和/或氨基酸组分的分子，优选为至少1010个，更优选至少1012个；最优选为至少1014个分子。
核酸片段“混合物”指至少100个核酸片段，优选为至少500个，更优选为至少1000个，最优选为至少1500个片段。
“启动子序列”指的是具有有功能的RNA聚合酶结合位点并能使邻近的编码序列转录的任何核酸序列。
“基本互补”指一条核酸链具有足量的可以同另一核酸链形成沃森-克里克碱基对的核苷酸而在两种核酸之间产生一个或多个双链区域。可以认为不需要一个核酸分子中的每一核苷酸均与另一基本互补的反向链中的核苷酸形成沃森-克里克碱基对；同时，在“基本互补的单链核酸混合物中”，相当一部分片段包含有一个或多个可与“单链核酸模板”形成错配的核苷酸。
“链置换活性”指的是聚合酶或与其相关的解旋酶打断两个核酸链之间碱基配对的能力。
“突变”指的是任何核苷酸的变化，它包括可引起不同表型的序列变化或沉默变化。
“双螺旋”指的是两条核酸链具备的互补序列足以维持杂交体的情况下退火形成的结构。一个双螺旋可是“同源双螺旋”或“异源双螺旋”。“同源双螺旋中”，一条链的所有核苷酸均与另一条反向中核苷酸形成配对。“异源双螺旋”指两条核酸分子中，由于一个或多个错配，一条链中的一个或多个核苷酸没有或不能同另一条中的一个或多个核苷酸形成适当配对，在这种情况下退火形成的结构。不同类型的异源双螺旋的例子包括表现出一个或多个核苷酸交换或插入与缺失突变的双螺旋。
“随机寡核苷酸”指的是一些寡核苷酸混合物，它们在一个或多个核苷酸位置上有变动。随机寡核苷酸可通过完全或部分随机合成的方法产生，也可以直接方式有目的地变动某个核苷酸。
“氨基酸受体分子”指的是任一可通过核糖体肽酰转移酶催化而掺入生长中的蛋白链C端的分子。典型的“氨基酸受体分子”包括(ⅰ)一个核苷或核苷样部分(如腺苷或腺苷类似物(可以在N-6氨基位二甲基化))，(ⅱ)一个氨基酸或氨基酸样部分(如20个D或L-氨基酸中的任何一个或其类似物(如O-甲基-酪氨酸或在Ellman etal.,Meth.Enzymol.202:301,1991述及的任何氨基酸类似物))，和(ⅲ)两者之间的连接(如在3′位置上的酯、酰胺或酮连接物，2′位置亦可，但不如3′)；优选的这一连接不要明显地干扰天然核糖核苷构型中的环的折叠。氨基酸受体可以具有一个亲核体，这可以是一个氨基基团、羟基基团或疏基基团，但不限于此。另外，氨基酸受体可以包括核苷类似物、氨基酸类似物或一具核苷-氨基酸复合结构的类似物。
将氨基酸受体分子连至编码序列的“3′端”意指将氨基酸受体分子置于编码序列的最后一个密码子之后。这一术语包括，但不限于恰好位于编码序列3′端的氨基酸受体分子，同时也包括该分子同最后一个密码子相隔一段间插的编码或非编码序列(如，一段与暂停位点相关的序列)的情况。该术语还包括这样的结构其中，编码或非编码序列位于氨基酸受体分子之后(即3′末端)。同时，本术语还包括，但不限于这样的情况，一个氨基酸受体分子与编码序列共价相连(直接或通过核酸间隔序列间接相连)，也包括通过某些非共价链相连的情况，如同一连有氨基酸受体的核酸链与编码链3′端附近杂交。
“RNA-蛋白”融合意指任何包含有通过酰胺键与蛋白共价结合的核糖核酸的分子。该共价键抗核糖体裂解。
“蛋白质”指的是两个或两个以上天然生成或修饰过的氨基酸以一个或多个肽键相连的分子。“蛋白”、“肽”和“多肽”在这里是可交换使用的。
“一群具变化序列的单链模板”意指具有只有一个或几个核苷位点不同的序列的一群核酸。
“切割/修复酶”指的是可以去除错配碱基或环并代之以标准碱基对(即A∶T或G∶C)的酶的任意组合。
附图简述
图1是一种产生高多样性RNA-蛋白质融合文库的典型片段重组方法的图解。该方法中的片段来自已引入序列变异的双链DNA分子。
图2是第二种典型片段重组方法的起始步骤的图解。该方法中的片段是已引入序列变异的合成寡核苷酸。
详述本发明涉及到很多新的用于核酸序列随机重组、产生具遗传变异的DNA、RNA和蛋白质文库的相关方法。如下文的详述，在一种优选方案中，这一技术在体外进行以产生传统的蛋白质文库或RNA-蛋白质融合文库，这两者均可用于与用于从文库群中选择目的蛋白或多肽(或它们的相关编码序列)的多种方法的任一种结合使用。这一通用的方法提供了一种以非偏倚的方式向蛋白质文库引入突变的手段，以及一种从文库或选定的库中除去非所需突变的技术，还可在其后的选择中“回交”出一组分子。
片段重组根据本发明的一种优选方法，可通过产生突变片段并用其同未突变片段(一般为野生型)进行随机重组以产生文库。这一通用方法的一个例子可见图1。如图所示，突变首先被随机引入一初始双链DNA序列(称“dsDNA(init)”)。这产生了一群突变的双链DNA序列，图1中称为“dsDNA(mut)”。可通过任何手段引入这些突变，包括PCR突变法(该方法依赖于Taq聚合酶的错配修复能力低的机制)，位点特异突变或模板特异突变(例见Joyce and Inoue,Nucl.Acids Res.,17:177,1989)。这一群包含突变的DNA随之用多种标准方法切成片段。例如，用一种或几种核酸酶部分降解DNA(如DNaseI，微球核酸酶，限制性内切酶或P1核酸酶)，或可进行化学降解，如利用Fe·EDTA.另外，还可通过在多聚化(如PCR扩增)时限制核苷的消耗来产生包含有突变的片段，或进行简单的物理切割(如超声处理)。较理想的片段长约25-1000个碱基对，最理想的长50-150个碱基对。
随后，加热这些DNA片段，然后将之同已确认为初始DNA非编码链(或称负链)的全长单链DNA模板一起退火。另外，这一杂交混合物中还包括另一种片段，有时称之为“终止子片段”(Joyce andInoue,Nucl.Acids Res.17:171,1989)。这一终止片段与单链模板的3′端互补并提供一个聚合反应的引物，它与模板的结合不依赖于随机退火的突变片段的数量和性质。
单链模板可通过任何标准技术生成，如利用携带DNA序列的M13噬菌体，或利用基因Ⅵ核酸外切酶(Nikiforov et a1,PCR MethodAppl.3:285,1994)或λ核酸外切酶(Higuchi and Ochman,Nucl.AcidsRes17:5865,1989)降解dsDNA(init)分子的编码链，或通过固定化的链亲合素俘获生物素化的DNA链(Joyce and Inoue,Nucl.AcidsRes.17:171,1989)，或通过对RNA进行反转录。将模板同片段相混合以进行杂交，混合比例不得低于每模板分子一个片段，不得高于每模板分子1000个片段。片段同模板的比较例较低时产生的子代链更接近于模板，比例较高时则更接近于片段。可通过标准方法来确定杂交条件，并被设计成能形成模板与片段的异源双螺旋。杂交技术的示例可见于stemmer.美国专利No.5,605,793。
片段在与模板退火后，用缺乏链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶将其连接起来。适用于该目的的DNA聚合酶包括T4DNA聚合酶和来自大肠杆菌的重组DNA polⅡ(例见Hughes et al.,J.Biol Chem.266:4568,1991)，但不限于以上两种。任何DNA连接酶(如T4DNA连接酶)均可使用。在这一步，可先用DNA聚合酶后用DNA连接酶处理于DNA双螺旋，也可同时使用这两种酶，例见Joyce和Inove(Nucl.AcidsRes17:711,1989)。如图1所示，本步生成一群双链DNA(称为“dsDNA(lib)”)，其中每一成员基本都在一条链上有1到多个引入的突变。由于最初引入的突变和退火的片段数量和性质都是随机的，该群DNA中不同的双螺旋具有不同的突变序列。
这一用于生成双链DNA文库的通用方法有一个替代方法，可见图2。此替代方法中，一些单链寡核苷酸片段被合成出来，它们同初始双链DNA分子的编码链部分相对应。这些寡核苷酸片段以长5-2000个核苷酸为宜，最适长度为20-100个核苷酸，并以标准的核酸合成方法来产生。这些带有随机或半随机突变的寡核苷酸可通过标准方法来合成。这些寡核苷酸优选每20个核苷酸有3个以内的引入错配，同时应避免读码框内的终止密码子。另外。在某些情况下，还可通过引入非天然的强亲合性碱基对，如C-5丙炔尿嘧啶或C-5-丙炔胞嘧啶，以增强寡核苷酸的杂交能力，这是有益甚至是必需的。这些技术可见于Wagneret al,Science260:1510,1993。
随后，用这些含有突变的寡核苷酸片段同单链模板杂交，这些模板同上一方法一样是全长的，其序列与初始DNA的非编码链(负链)一致。同上文所述，片段用DNA聚合酶和DNA连接酶来连接以产生双链DNA文库(dsDNA(lib))。这一文库也包括一群双螺旋分子，其中有一组不同的编码链，它们的区别在于突变的数量、位置和同一性。
如果需要，以上步骤均可利用片段或寡核苷途径进行重复以向DNA分子引入不同数量的突变。具体地讲，可以突变链为初始单链模板，用突变片段或寡核苷酸与这些链退火并进行多聚化和连接。
回交方法如上文概述，本发明的方法被用于向一初始DNA序列引入突变。另外，这些技术可用于除去或减少DNA文库中的不需要的突变发生的频率，根据这一方法，dsDNA(mut)在被切成片段后同野生型序列的寡核苷酸或同未突变或野生型的DNA(wtDNA)的特定片段一起加入到单链模板中。这些片段是相互分离的链(如必需)，将其同全长单链一起退火，再如上文用DNA聚合酶或T4连接酶将之连接。相对相应的突变片段而言，使用高浓度的未突变寡核苷酸或片段所产生的文库中，不需要的突变被降至最少甚至消除。
此方法还可用于现有的含有在突变的文库，以同样减少或除去不需要的序列。该方法涉及到一具有突变序列的初始文库以及野生序列的片段或寡核苷酸的退火、多聚化和连接，操作同上文所述。
RNA、蛋白质或RNA-蛋白质文库在本发明的一个优选方案中，上文述及的DNA文库还进一步包括RNA聚合酶如SPb或T7聚合酶的结合位点。这些位点例见Milligan etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:696,1990。该位点位于编码序列的上游，这一位置使序列得以转录。一般此类位点位于编码序列上游5-2000个碱基对处。
包含有RNA聚合酶结合位点的文库可通过上文提及的方法予以变动。多聚化和连接之后，可直接转录dsDNA(lib)以产生RNA文库，如利用体外转录系统，还可将dsDNA(lib)直接转录并翻译以产生蛋白质文库，如利用体外转录和翻译系统。体外转录和体外翻译系统的例子包括T7转录系统和兔网织红细胞、麦胚芽、酵母及大肠杆菌翻译系统。
如果需要，可通过在转录前进行链特异性扩增来增加文库中每一RNA或蛋白的拷贝数。例如，PCR扩增可通过在多聚化和连接步骤中向突变链引入统一的引物结合序列以同引物结合。这些序列可作为错配或DNA一端或两端的延伸而并入。这可使新生链扩增时不扩增模板链。还可以通过对与新生链3′端互补的单一寡核苷酸引物进行多轮的退火和延伸以进行线性扩增。随后的PCR和转录过程产生的RNA主要对应于突变序列，只有一小部分由模板序列产生。
在一个优选方案中，上述用于引入突变或回交去除不需要的突变的方法可被用于产生高多样性的RNA-蛋白质文库。该文库的建立可通过将一个包含有不水解的氨基酸受体分子如嘌呤霉素的接头连至文库(如，按上文方法创建的文库)的RNA3′端来完成。产生RNA-蛋白质融合文库的例子可见于Szostak et al.,USSN09/007,005；及Robertset al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12297,1997。随后对这些RNA的翻译产生了一个RNA蛋白融合分子库，它可用于体外选择实验。
此外，如果需要，RNA或RNA-蛋白融合分子经选择后可用作标准PCR的模板以获得相关编码序列。这样，本方法就提供了一个可用于片段重组、分子回交、蛋白和/多肽选择和其相关编码序列选择的手段，这些均在体外系统完成。
切割/修复除片段重组方法之外，切割/修复也可用于变动库中的序列。这一方法可用于产生DNA、RNA和RNA-蛋白质融合文库。该技术的依据在于按上文任一种方法产生的dsDNA(lib)自身带有特定数量的错配碱基对。为产生文库序列的多样性，这些错配需在体外用切割/修复酶加以修复。可利用任一切割/修复系统来进行修复(例见Jaiwal et al.,Nucl.Acids Res.26:2l84,1998；或Fortini et al.,Biochemistry37:3575,1998)。
切割/修复步骤还可通过将dsDNA(lib)转入细菌或酶母菌株以利用它们的修复系统在体内来完成。该步骤也可通过将文库转化入一标准的体内切割/修复系统来完成。该系统的例子可见于Campbell etal.,Mutat Res.211:181,1989；Bishop and kolodner.Mol.Cell Biol.6:3401,1986；Fishel et al.,J.Mol.Biol188:147,1986；和Westmoreland et.al.,Genetics145:29,1997。
由于以上的修复过程是随机进行的，这一切割/修复方法有时可导致突变引入文库序列且其它时候也可能造成编码链回交成野生型序列。
在以上方法的一个替代方法中，体外或体内的切割/修复可利用dsDNA(mut)(如，按上述方法产生的dsDNA(mut)和dsDNA(init)或wtDNA作为底物来产生多样性文库。在该技术中，混合物的链被分开并重新退火，然后在体外与切割/修复酶共温浴或转化入细菌以利用细菌的切割/修复系统(如上文提及的系统)。可以该方法将突变随机引入序列，也可将野生序列回交到dsDNA(mut)分子中。
权利要求
1．用于生成核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一群单链核酸模板，每个模板包括一编码序列和一可操作地连接的启动子序列；(b)用同所述模板基本互补的单链核酸片段混合物与所述模板群杂交，这些片段短于所述核酸模板；(c)让步骤(b)的每一种杂交产物与缺乏链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶相接触，以这些片段为引物合成基本同模板互补的第二条核酸链；和(d)让步骤(c)的产物与RNA聚合酶接触以产生RNA文库，该文库由第二条核酸链转录而成。
2．权利要求1的方法，其中，所述方法的方法应用于向该文库中引入一个或多个突变。
3．用于减少一群核酸分子中的序列变异的方法，该方法包括(a)产生第一群具变化的序列的单链核酸模板，基本上每一模板包括一编码序列和一可操作连接启动子序列；(b)用基本同单链核酸模板互补的第二群单链核酸片段与第一群杂交，这些片段均短于所述核酸模板并基本属于同一序列；(c)令步骤(b)的杂交产物同缺乏链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶接触，以这些片段为引物合成基本与核酸模板互补的第二链；(d)令步骤(c)的产物同RNA聚合酶相作用以产生一群RNA分子，这些RNA分子由第二条链转录而成，且相对于第一群单链核酸模板变异较小。
4．权利要求3的方法，其中，所述方法应用于消除所述的第一群单链核酸模板中的一个或多个突变。
5．权利要求3的方法，其中，步骤(b)包括用第一群单链核酸模板同两群或多群基本互补的单链核酸片段进行杂交。
6．权利要求1或3的方法，其中，基本互补的单链核酸片段混合物由解开双链核酸分子或合成随机寡核苷酸而生成。
7．权利要求1或3的方法，其中，所述的单链核酸模板是用携带该核酸的M13噬菌体、或用基因Ⅵ外切酶成λ外切酶降解双链核酸模板的一条链，或用链亲合素俘获生物素化的单链核酸，或对RNA进行反转录而获得。
8．权利要求1或3的方法，其中，所述的基本互补的单链核酸片段混合物包括至少约100种不同的核酸片段。
9．权利要求1或3的方法，其中，步骤(b)在每个单链核酸模板用1到约1000个片段的条件下进行。
10．权利要求1或3的方法，其中，步骤(c)的单链产物被用作核酸模板且步骤(b)和(c)重复进行。
11．权利要求10的方法，其中，在每一轮中用步骤(c)产物作核酸模板而重复进行所述的(b)和(c)。
12．权利要求1的方法，其中，所述的方法进一步包括产生一个或多个单链核酸模板，这些模板可与所述的单链核酸模板形成同源双螺旋，同时，步骤(b)在存在可形成同源双螺旋的片段的情况下进行。
13．权利要求1或3的方法，其中，所述的启动子为T7启动子。
14．权利要求1或3的方法，其所述的DNA聚合酶为T4DNA聚合酶。
15．权利要求1或3的方法，其中，所述的方法进一步包括在接触步骤(d)之前对步骤(c)的产物进行扩增。
16．权利要求1或3的方法，其中，所述方法进一步包括步骤(e)翻译RNA文库以产生蛋白质文库。
17．权利要求1或3的方法，其中，所述方法进一步包括步骤(e)将所述的RNA文库基本上每一成员的编码序列3′端与一氨基酸受体分子连接。
18．权利要求17的方法，其中，该方法进一步包括步骤(f)翻译所述的RNA文库以产生一个RNA-蛋白质融合文库。
19．一种用于产生核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一群单链核酸模板，每模板包括一编码序列；(b)产生一群具有不同序列的单链核酸分子，它们同所述单链核酸模板群基本互补；(c)在可充分形成双螺旋的情况下，令这些具不同序列的单链核酸分子同单链核酸模板杂交；和(d)让双螺旋与一种或多种切割/修复酶接触，在可令这些酶修复双螺旋中错配碱基的条件下作用。
20．权利要求19的方法，其中，该方法还包括产生一群来自于步骤(d)产物的单链模板，并重复步骤(c)和(d)。
21．权利要求20的方法，其中在每一轮中用步骤(d)的产物作单链模板重复步骤(c)和(d)。
22．用于产生核酸文库的方法，该方法包括(a)产生一群单链核酸模板，每模板包括一编码序列；(b)利用同单链核酸模板基本互补的核酸片段混合物与单链核酸模板杂交，这些片段长度短于所述核酸模板；(c)令步骤(b)的杂交产物与缺乏链置换活性的DNA聚合酶及DNA连接酶相接触，以该片段为引物来合成同该核酸模板基本互补的第二核酸链；(d)让一种或多种切割/修复接触步骤(c)的产物，作用在可使这些酶修复产物中的错配碱基的条件下进行。
23．权利要求22的方法，其中，所述方法进一步包括产生来自步骤(d)产物的一群单链模板，并重复步骤(b)-(d)。
24．权利要求23的方法，其中，所述在每一轮中，来自步骤(d)产物的单链模板重复步骤(b)-(d)。
25．权利要求19或22的方法，其中，与所述切割/修复酶的接触在体内进行。
26．权利要求25的方法，其中，与所述切割/修复酶的接触在细菌细胞内进行。
27．权利要求19或22的方法，其中，与切割/修复酶的接触在体外进行。
28．权利要求19或22的方法，其所述的单链核酸模板产自于携带该核酸的M13噬菌体，或用基因Ⅵ外切酶或λ外切酶降解双链核酸模板的一条链，或用链亲合素俘获生物素化的单链核酸，或对RNA进行反转录而获得。
29．权利要求19或22的方法，其中，步骤(b)在每个单链核酸模板使用1-约1000个含不同序列的单链核酸分子或单链核酸片段的条件下进行。
30．权利要求19或22的方法，其中，该方法进一步包括(e)扩增步骤(d)的产物。
31．权利要求19或22中的方法，其中，每一所述的编码序列与一启动子可操作地连接。
32．权利要求31的方法，其中，该方法进一步包括(e)转录步骤(d)的产物以产生一RNA文库。
33．权利要求32的方法，其中，该方法进一步包括(f)翻译该RNA文库以产生蛋白质文库。
34．权利要求32的方法，其中，该方法进一步包括(f)将所述RNA文库中基本上每一成员编码序列的3′端连接上一氨基酸受体分子。
35．权利要求34的方法，其中，该方法进一步包括(g)翻译该RNA文库以产生RNA-蛋白质融合文库。
全文摘要
本发明披露了一种产生核酸文库的方法,该方法包括:(a)产生一群单链核酸模板,每个模板包括一编码序列和一可操作地连接的启动子序列;(b)用同所述单链核酸模板基本互补的单链核酸片段混合物与所述模板群杂交,这些片段短于模板;(c)令步骤(b)的每一种杂交产物同缺乏链置换活性的DNA聚合酶和DNA连接酶相接触,以这些片段为引物合成基本同模板互补的第二条核酸链;和(d)让步骤(c)的产物与RNA聚合酶接触以产生RNA文库,该文库由第二条链转录而成。
文档编号C12P19/34GK1308683SQ99807977
公开日2001年8月15日 申请日期1999年6月29日 优先权日1998年6月29日
发明者R·瓦格纳, M·C·赖特, B·克雷德尔 申请人:菲洛斯公司